李丹 范宇杭 李耕旭 陳新春 孫國華 李世峰

1唐山市人民醫(yī)院兒科（河北 唐山 063001）；華北理工大學(xué) 2公共衛(wèi)生學(xué)院，3臨床醫(yī)學(xué)院（河北 唐山 063210）

哮喘是一種以氣道阻塞為特征的慢性呼吸道疾病，在世界范圍內(nèi)影響大約20%的兒童，低劑量吸入糖皮質(zhì)激素通常能良好的控制哮喘癥狀。但是約5%的哮喘兒童需要大劑量吸入皮質(zhì)類固醇或口服皮質(zhì)類固醇以控制癥狀，或癥狀的發(fā)生持續(xù)和惡化，此類哮喘即為難治性哮喘（therapyresistant asthma）或重型哮喘（severe asthma，SA）［1］。重型哮喘患兒可能導(dǎo)致不良預(yù)后，極大影響患兒的身體和心理發(fā)育，甚至危及患兒生命［2］。然而，重型哮喘通常是由處方用藥劑量和癥狀的控制狀態(tài)來定義的，目前仍沒有較好的重型哮喘診斷標(biāo)準(zhǔn)，且不同重型哮喘患者的臨床表現(xiàn)和對藥物的反應(yīng)存在較大的差異［3］，因此積極探索重型哮喘的發(fā)病機制和診療靶點具有重要的意義。

研究者們認(rèn)為，哮喘的急性發(fā)作與過度炎癥活動有關(guān)，其中CD4+的Th2 細胞及其標(biāo)志性效應(yīng)細胞因子白介素（interleukin，IL）-4、IL-13 水平升高，以及中性粒細胞活化釋放IL-17a 上調(diào)，在成人和兒童哮喘中較早被報道具有明確的致病作用，并導(dǎo)致氣道重塑［4-6］。然而，針對細胞因子阻斷的新藥物療法在臨床反應(yīng)上存在不一致性?？梢?，哮喘可能代表一系列不同的病理生理亞表型［7］。針對哮喘的生物信息學(xué)研究也發(fā)現(xiàn)，輕度哮喘（mild asthma，MA）和重型哮喘患者的轉(zhuǎn)錄組基因集存在較大的差異。為篩選更適于臨床診斷和預(yù)后判定的標(biāo)志物，本研究中筆者從GEO 數(shù)據(jù)庫下載了外周血單個核細胞轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)，通過多重生物信息學(xué)方法，將與重型哮喘有關(guān)的基因集進行系統(tǒng)的評價，篩選出GNA15 基因可能與重型哮喘關(guān)系最為密切。GNA15 基因編碼的Gα15 蛋白最早被報道為造血組織和肺組織特異性表達［8］，GNA15 通過與G 蛋白偶聯(lián)受體（G Protein-Coupled Receptors，GPCRs）相互作用，調(diào)節(jié)細胞對微環(huán)境變化的響應(yīng)和信號傳導(dǎo)，對免疫細胞功能的調(diào)控至關(guān)重要［9］。然而GNA15 在哮喘中的臨床價值尚不清楚。本研究旨在分析GNA15 在重型哮喘中的表達和對重型哮喘預(yù)后的預(yù)測效能，為重型哮喘的臨床診治提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)集獲取和生信分析截止至2019年8月20日，在GEO 數(shù)據(jù)庫［10］里下載哮喘兒童外周血單個核細胞基因芯片數(shù)據(jù)集GSE27011，數(shù)據(jù)集為54例兒童樣本，分為對照組、輕度哮喘組和重型哮喘組。下載Affymetrix 公司GPL6244 平臺的芯片注釋文件。采用R 軟件對基因表達矩陣進行多組間差異分析、表達聚類分析、基因共表達網(wǎng)絡(luò)分析、臨床信息相關(guān)性分析。將重型哮喘組顯著升高的基因群與重型哮喘組相關(guān)性最高的基因模塊取交集，獲得關(guān)鍵基因GNA15。

1.2 病例資料選取2019年9月至2020年12月在唐山市人民醫(yī)院兒科確診為哮喘的兒童為研究對象，其中重型哮喘患兒48 例、輕度哮喘患兒34例，患者均符合《兒童支氣管哮喘診斷與防治指南（2016年版）》［3］診斷標(biāo)準(zhǔn)。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）急性感染性疾??；（2）先天性的心肺疾病、臟器功能不全；（3）其他過敏性疾病；（4）研究期內(nèi)放棄治療；（5）臨床資料不完整；（6）隨訪失訪。選取同時期體檢的健康兒童為對照組30 例。本研究獲得兒童家屬的知情同意，經(jīng)院內(nèi)倫理委員會審核通過。

1.3 治療方法所有患兒入院時均采用吸人糖皮質(zhì)激素（inhaled conicostemid，ICS）結(jié)合短效β2 受體激動劑治療，控制哮喘癥狀［3］。

1.4 肺功能指標(biāo)檢測入院患兒次日清晨測定肺功能，測定前12 h 停止吸人β2 受體激動劑，記錄第1 秒用力呼氣容積占預(yù)計值百分比（FEV1%）和最大呼氣峰流速占預(yù)計值百分比（PEF%）。

1.5 血清炎癥介質(zhì)檢測收集兒童晨起空腹血液樣本4 mL，其中2 mL 置于非抗凝管，4 ℃放置2 h，1 000 r/min 離心15 min，獲得血清。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒檢測兒童血清中IL-4 和L-17A（南京建成生物工程研究所）操作步驟參照試劑盒說明書。

1.6 RT-PCR 檢測兒童外周血GNA15 的表達另外2 mL 血液樣本置于乙二胺四乙酸（Ethylene Diamine Tetraacetic Acid，EDTA）抗凝管，密度梯度離心法分離單個核細胞。采用RT-PCR 檢測兒童外周血單個核細胞GNA15 的表達，總RNA 提取參照TRIzol?（美國Invitrogen 公司）說明書。用第一鏈cDNA 合成試劑盒逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA（北京寶日醫(yī)TaKaRa 生物技術(shù)有限公司）。PCR 體系參照實時熒光定量PCR 檢測試劑盒（美國賽默飛公司）說明書。GNA15-正向引物：5'-CTA CCA GAA CAT CTT CGT GTC CAT-3'；GNA15-反向引物：5'-GCT GAA TCG AGC AGG TGG AA-3'。反應(yīng)條件如下：94 ℃反應(yīng)15 s、55～65 ℃反應(yīng)30 s、72 ℃反應(yīng)30 s。進行40 個循環(huán)，根據(jù)ΔΔCt 法計算GAPDH 與GNA15的相對表達。

1.7 重癥哮喘組患兒隨訪所有住院兒童采用復(fù)查或電話咨詢的方式每個月隨訪1 次，共均隨訪1年，填哮喘控制測試ATC 評分表。將出現(xiàn)過1 次及以上ATC 評分＜20 的患者，記錄為預(yù)后較差，反之為預(yù)后良好。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 22.0 軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料采用均數(shù)± 標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用單因素方差分析，用Levene 法行方差齊性檢驗；計數(shù)資料采用例數(shù)表示，組間采用χ2檢驗；采用多因素二元logistic 回歸分析重型哮喘患兒預(yù)后相關(guān)因素；采用受試者工作特征曲線（ROC）評估血液中GNA15 水平預(yù)測重型哮喘患兒預(yù)后的效能。以P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組兒童基本資料比較對照組、輕度哮喘組和重型哮喘組兒童的性別、年齡、體質(zhì)指數(shù)差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。重型哮喘組母乳喂養(yǎng)水平與對照組和輕度哮喘組兒童均降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。與對照組相比，輕度哮喘組兒童的肺功能指標(biāo)顯著降低，炎癥介質(zhì)IL-4 和IL-17的含量顯著上調(diào)（P＜0.05）；與輕度哮喘組相比，難治哮喘組兒童的FEV1%指標(biāo)顯著降低（P＜0.05），而PEF%、炎癥介質(zhì)IL-4 和IL-17 的含量在輕度哮喘組與難治哮喘組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05。重度哮喘組有15 例兒童出現(xiàn)預(yù)后不良。見表1。

表1 三組兒童基本資料比較Tab.1 General information of subjects in three groups ±s

表1 三組兒童基本資料比較Tab.1 General information of subjects in three groups ±s

注：與對照組相比，*P＜0.05；與輕度哮喘組相比，#P＜0.05

指標(biāo)性別（男/女）年齡（歲）體質(zhì)量指數(shù)（kg/m2）母乳喂養(yǎng)［例（%）］肺功能FEV1%PEF%炎癥介質(zhì)IL-4（ng/L）IL-17（ng/L）ACT＜20 分［例（%）］對照組18/12 8.73±3.19 17.29±3.07 23（76.67）輕度哮喘組21/13 8.73±2.54 17.23±2.25 23（67.65）重度哮喘組30/18 8.90±2.93 17.17±2.82 21（43.75）χ2/F 值4.401 1.462 1.731 0.292 P 值0.111 0.232 0.177 0.008 97.73±7.36 88.56±7.42 76.91±10.96*78.74±12.81*71.04±7.80*#69.71±7.52*52.794 51.567＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001 29.04±5.70 6.13±2.69-41.55±7.10*13.50±4.10*0（0）41.93±8.46*13.61±3.00*15（31.25）71.919 99.715 23.093

2.2 三組兒童血清GNA15 水平的比較與對照組相比，輕度和重度哮喘組兒童外周血GNA15 水平顯著上調(diào)（P＜0.05）；與輕度哮喘組相比，重度哮喘組兒童外周血GNA15 的含量顯著增高（P＜0.05），差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。如圖1。

圖1 三組兒童GNA15 表達水平的比較Fig.1 Comparison of GNA15 expression levels among three groups of children

2.3 重型哮喘患兒預(yù)后的單因素分析與預(yù)后良好組相比，預(yù)后不良組患兒母乳喂養(yǎng)率較低，且外周血中GNA15的含量顯著上調(diào)（P＜0.05）。其他指標(biāo)在兩組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表2。

表2 重型哮喘患兒預(yù)后的單因素分析Tab.2 Univariate analysis of prognosis in SA children with different prognosis ±s

表2 重型哮喘患兒預(yù)后的單因素分析Tab.2 Univariate analysis of prognosis in SA children with different prognosis ±s

因素性別（男/女）年齡（歲）體質(zhì)指數(shù)（kg/m2）母乳喂養(yǎng)［例（%）］FEV1%PEF%IL-4 IL-17 GNA15預(yù)后良好組19/14 9.36±2.96 17.40±3.04 17（51.51）71.30±7.40 70.80±7.16 40.59±8.42 13.27±2.75 3.03±0.70預(yù)后不良組11/4 7.87±2.70 16.28±2.28 3（20.00）70.40±8.85 67.30±7.99 44.87±8.07 14.37±3.50 4.03±0.93 t/χ2值1.093 1.670 0.685 4.214 0.381 1.494 1.656 1.179 4.161 P 值0.296 0.102 0.497 0.040 0.705 0.142 30.105 0.245＜0.001

2.4 重型哮喘患兒預(yù)后相關(guān)因素的logistic 回歸分析將單因素分析中差異有統(tǒng)計學(xué)意義的因素納入二分類logistic 回歸分析，GNA15 是預(yù)后不良的危險因素（OR=5.117，P＜0.05）。見表3。

表3 重型哮喘患兒預(yù)后相關(guān)因素的多因素Logistic 回歸分析Tab.3 Multivariate Logistic regression analysis of prognostic factors in SA children

2.5 血液中GNA15 水平預(yù)測重型哮喘患兒預(yù)后的效能ROC 曲線分析顯示，GNA15 預(yù)測兒童重型哮喘的曲線下面積（AUC）為0.820，靈敏度為0.733，特異性為0.879（P＜0.05），見圖2。

圖2 血液GNA15 預(yù)測重型哮喘兒童預(yù)后的ROC 曲線圖Fig.2 ROC curve of blood GNA15 predicting prognosis in children with SA

3 討論

哮喘是一種氣道異質(zhì)炎癥性疾病，GPCRs 在哮喘病理生理學(xué)中發(fā)揮著重要作用，這一點從臨床上GPCRs 靶向藥物的廣泛應(yīng)用和臨床開發(fā)中GPCRs 靶向藥物候選藥物的數(shù)量上得到了證實，如β2-腎上腺素能受體、毒蕈堿乙酰膽堿受體、白三烯和PG 受體、趨化因子受體和腺苷受體激動劑等［11］。雖然目前的哮喘治療方法對大多數(shù)哮喘患者有效，但仍有大量哮喘患者控制不良，可能出現(xiàn)哮喘加重。這與哮喘內(nèi)源性致病因素多樣化和其復(fù)雜的生理機制有關(guān)。在兒童重型哮喘中，免疫細胞成分存在較大的變異性，有學(xué)者認(rèn)為，重型哮喘患兒不同的炎癥譜背后的機制可能是復(fù)雜、多樣的，并與皮質(zhì)類固醇敏感性有關(guān)［12］。隊列研究顯示，炎癥細胞表型是區(qū)分輕度哮喘和重型哮喘的重要標(biāo)準(zhǔn)之一［13］，本研究通過對外周血單個核細胞基因表達聚類分析，并通過加權(quán)基因共表達網(wǎng)絡(luò)分析建立了與重型哮喘表型關(guān)聯(lián)最密切的基因模塊，最終獲得了關(guān)鍵基因GNA15，即該基因符合在重型哮喘患兒中特異性高表達的特點，也與重型哮喘具有相關(guān)性。

GNA15 編碼的Gα15 蛋白的表達水平受限，主要局限于造血細胞。關(guān)于GNA15 的研究國內(nèi)外文獻報道僅30 余篇，近期在多種疾病臨床樣本的生物信息學(xué)分析的關(guān)鍵基因中發(fā)現(xiàn)存在GNA15，可見GNA15 對人類健康的重要作用［14-15］，然而GNA15 的作用機制和相關(guān)的臨床驗證數(shù)據(jù)較少。本研究首次在哮喘患兒外周血中驗證了GNA15 表達上調(diào)，并初步分析證實了GNA15 具有一定的預(yù)測重癥哮喘患兒預(yù)后的效能。有研究［16］顯示，GNA15 與免疫調(diào)控關(guān)系密切，Gα15 的活化可逃逸β-抑制素（β-arrestin）的監(jiān)控，可以通過競爭性結(jié)合GPCRs 激活Ca2+信號，其基因缺失顯著降低了巨噬細胞中補體C5a 誘導(dǎo)的Ca2+釋放［17］。在肥大細胞中，Ca2+貯存量降低可改變線粒體膜電位，引起細胞脫顆粒，并促進哮喘［18］。急性髓細胞白血病（acute myeloid leukemia，AML）中研究顯示，GNA15 在CD34+造血干細胞中上調(diào)，隨著細胞成熟而降低［19］，GNA15 在胰腺導(dǎo)管腺癌［20］、肝癌［21］、和食管鱗狀細胞癌［22］以及I 型糖尿病、膿毒病中表達升高，與患者總體生存期較差相關(guān)。這與Gα15 調(diào)節(jié)細胞外信號調(diào)節(jié)激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）、核因子（nuclear factor，NF）-κB等信號活化，促進細胞增殖并抑制細胞凋亡有關(guān)［19］。Gα15 效應(yīng)物可靶向ras、p53 等基因，調(diào)控細胞活性。本研究也發(fā)現(xiàn)GNA15 與患兒FEV1%、PEF%負相關(guān)，然而，GNA15 是否可調(diào)控氣道重構(gòu)，以及GNA15 高表達患兒糖皮質(zhì)激素敏感性降低的原因仍需要更多的基礎(chǔ)和臨床研究探索。