史聰穎 周海洋 魏偉 黃婉君 王頎 張復(fù)華

1廣東省臍帶血造血干細(xì)胞庫（廣州 510663）；2廣州市天河諾亞生物工程有限公司（廣州 510663）；3廣東省婦幼保健院（廣州 523146）；4華南理工大學(xué)附屬第六醫(yī)院佛山市南海區(qū)人民醫(yī)院血液腫瘤科（廣東 佛山 528200）

臍血富含多種干細(xì)胞與營養(yǎng)物質(zhì)，包括造血干細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞、內(nèi)皮祖細(xì)胞、非限制性體細(xì)胞和非常小胚胎/外胚層樣干細(xì)胞等［1-2］。由于臍血來源廣泛，并具有特有的免疫學(xué)特性，因此，其作為新的造血干細(xì)胞移植的供源具有極大的優(yōu)勢和潛力。目前臍血造血干細(xì)胞移植已逐漸成為血液學(xué)專家的共識，臍血也越來越多地應(yīng)用于兒童和成人血液病的治療。除臍血造血干細(xì)胞移植外，目前臨床還存在另一種臍血的輸注應(yīng)用治療方案，即把臍血作為輔助，在外周血造血干細(xì)胞移植完成后再輸注到患者體內(nèi)。該方法將臍血視為一種營養(yǎng)物質(zhì)，通過臍血中的細(xì)胞因子或臍血中單個核細(xì)胞的旁分泌作用改善外周血造血干細(xì)胞移植的預(yù)后癥狀［3-4］。

廣東省臍帶血造血干細(xì)胞庫（以下簡稱廣東省臍血庫）是經(jīng)我國衛(wèi)生健康委員會批準(zhǔn)成立的，隸屬于廣東省婦幼保健院。本研究對廣東省臍血庫2007-2020年臍血臨床應(yīng)用數(shù)據(jù)進(jìn)行了分析報告。

1 資料與方法

1.1 一般資料臍血來自廣東省內(nèi)二甲以上醫(yī)院，采集前產(chǎn)婦均已簽署臍血采集知情同意書，填寫產(chǎn)前化驗檢查結(jié)果、健康調(diào)查表，以記錄產(chǎn)婦本人及家屬的家族病史和遺傳病史。所有產(chǎn)婦產(chǎn)前經(jīng)查乙肝表面抗原、丙肝抗體、梅毒抗體、艾滋病抗體均為陰性，地中海貧血及6-磷酸葡萄糖脫氫酶（G-6-PD）缺乏癥均為正常。臍血采集于采血袋中，通過相同的運(yùn)輸條件送回廣東省臍血庫［5］。剔除缺項數(shù)據(jù)資料后，最終篩選整理2007～2020年廣東省臍血庫出庫的2 132 例臍血應(yīng)用資料，這些臍血在應(yīng)用醫(yī)院被用于各類疾病治療，其中公共庫應(yīng)用1 815 例，自體庫應(yīng)用317 例。

1.2 試劑與儀器臍血采血袋（山東威高集團(tuán)，含28 mL 血液保存液），6%羥乙基淀粉（HESPAN?，B.BRAUN 公司），甲基纖維素培養(yǎng)基（StemCell 公司），RPMI-1640 培養(yǎng)基（GIBCO），單抗CD45-FITC、單抗CD34-PE、IgG1-PE、7-AAD 和1%溶血素均購自BD 公司，計數(shù)相關(guān)試劑均購自Sysmex 公司。醫(yī)用低溫離心機(jī)（RC 3BP+，Thermo Scientific公司），自動血液分析儀（XE-5000，Sysmex 公司），熱合機(jī)（SE250 型，韓國森通），超凈工作臺（SW-CJ-2FD，蘇凈安泰空氣技術(shù)有限公司），CO2培養(yǎng)箱（FORMA 公司），倒置顯微鏡（CK40 和CKX41，OLYMPUS 公司），流式細(xì)胞儀（FACSCalibur，BD 公司）。

1.3 檢測指標(biāo)

1.3.1 凍前總有核細(xì)胞計數(shù)（total nucleated cell，TNC）計數(shù)濃縮后臍血有核細(xì)胞的濃度，根據(jù)濃縮血量與有核細(xì)胞的濃度乘積計算凍前有核細(xì)胞總數(shù)。

1.3.2 CD34+細(xì)胞含量及有核細(xì)胞活性干細(xì)胞培養(yǎng)室取樣后的剩余血樣作為待檢樣本。使用單抗CD45-FITC、IgG1-PE（CD34-PE 陰性對照）、單抗CD34-PE 及7-AAD 對樣本進(jìn)行標(biāo)記［6］。流式細(xì)胞儀檢測已標(biāo)記好的樣本，根據(jù)ISHAGE 標(biāo)準(zhǔn)［7］，利用CD45、CD34 單克隆抗體（CD45 是有核細(xì)胞的特異性標(biāo)志物，CD34 是造血干祖細(xì)胞的特異性標(biāo)志物）來對臍血進(jìn)行檢測。根據(jù)造血干祖細(xì)胞的4個特征（CD34 陽性，CD45 弱陽性，低SSC，F(xiàn)SC 與淋巴細(xì)胞相似）圈選出造血干祖細(xì)胞占有核細(xì)胞的含量，即得到CD34+細(xì)胞含量。根據(jù)7-AAD 可使死細(xì)胞染色的原理來檢測臍血中活細(xì)胞占有核細(xì)胞的含量，即有核細(xì)胞活性。

1.3.3 患者輸注細(xì)胞數(shù)計算每公斤體質(zhì)量輸注的細(xì)胞數(shù)量，根據(jù)TNC 和患者體質(zhì)量（kg）的除商計算患者輸注細(xì)胞數(shù)，單位為107/kg。

1.3.4 粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落形成單位（colony forming unit-granulocyte and macrophage，CFUGM）計數(shù)根據(jù)標(biāo)本細(xì)胞懸液濃度及最終培養(yǎng)體系為3.3 mL，結(jié)合計算所需加入的甲基纖維素培養(yǎng)基及細(xì)胞懸液的各自體積，制成有核細(xì)胞終濃度定量為5×104/mL 的培養(yǎng)體系。將培養(yǎng)體系平均加入6孔培養(yǎng)板的3個孔中，保證每孔都有1 mL。將培養(yǎng)板放入37 ℃、5% CO2、濕度＞95%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)14 d。培養(yǎng)結(jié)束取出培養(yǎng)板在倒置顯微鏡下觀察，統(tǒng)計每份臍血培養(yǎng)的3 個孔的集落數(shù)，取其均值作為該份臍血的CFU-GM 細(xì)胞計數(shù)結(jié)果。

1.4 方法研究采用回顧性分析方法對這2 132例臍血應(yīng)用的疾病類型、臍血相關(guān)質(zhì)量指標(biāo)（TNC、CD34+細(xì)胞含量、患者輸注細(xì)胞數(shù)、臍血凍存年限、患者與匹配的臍血HLA 相合位點(diǎn)數(shù)、CFU-GM［5］）以及應(yīng)用后的效果：如植入情況（成功/失?。⒌?00 天總生存率、半年總生存率、1年總生存率、2年總生存率等信息進(jìn)行統(tǒng)計分析。臍血經(jīng)程控降溫后，長期保存在-150 ℃以下的氣相液氮管MVE 不銹鋼液氮罐中（CHART，USA）。TNC 利用自動血液分析儀sysmex XE-5000 中提取的白細(xì)胞（WBC）計算的。HLA 配對情況為采用PCR 法檢測的低分辨分型配對的數(shù)據(jù)。所有出庫應(yīng)用的臍血均進(jìn)行乙肝表面抗原（HBsAg）、丙肝抗體（HCV-Ab）、梅毒抗體（TP-Ab）、艾滋病抗體（HIV-Ab）和細(xì)菌霉菌檢測且結(jié)果為陰性，地中海貧血及6-磷酸葡萄糖脫氫酶（G-6-PD）缺乏癥檢測均為正常。對臍血的臨床應(yīng)用分為兩大類：臨床應(yīng)用類和科研類。根據(jù)《臍帶血造血干細(xì)胞治療技術(shù)管理規(guī)范（試行）》對臍血臨床應(yīng)用大類治療的疾病分為四類：惡性血液疾病、非惡性血液疾病、免疫缺陷疾病、代謝性疾病。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法根據(jù)所收集的臍血應(yīng)用信息，建立統(tǒng)計學(xué)量化表格，應(yīng)用SPSS 18.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，應(yīng)用Graphpad Prism 8 軟件繪制總生存曲線圖。對分類變量地區(qū)、性別、治療類型、HLA配對情況和總生存情況進(jìn)行賦值，分類與賦值排序無關(guān)。計量數(shù)據(jù)的檢測結(jié)果以M（P25，P75）表示，行非參數(shù)檢驗；計數(shù)資料以例（%）表示，比較行χ2檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 廣東省臍血庫公共庫臍血的臨床應(yīng)用情況2007-2020年廣東省臍血庫公共庫臍血的臨床應(yīng)用情況及相關(guān)質(zhì)量指標(biāo)見表1，公共庫臨床應(yīng)用臍血1 815例，其中用于治療惡性血液疾病1 024例（56.4%），非惡性血液病560 例（30.9%），免疫缺陷病82 例（4.5%），代謝性疾病56 例（3.1%），科研類應(yīng)用93 例（5.1%）。不同臨床應(yīng)用分類的應(yīng)用地區(qū)、性別、年齡、TNC、輸注細(xì)胞數(shù)、治療類型和HLA 配型情況差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。華南、華東、華北的應(yīng)用數(shù)量明顯高于華中、東北、西北、西南地區(qū)，華南非惡性血液病和惡性血液病的臍血應(yīng)用明顯高于其它地區(qū)。受臍血治療的男性顯著多于女性。代謝性疾病和免疫缺陷病的患病年齡顯著低于其他疾病，用于移植治療的數(shù)量顯著高于其他疾病分類，6/6 配型的HLA 配型情況顯著高于其他疾病，輸注細(xì)胞數(shù)顯著高于其他疾病。

表1 廣東省臍血庫的臍血應(yīng)用情況（n=1815）Tab.1 Application characteristics of Guangdong public UCB bank samples 例（%）

對廣東省臍血庫公共庫出庫的臨床應(yīng)用類臍血的應(yīng)用數(shù)據(jù)與隨訪的總生存率的分析見表2。數(shù)據(jù)結(jié)果顯示，不同生存率與植入情況之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.01），臍血植入成功顯著提高生存率。2年總生存率與疾病分類、治療類型和植入情況之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.01），非惡性血液病的生存率最高，惡性血液病次之，代謝性疾病再次，免疫缺陷病最低；輸注輔助治療的生存率比移植治療高。

表2 臍血臨床應(yīng)用情況與總生存期的單因素分析Tab.2 ANOVAanalysis of overall survival and characteristics of clinical therapeutic cord blood samples

2.2 廣東省臍血庫公共庫臍血應(yīng)用總生存曲線選取廣東省臍血庫公共庫應(yīng)用的臍血中2年隨訪數(shù)據(jù)完整的數(shù)據(jù)進(jìn)行總生存率分析并輸出總生存曲線圖（圖1）。數(shù)據(jù)顯示，非惡性血液病的2年總生存率為83%，惡性血液病為71%，代謝性疾病為66.7%，免疫缺陷病為69.8%。

圖1 廣東省臍血庫臍血治療的生存曲線Fig.1 Survival rates of therapy of Guangdong UCB bank samples

2.3 廣東省臍血庫自體庫臍血臨床應(yīng)用情況廣東省臍血庫自體庫臍血應(yīng)用包含自存自用、自存后同胞間使用以及自存后直系親屬使用三類。2007-2020年廣東省臍血庫自體庫臍血出庫應(yīng)用于惡性血液病6 例，非惡性血液病170 例，免疫缺陷病2 例，糖尿病13 例，神經(jīng)母細(xì)胞瘤2 例，再生醫(yī)學(xué)方向124 例，見表3。

表3 廣東省臍血庫自體臍血應(yīng)用情況（n=317）Tab.3 Application data of Guangdong private UCB bankM（P25，P75）

3 討論

本研究數(shù)據(jù)資料顯示，血液病的治療（87.3%）仍然是目前臍血應(yīng)用的主要方向，且主要治療方式是臍血移植。而異基因臍血用于治療代謝性疾病和免疫缺陷的病例較少；由于相關(guān)管理辦法，異基因臍血及相關(guān)成分目前也較少應(yīng)用于臨床科研研究。近年來隨著對臍血應(yīng)用的研究加深，臍血除了作為移植用的醫(yī)療資源，也可用以輸注作為輔助治療資源，通過拓寬適應(yīng)證的途徑提高臍血治療應(yīng)用的效率。LI 等［8］的研究就開發(fā)出了一種利用異基因臍血作為補(bǔ)充移植的外周血造血干細(xì)胞移植技術(shù)治療重癥地中海貧血和白血?。?］。本研究顯示惡性血液病的臍血治療中有73.5%臍血移植，26.5%是臍血輸注，而非惡性血液病的臍血治療的相應(yīng)比例為63.8%和36.3%，證明了臍血不僅可用于移植治療血液病，更可作為輔助補(bǔ)充的營養(yǎng)細(xì)胞協(xié)助外周血造血干細(xì)胞移植和骨髓造血干細(xì)胞移植，具有極高的應(yīng)用價值。對于科研類臍血應(yīng)用，82.6%的臍血用于輸注輔助治療疾病，這些臍血都根據(jù)臨床試驗路徑開展研究。一項臨床研究表明，異基因臍血的輸注對缺血性中風(fēng)患者沒有嚴(yán)重的不良反應(yīng)，同時可以改善患者的神經(jīng)和運(yùn)動功能［9］?？蒲蓄惸氀獞?yīng)用目前已用于再生醫(yī)療、糖尿病、腦性癱瘓、亞健康、外陰癌、肺癌、靜脈栓塞、老年癡呆、退行性病變、睡眠呼吸障礙、炎癥性腸病等11 個病種，研究的開展將有望擴(kuò)大臍血治療的臨床適應(yīng)癥，提高臍血的治療應(yīng)用范圍。臍血中富含的各類干細(xì)胞已逐漸被醫(yī)生認(rèn)識和并嘗試應(yīng)用于臨床研究以期治療各類難治性疾病，這可歸因于臍血未經(jīng)任何化學(xué)處理，安全可控，同時臍血中豐富的干細(xì)胞的旁分泌效應(yīng)也使疾病的治療獲益。

除了異基因臍血的應(yīng)用外，自體臍血也被用于臨床治療研究［10］。對于臍血庫自體庫應(yīng)用情況，非惡性血液病的治療是目前自體臍血臨床應(yīng)用的主要方向。由于廣東省是重型β 地中海貧血的高發(fā)地區(qū)，自體臍血亦被廣泛用于同胞間使用以治療重型β 地中海貧血。此外，自體臍血也開始用于部分白血病和重型再障的治療，其中白血病治療共6 例，2 例為同胞間使用，4 例為直系親屬使用；再生障礙性貧血共12 例，9 例為自存自用，3例為同胞間使用。近年來，由于自體臍血輸注的安全性和有效性，自體臍血應(yīng)用治療腦癱逐漸成為了臨床應(yīng)用研究的熱門［11-12］。SUN 等［13］進(jìn)行了一項用自體臍血治療63 名腦癱兒童的研究，結(jié)果顯示自體臍血治療小兒腦性癱瘓是安全的，且能改善患兒的運(yùn)動功能。DAWSON 等［14］也開展了一項使用自體臍血治療自閉癥兒童的臨床試驗，表明自體臍血輸注對自閉癥兒童是安全有效的，并且對自閉癥患兒在社交方面的行為有顯著的改善。廣東省臍血庫亦聯(lián)合廣東省婦幼保健院、深圳市兒童醫(yī)院、中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院合作開展了自體臍血應(yīng)用治療腦癱腦損傷的項目，并取得了一定的效果。廣東省臍血庫與廣東省婦幼保健院合作開展了早產(chǎn)兒自體臍血輸注的安全性研究，并做了10年長期隨訪驗證其安全性，通過進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)自體臍血輸注在預(yù)防和改善早產(chǎn)兒并發(fā)癥，如支氣管肺發(fā)育不良方面［15-16］有重要作用，能有效減少呼吸支持持續(xù)時間。有Ⅰ期臨床研究發(fā)現(xiàn)，自體臍血輸注治療兒童感音神經(jīng)性聽力損失是安全且可行的［17］。自體臍血的治療應(yīng)用拓展，也將為異基因臍血治療應(yīng)用范圍的擴(kuò)展奠定基礎(chǔ)。

本研究數(shù)據(jù)顯示，應(yīng)用于不同疾病類型的臍血，其平均輸注細(xì)胞數(shù)均高于《造血干細(xì)胞移植技術(shù)管理規(guī)范（2017年版）》臍血輸注細(xì)胞數(shù)≥2×107/kg的要求，總生存期與TNC、TNC/kg、CD34+細(xì)胞數(shù)、患者年齡、患者體重和低溫保存時間無關(guān)，結(jié)果表明隨著臨床技術(shù)的發(fā)展，經(jīng)篩選可使用于臨床的臍血質(zhì)量優(yōu)質(zhì)，其治療應(yīng)用可不再局限于小孩，亦能適用于成年人疾病的治療，且TNC、輸注細(xì)胞數(shù)均已能達(dá)到較高水平，然更多的TNC 和輸注細(xì)胞數(shù)并沒有明顯提高患者第1、2年的總生存率。而總生存時間與臍血的植入率（91.2%）之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），說明植入率仍是影響總生存時間的主要因素。臍血移植后的移植物抗宿主病（graft versus host disease，GVHD）的程度是影響移植后的總生存率的重要因素之一，有研究表明GVHD 的程度與高分辨HLA 配對情況有相關(guān)性［18-19］，目前臨床也已不再局限于該6 個位點(diǎn)的低分辨分型，越來越多的醫(yī)院均已要求提供臍血的高分辨分型，包括HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLADRB、HLA-DQB、HLA-DPB 和KIR［20］。然而本數(shù)據(jù)顯示HLA 配對的情況與總生存率差異無統(tǒng)計學(xué)意義，可能與錄入的低分辨HLA-A，HLA-B 和HLADRB 配對位點(diǎn)數(shù)據(jù)不足以分析其與總生存率的關(guān)系有關(guān)。目前臨床醫(yī)生對臍血造血干細(xì)胞移植應(yīng)用的主要顧慮在于，臍血的細(xì)胞量可能僅供小兒患者使用且僅能移植應(yīng)用一次。本研究數(shù)據(jù)顯示，接受臍血造血干細(xì)胞移植的非惡性血液病患者年齡中位數(shù)為11 歲，惡性血液病患者年齡中位數(shù)為17 歲，最大接受治療的年齡為79 歲，這一數(shù)據(jù)說明，只要臨床指標(biāo)合適，臍血造血干細(xì)胞移植適用于各種年齡段。誠然外周血造血干細(xì)胞與臍血造血干細(xì)胞的應(yīng)用各有優(yōu)缺點(diǎn)，但臍血造血干細(xì)胞確實(shí)為有需要的患者提供了更多的可能。

本研究具有一定的局限性，后續(xù)進(jìn)一步的研究方向可從增加移植后白細(xì)胞植入時間、血小板植入時間、GVHD 發(fā)生等級數(shù)據(jù)、HLA 高分辨配型情況等方面著手，進(jìn)一步完善數(shù)據(jù)，利用大數(shù)據(jù)深入分析其中的差異，為臍血的臨床應(yīng)用提出有意義臍血選擇方案。相信隨著臍血在臨床應(yīng)用方面研究的深入，臍血的臨床應(yīng)用將更加廣泛，為患者提供更多的治療選擇。