張 鋒, 阿茹拉, 李 斌

(東北林業(yè)大學(xué) 化學(xué)化工與資源利用學(xué)院， 黑龍江 哈爾濱 150040)

0 引言

鄰苯二酚(C6H6O2)作為重要化工原料用于合成農(nóng)藥、化妝品、染料、涂料穩(wěn)定劑等，在諸多領(lǐng)域有著非常重要的應(yīng)用[1,2].但同時，鄰苯二酚會不可避免地釋放到環(huán)境中，成為工業(yè)廢水中一種環(huán)境污染物.而存在于廢水中的鄰苯二酚不易降解、很難去除，污染生態(tài)環(huán)境，對人類身體健康造成危害，即使超低濃度的鄰苯二酚也會致癌，世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機構(gòu)將其歸為2B類致癌物[3].正由于鄰苯二酚對生態(tài)環(huán)境和人類身體的危害受到廣泛關(guān)注，建立廢水中靈敏準(zhǔn)確的檢測方法顯得尤為重要.當(dāng)前常用檢測鄰苯二酚的方法有紫外分光光度法[4]、色譜法[5]、熒光分析法[6]和電化學(xué)法[7]等.與其他方法相比，電化學(xué)法具有響應(yīng)速度快、靈敏度高、耗費少及易實現(xiàn)在線監(jiān)測等優(yōu)點而受到廣泛關(guān)注[8].

漆酶是一種具有較高催化還原活性的多銅氧化酶，但漆酶的活性中心包裹著不導(dǎo)電的肽鏈，直接利用其開發(fā)酶電極難以實現(xiàn)酶與電極之間的電子轉(zhuǎn)移.引入電子介體是實現(xiàn)酶-電極間電子遷移的有效方法，但是引入介體會降低電池能量輸出，從而造成酶電極的使用穩(wěn)定性較差[9,10].近年來，開發(fā)具有良好導(dǎo)電能力的納米材料作為漆酶固定載體，已成為開發(fā)漆酶電化學(xué)傳感器的首選方案.介孔碳材料(孔徑2～50 nm)具有較大比表面積和孔容、可調(diào)節(jié)且規(guī)則有序的孔道結(jié)構(gòu)，優(yōu)異的力學(xué)性能、化學(xué)穩(wěn)定性和生物相容性，使其成為優(yōu)良的酶固定載體[11].此外有序介孔碳良好的導(dǎo)電性和納米尺寸效應(yīng)，使其表面原子具有很高的反應(yīng)活性，表面活性基團如羥基、羧基等可深入還原酶活性中心附近，為電子傳遞提供高效的納米通道[12].因此，有序介孔碳作為酶固定載體為漆酶生物傳感器的開發(fā)和應(yīng)用提供了前所未有的機遇.

高濃度纖維素納米晶(NCC)水溶液能自組裝形成具有左旋手性的膽甾相液晶，隨著溶劑的緩慢蒸發(fā)其手性向列型結(jié)構(gòu)可以保持并形成具有長距手性向列型特征的薄膜[13].利用這一特性，Kevin E.Shopsowitz等[14]以NCC為模板，正硅酸甲酯為硅源前驅(qū)體調(diào)控制備了手性向列型介孔碳，但該介孔碳材料在酶生物傳感器的開發(fā)應(yīng)用領(lǐng)域卻鮮有報道.本文以手性向列型介孔碳為載體，通過物理吸附固定了漆酶，制備了漆酶電極，研究了漆酶生物傳感器對鄰苯二酚的直接電化學(xué)行為和催化氧化還原性能，成功應(yīng)用于鄰苯二酚的定量檢測.與其他方法相比，該漆酶傳感器具有較高的靈敏度，較低的檢測限和很好的抗干擾能力.

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

1.1.1 主要試劑

漆酶(EC1.10.3.2，600 U/g),江蘇銳陽生物科技有限公司；鄰苯二酚標(biāo)準(zhǔn)溶液(1 000μg/mL)，2,2'-聯(lián)氮雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽(ABTS，98%)，聚二烯二甲基氯化銨(PDDA，20 %)，Aladdin生化科技有限公司；濃硫酸(98%，優(yōu)級純)，科密歐試劑公司；Na2HPO4、NaH2PO4、正硅酸甲酯、氫氧化鈉、檸檬酸等均為分析純，國藥試劑有限公司；巴西鸚鵡牌桉木漿,牡丹江恒豐紙業(yè)有限公司.

1.1.2 主要儀器

全自動比表面和孔隙度分析儀(BELSORP-miniII)，麥奇克拜爾有限公司；掃描電鏡(EM-30 plus)，韓國庫塞姆公司；紫外分光光譜儀(Lambda 750)，美國Perkin Elmer公司；電化學(xué)工作站(AUTOLAB)，瑞士萬通公司；氣氛管式爐(TCGC-1200)，上海仝科電爐設(shè)備有限公司.

1.2 手性向列型介孔碳的制備與表征

采用濃硫酸酸解的方法制備NCC[15].將30 g桉木漿加入到300 mL 64 wt%硫酸中，50 ℃水浴下機械攪拌1 h，加入10倍冷去離子水(4 ℃)終止酸解反應(yīng).稀釋后的懸浮液反復(fù)離心洗滌，將乳白色膠體轉(zhuǎn)移至透析袋透析至中性，最后將NCC分散液稀釋至濃度為2.4 wt%.取超聲分散后的NCC 20 mL，在機械攪拌下緩慢滴加適量正硅酸甲酯，60 ℃下攪拌3 h.混合液冷卻至室溫后，倒入Φ60 mm聚苯乙烯培養(yǎng)皿中，自然通風(fēng)揮發(fā)48 h，形成NCC-SiO2復(fù)合薄膜.將復(fù)合膜剪成1 cm寬碎片，在N2保護900 ℃下煅燒6 h.使用2 M NaOH溶液將煅燒后的復(fù)合碳材料在90 ℃下堿蝕4 h去除SiO2，過濾，分別用去離子水、乙醇洗滌，105 ℃干燥至恒重，得手性介孔碳.手性向列型介孔碳的制備流程如圖1所示.以NCC-SiO2復(fù)合膜中NCC的不同含量100%、75%、65%和55%，將所得手性介孔碳命名為CNMC-1、CNMC-2、CNMC-3和CNMC-4.

圖1 介孔碳制備流程

N2等溫吸附脫附測試：準(zhǔn)確稱取一定質(zhì)量樣品，使用BelSorp-Mini型全自動比表面及孔隙度分析儀繪制吸附等溫曲線，采用BET法分析手性介孔碳的比表面積、孔徑分布和孔容大小.

介孔碳形貌觀察：將介孔碳橫斷面噴金，用SEM觀察拍照，加速電壓20.0 kV.

1.3 介孔碳固定化漆酶及酶活穩(wěn)定性評價

取200 mg介孔碳粉末加入到濃硫酸與濃硝酸混合液(3∶1，v/v)中,超聲分散10 min后，繼續(xù)在室溫下磁力攪拌18 h，使用0.22μm微孔濾膜抽濾，去離子水洗滌至弱酸性，最后在60 ℃下真空干燥，得酸化介孔碳.取40 mg酸化介孔碳粉末，加入40 mL 漆酶溶液(1 mg/mL)，在4 ℃循環(huán)水浴下攪拌24 h,保證酶充分吸附固載于介孔碳材料上，離心分離，除去上層清液得有序介孔碳固定化漆酶.

采用ABTS為底物評價固定化漆酶和游離漆酶活性[16].將適量固定化漆酶或游離漆酶加入到含有1 mM ABTS 底物的磷酸鹽緩沖溶液中，控制總體積為3 mL,反應(yīng)時間5 min,使用分光光度法監(jiān)測反應(yīng)后氧化產(chǎn)物ABTS+(ε420=36 000 L mo-1cm-1)在420 nm下的吸光度變化，根據(jù)式(1)計算酶活力.

(1)

式(1)中：△A為反應(yīng)前后420 nm下吸光度變化值；V為反應(yīng)溶液總體積,L；t為反應(yīng)時間；n為ABTS物質(zhì)的量,mol；m為固定化酶或游離酶質(zhì)量，mg.酶活力(1U)定義為每分鐘催化氧化1μmol反應(yīng)底物所需酶量.

使用含有ABTS 底物的磷酸鹽緩沖溶液，分別在不同pH(pH 3.0～8.0)和不同溫度(20 ℃～80 ℃)下測定固定化酶和游離酶的活力，評價固定化酶和游離酶的pH和溫度穩(wěn)定性.將同一批次實驗中的最高活性值定義為100%，其余活性為最高活性的相對比值.

1.4 漆酶電極制備及電化學(xué)測試

稱取5 mg固定化漆酶，加入少量水和50μL Nafion溶液，在150 w功率下超聲分散.將Au電極打磨，去離子水反復(fù)清洗后，放置于pH 7.0的磷酸鹽緩沖溶液中進行循環(huán)伏安活化.Au電極活化后放置于20 wt%的PDDA溶液中浸泡30 min，去離子水沖洗.取10μL固定化酶分散液滴在Au電極，靜置1.5 h形成薄膜，去離子水洗去多余殘渣，得漆酶生物傳感電極，命名為CNMC/Lac/Au電極.

電化學(xué)測試采用三電極體系，Au電極(漆酶傳感電極)為工作電極，Pt電極為對電極，飽和甘汞電極為參比電極.設(shè)定電壓為-0.3～0.6 V，掃描速度為0.05 V/S進行循環(huán)伏安測試.使用最高電壓值測定不同濃度鄰苯二酚溶液以獲得時間-電流響應(yīng)圖.

2 結(jié)果與討論

2.1 手性向列型介孔碳的表征

通過N2等溫吸附-脫附法分析手性介孔碳的孔隙度，不同NCC-SiO2復(fù)合膜熱解所得介孔碳等溫吸附曲線如圖2所示，獲得比表面積及空隙數(shù)據(jù)列于表1.未添加正硅酸甲酯前驅(qū)體的NCC薄膜熱解后生成微孔碳(CNMC-1)，等溫吸附脫附曲線屬于典型的第Ⅰ類吸附等溫線，在低壓力區(qū)域(p/p0<0.1)吸附量快速增長，微孔吸附充滿后達到飽和平臺.添加硅源前驅(qū)體的NCC薄膜熱解后形成的碳材料(CNMC-2,3,4)，吸附等溫線表現(xiàn)為典型的第Ⅳ類吸附等溫線，在中高壓力區(qū)域(0.4

圖2 手性向列型介孔碳N2等溫吸附曲線

如表1所示，當(dāng)NCC占NCC-SiO2復(fù)合膜質(zhì)量比為65%時，所得介孔碳材料(CNMC-3)BET比表面積高達449 m2g-1，孔體積為0.51 cm3g-1，平均孔徑5.43 nm.而NCC與正硅酸甲酯前驅(qū)體的比例降低或者升高，所得碳材料(CNMC-2,4)的比表面積、孔體積和平均孔徑均呈下降趨勢.適量硅源的引入可以使碳材料形成中孔，硅源過少，碳材料形成的微孔比例較大，而過量硅源會形成較厚的硅層，在復(fù)合薄膜熱解過程中阻止了介孔碳區(qū)域的形成[17].CNMC-3碳材料微孔比表面積11 m2g-1，相對于449 m2g-1的總比表面積，微孔占比很小，反映出NCC在碳化前已形成高度有序的微觀結(jié)構(gòu).

表1 不同介孔碳樣品N2吸附數(shù)據(jù)

介孔碳(CNMC-3)的SEM圖片證實其手性向列型微觀結(jié)構(gòu)，如圖3所示.手性介孔碳具有光滑的表面(如圖3(a)所示)，但斷面SEM照片(如圖3(b)、(c)所示)顯示介孔碳具有垂直于表面的層狀結(jié)構(gòu)，層級界限依稀可見.在高放大倍數(shù)下(如圖3(d)所示)可觀察到介孔碳材料保持著NCC的棒狀形態(tài)，且以逆時針旋轉(zhuǎn)方向堆積，基本保持著NCC模板的左旋手性向列相結(jié)構(gòu)[15,17].因此，加入正硅酸甲酯前驅(qū)體在碳材料中引入中孔的作用之外，還協(xié)助NCC薄膜在高溫碳化過程中保持長程手性向列相微觀結(jié)構(gòu).

(a)介孔碳電子照片 (b)、(c)、(d)分別為介孔碳橫斷面×1 200、×2 400、×9 400放大倍數(shù)SEM照片圖3 介孔碳(CNM-3)的電子照片和斷面SEM照片

2.2 固定化漆酶pH和溫度穩(wěn)定性

固定化漆酶穩(wěn)定性是漆酶生物傳感電極實際應(yīng)用的重要保證，因此采用ABTS為底物研究了溶液pH和反應(yīng)溫度對游離漆酶和固定化漆酶相對酶活力的影響.不同pH值對游離漆酶和固定化漆酶相對活力的影響如圖4所示.漆酶吸附固定到介孔碳上后，其最適pH沒有發(fā)生變化，仍為5.0.然而在pH 3.0～7.5范圍內(nèi)，介孔碳固定化漆酶的相對酶活力明顯好于游離漆酶，特別是在pH3.0～6.5范圍內(nèi)，固定化漆酶的相對酶活力均保持在80%以上，而游離漆酶僅保持60%的活性.這說明介孔碳固定化漆酶具有更好的pH穩(wěn)定性，可能由于漆酶固定于介孔碳載體后，結(jié)構(gòu)不易發(fā)生變化，對環(huán)境pH變化具有更好的適用性[18].

圖4 pH值對漆酶活性的影響

在漆酶電極使用過程中，提高酶的溫度適用性有利于提高系統(tǒng)穩(wěn)定性.圖5描述了反應(yīng)溫度對游離漆酶和固定化漆酶相對活力的影響.固定化漆酶和游離漆酶的最適溫度均為45 ℃，但在實驗所使用溫度范圍內(nèi)，介孔碳固定化漆酶在更寬的溫度范圍(30 ℃～60 ℃)保持80%以上的相對酶活力，這說明漆酶與介孔碳之間形成了較強的相互作用，使酶分子具有更好的抗熱失活能力.據(jù)文獻報道[19]，工業(yè)廢水的pH值在4.0～9.0之間、溫度在60 ℃以下，介孔碳固定化漆酶pH適用性和熱穩(wěn)定性的提升，更有利其應(yīng)用于工業(yè)廢水中酚類物質(zhì)的在線監(jiān)測.

圖5 溫度對漆酶活性的影響

2.3 漆酶電極的電催化氧化性能

如圖6所示，當(dāng)待測溶液(pH 5.6 PBS緩沖溶液)中不含鄰苯二酚時，CNMC/Lac/Au電極的CV曲線沒有氧化還原峰；而當(dāng)加入0.5 mmol/L鄰苯二酚溶液后，在0.1～0.4 V之間明顯觀察到一對氧化還原峰，表明鄰苯二酚在介孔碳固定漆酶修飾電極表面能進行直接的電化學(xué)反應(yīng)，漆酶電極對鄰苯二酚具有靈敏響應(yīng).

圖6 CNMC/Lac/Au電極的CV曲線圖

圖7為CNMC/Lac/Au電極在pH 5.6、工作電壓0.35 V的測試條件下，在PBS緩沖溶液中連續(xù)加入一定濃度鄰苯二酚進行計時電流法測量而得到的電流響應(yīng)-時間曲線，該曲線反映了漆酶電極的響應(yīng)電流隨待測溶液中底物濃度增大的動態(tài)變化過程.從圖7中可以觀察到響應(yīng)電流隨著鄰苯二酚濃度的增大呈階梯式增長，相同鄰苯二酚添加量所引起的電流增大值基本相等，且在同一濃度下的響應(yīng)曲線較為平滑，表明漆酶電極對鄰苯二酚具有良好穩(wěn)定的電流響應(yīng).

圖7 CNMC/Lac/Au電極的響應(yīng)電流-時間(I-t)曲線

如圖8所示，當(dāng)鄰苯二酚濃度在1.1～22.8μmol/L范圍內(nèi)，隨著鄰苯二酚濃度增加，響應(yīng)電流隨之增大，并且與鄰苯二酚濃度呈現(xiàn)良好的線性響應(yīng)，其線性回歸方程為：i(μA)=0.132 5+0.0158 5c(μmol/L)，擬合線性相關(guān)系數(shù)R2達0.999 2.但鄰苯二酚濃度超過22.8μmol/L后，響應(yīng)電流逐漸趨于穩(wěn)定值.由此表明漆酶傳感器對鄰苯二酚的線性響應(yīng)范圍為1.1～22.8μmol/L，選擇靈敏度為0.016 A/(mol/L)，檢測限為0.217μmol/L(S/N =3).

圖8 CNMC/Lac/Au電極的響應(yīng)電流-鄰苯二酚濃度關(guān)系曲線

2.4 漆酶電極傳感器檢測鄰苯二酚穩(wěn)定性及回收率

按照上述方法，對10μmol/L鄰苯二酚溶液進行6次平行測定，還原峰的相對偏差RSD為2.35%；對10μmol/L鄰苯二酚溶液連續(xù)測定20次，其峰電流僅下降1.05%，由此表明CNMC/Lac/Au電極檢測鄰苯二酚的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性較好.在相同實驗條件下，考察了干擾物對鄰苯二酚測定的影響，實驗結(jié)果表明，1 000μmol/L的L-絡(luò)氨酸、甘氨酸、葡萄糖，2 000μmol/L的K+、Ca2+、Na+、Mg2+、Cl-、NO3-、SO42-對檢測幾乎沒有影響.

加標(biāo)回收實驗結(jié)果如表2所示，樣品測定的回收率為97.05%～104.1%，表明由漆酶電極建立的鄰苯二酚測定方法具有很好的準(zhǔn)確度，可以應(yīng)用于實際樣品中鄰苯二酚的檢測.

表2 加標(biāo)回收實驗結(jié)果

3 結(jié)論

以纖維素納米晶為模板，正硅酸甲酯為硅源，配比調(diào)控制備了手性向列型介孔碳.當(dāng)NCC占NCC-SiO2復(fù)合膜質(zhì)量比為65 wt%時，所得碳材料比表面積達449 m2g-1，平均孔徑5.43 nm，中孔為主.以介孔碳為載體吸附固定漆酶，固定化漆酶具有更好的pH適用性和熱穩(wěn)定性.固定化漆酶修飾Au電極對鄰苯二酚具有良好的電催化氧化作用，漆酶電極構(gòu)建生物傳感器對鄰苯二酚的線性檢測范圍為1.1～22.8μmol/L，選擇靈敏度為0.016 A/(mol/L)，檢測限為0.217μmol/L.該測定方法具有良好的準(zhǔn)確度，適用于實際樣品測定，回收率為97.05%～104.1%，1 000μmol/L的L-絡(luò)氨酸、甘氨酸、葡萄糖以及2 000μmol/L的常規(guī)陰、陽離子對鄰苯二酚檢測幾乎沒有影響.