韋玲 楊凱 劉煥 程棟

胃癌早期無明顯癥狀，發(fā)病隱匿，多數(shù)胃癌患者確診時(shí)已處于晚期[1]。胃癌的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)包含癌基因激活和抑癌基因失活的多基因、多階段的復(fù)雜過程，如何激活抑癌基因或抑制癌基因已成為抗腫瘤基因治療研究特點(diǎn)。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)是一類長度>200 nt的RNA分子，可通過特異性結(jié)合miRNA，抑制miRNA功能，間接調(diào)控蛋白編碼基因，從而影響多種腫瘤細(xì)胞生長[2]。肌聯(lián)蛋白反義RNA1(titin antisense RNA1，TTN-AS1)是一條發(fā)揮促癌作用的lncRNA，在肺癌、甲狀腺癌等多種腫瘤中呈現(xiàn)高表達(dá)，可促進(jìn)腫瘤進(jìn)展[3,4]。有研究表明，普魯卡因可抑制胃癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，但機(jī)制尚未明確[5]。有研究顯示，普魯卡因可通過上調(diào)miR-133b抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖和侵襲能力，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[6]。miR-133b是miRNA家族成員之一，有研究表明，胃癌組織及細(xì)胞miR-133b低表達(dá)，過表達(dá)miR-133b可抑制胃癌細(xì)胞生長[7]。lncRNA TTN-AS1可靶向調(diào)控miR-133b影響食管癌進(jìn)展和轉(zhuǎn)移[8]。鑒于此，本研究旨在普魯卡因調(diào)節(jié)lncRNA TTN-AS1對(duì)胃癌細(xì)胞增殖、侵襲和凋亡的影響，為胃癌治療提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 人胃癌SGC-7901細(xì)胞購自美國ATCC公司。RPMI 1640培養(yǎng)基、胰蛋白酶、胎牛血清、Opti-MEM培養(yǎng)基均購自美國Gibco公司；Trizol試劑盒、Lipofectamine 2000試劑盒均購自美國Invitrogen公司；MTT、DMSO均購自美國Sigma公司；Transwell小室購自美國Coming公司；Annexin V-FITC/PI雙染細(xì)胞凋亡試劑盒、流式細(xì)胞儀均購自美國BD公司；雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒購自美國Promega公司；熒光定量PCR儀購自美國ABI公司；酶標(biāo)儀購自美國Bio-Rad公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) SGC-7901細(xì)胞常規(guī)復(fù)蘇后，使用含10% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)環(huán)境為5%體積分?jǐn)?shù)CO2、37℃、飽和濕度孵箱。為單層貼壁生長，2～3 d換液1次，細(xì)胞達(dá)80%～90%匯合度時(shí)進(jìn)行傳代。取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 轉(zhuǎn)染前1 d，取對(duì)數(shù)生長期的SGC-7901細(xì)胞，制備成細(xì)胞懸液，細(xì)胞計(jì)數(shù)后以1×106個(gè)/孔接種于6孔板，放置于5%體積分?jǐn)?shù)CO2、37℃孵箱中培養(yǎng)，24 h后顯微鏡下觀察，細(xì)胞達(dá)60%～70%融合度時(shí)可進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染參照Lipofectamine 2000試劑盒說明，使用Opti-MEM培養(yǎng)基稀釋lipo 2 000轉(zhuǎn)染試劑，作為A液；使用Opti-MEM培養(yǎng)基稀釋TTN-AS1 siRNA(si-TTN-AS1)及陰性對(duì)照(si-NC)、TTN-AS1過表達(dá)載體(pcDNA-TTN-AS1)及空載體對(duì)照(pcDNA)、miR-133b inhibitor(anti-miR-133b)及anti-NC，作為B液?；旌螦液和B液，室溫孵育20 min，以形成復(fù)合物。將混合液加入相應(yīng)的孔內(nèi)，放置于培養(yǎng)箱孵育5 h，更換為新的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，用于實(shí)驗(yàn)研究。

1.4 實(shí)驗(yàn)分組處理 為研究普魯卡因?qū)GC-7901細(xì)胞增殖、侵襲、凋亡及TTN-AS1和miR-133b表達(dá)影響，將普魯卡因溶液稀釋為0.1、0.5和1.0 mmol/L，使用不同濃度普魯卡因處理細(xì)胞48 h。為研究TTN-AS1靶向miR-133b對(duì)SGC-7901細(xì)胞增殖、侵襲和凋亡影響，將細(xì)胞分為si-NC組、si-TTN-AS1組、si-TTN-AS1+anti-NC組、si-TTN-AS1+anti-miR-133b組。為研究普魯卡因調(diào)節(jié)TTN-AS1對(duì)SGC-7901細(xì)胞增殖、侵襲和凋亡影響，將細(xì)胞分為對(duì)照組、普魯卡因組、普魯卡因+si-NC組、普魯卡因+si-TTN-AS1組。

1.5 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 以5 000個(gè)/孔接種對(duì)數(shù)生長期的SGC-7901細(xì)胞于96孔板，每孔100 μl細(xì)胞懸液，置于5%體積分?jǐn)?shù)CO2、37℃、飽和濕度培養(yǎng)箱24 h，按照上述分組處理細(xì)胞，每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔。收集處理48 h的各組細(xì)胞，在每孔中加5 mg/ml的MTT溶液20 μl，于培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育4 h。終止培養(yǎng)，在每孔加DMSO 150 μl，避光微震蕩20 min，使結(jié)晶物溶解。酶標(biāo)儀波長設(shè)置為490 nm，檢測(cè)各孔吸光度值(OD值)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 細(xì)胞侵襲檢測(cè) 使用經(jīng)無血清培養(yǎng)基稀釋的Matrigel基質(zhì)膠包被Transwell小室底部，放置于37℃恒溫培養(yǎng)箱4～5 h，使基質(zhì)膠凝固。取對(duì)數(shù)生長期的SGC-7901細(xì)胞，按照上述分組分別處理細(xì)胞48 h，無血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度。取200 μl細(xì)胞懸液(約2×104個(gè)/孔)，加入 Transwell上室中，Transwell下室加含F(xiàn)BS的培養(yǎng)基500 μl。置于常規(guī)條件下培養(yǎng)24 h，取出小室，棉簽輕輕拭去上室未侵襲細(xì)胞，4%多聚甲醛固定，0.1%結(jié)晶紫染色。顯微鏡下隨機(jī)選擇5個(gè)視野，記錄穿過膜的細(xì)胞數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7 細(xì)胞凋亡檢測(cè) 收集按照上述分組處理48 h的細(xì)胞，胰酶消化細(xì)胞，并將細(xì)胞濃度調(diào)整為5×105個(gè)/ml。預(yù)冷PBS洗滌細(xì)胞2次，離心，收集細(xì)胞沉淀。根據(jù)Annexin V-FITC/PI雙染細(xì)胞凋亡試劑盒說明，使用500 μl的binding buffer重懸細(xì)胞，然后在細(xì)胞懸液中加Annexin V-FITC染液和PI染液各5 μl，混勻后室溫避光靜置15～20 min，之后在1 h內(nèi)通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.8 TTN-AS1和miR-133b表達(dá)檢測(cè) 收集經(jīng)不同濃度普魯卡因處理48 h的SGC-7901細(xì)胞，采用Trizol法提取細(xì)胞總RNA，NanoDrop檢測(cè)RNA樣本的吸光度值，吸光度值260/280在1.8～2.0表明RNA純度較好。將合格的RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行qPCR擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)體系為20 μl，每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，反應(yīng)體系配置及反應(yīng)條件設(shè)置參照PCR試劑盒說明。所有引物序列為：GAPDH F 5’-GTCACCTTCACCGTTCCAGTTTT-3’，R 5’-CTTAGTTGCGTTACACCCTTTCTT-3’；TTN-AS1 F 5’-GCCAGGTAGAGTTGCAGGTT-3’，R 5’-GAAGCTGCTGCGGATGAATG-3’。miR-133b F 5’-GCGCTTTGGTCCCCTTC-3’，R 5’-CAGTGCAGGGT-CCGAGGT-3’；U6 F 5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，R 5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。其中GAPDH為TTN-AS1內(nèi)參，U6為miR-133b內(nèi)參。所得結(jié)果采用2-△△Ct法計(jì)算。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.9 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn) 構(gòu)建TTN-AS1 3’ UTR的野生型(WT)及突變型(MUT)報(bào)告質(zhì)粒，將質(zhì)粒與miR-133b mimics及miR-NC共轉(zhuǎn)染至SGC-7901細(xì)胞。轉(zhuǎn)染48 h后，吸取各孔培養(yǎng)基，PBS洗滌細(xì)胞3次，加入200 μl 1×PLB，室溫裂解細(xì)胞20 min。離心，轉(zhuǎn)移上清至96孔板中，每組3個(gè)復(fù)孔。上機(jī)檢測(cè)前，分別加Luciferase Assay Regent和1×Stop&Glo?Regent各100 μl，用于螢火蟲熒光素酶及海腎熒光素酶活性檢測(cè)。計(jì)算螢火蟲熒光素酶/海腎熒光素酶活性值，作為各組細(xì)胞熒光素酶活性。

2 結(jié)果

2.1 普魯卡因?qū)GC-7901細(xì)胞TTN-AS1和miR-133b表達(dá)的影響 qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，普魯卡因作用下的SGC-7901細(xì)胞TTN-AS1表達(dá)降低，miR-133b表達(dá)升高，且隨著普魯卡因濃度增加TTN-AS1表達(dá)逐漸降低，miR-133b表達(dá)逐漸升高，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 qRT-PCR檢測(cè)不同濃度普魯卡因處理的SGC-7901細(xì)胞TTN-AS1和miR-133b表達(dá)

2.2 TTN-AS1和miR-133b的靶向關(guān)系 生物信息學(xué)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，TTN-AS1 3’UTR區(qū)與miR-133b 5’UTR有連續(xù)結(jié)合位點(diǎn)。雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)結(jié)果顯示，miR-133b mimics與TTN-AS1 3’ UTR野生型質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染后熒光素酶活性明顯降低(P<0.05)，而與TTN-AS1 3’ UTR突變型質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染后熒光素酶活性無明顯變化(P>0.05)。qRT-PCR結(jié)果顯示，過表達(dá)TTN-AS1的SGC-7901細(xì)胞miR-133b明顯降低，而抑制TTN-AS1表達(dá)的SGC-7901細(xì)胞miR-133b明顯升高(P<0.05)。提示TTN-AS1可負(fù)調(diào)控miR-133b的表達(dá)。見圖1，表2、3。

圖1 生物信息學(xué)預(yù)測(cè)的TTN-AS1和miR-133b的結(jié)合位點(diǎn)

表2 TTN-AS1 WT/MUT與miR-133b mimics共轉(zhuǎn)染SGC-7901細(xì)胞后的熒光素酶活性

表3 過表達(dá)或抑制TTN-AS1的SGC-7901細(xì)胞miR-133b表達(dá)

2.3 普魯卡因?qū)GC-7901細(xì)胞增殖、侵襲和凋亡的影響 MTT、Transwell小室及流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，普魯卡因?qū)GC-7901細(xì)胞增殖和侵襲能力抑制及凋亡促進(jìn)作用隨著濃度遞增而增加，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖2，表4。

圖2 不同濃度普魯卡因?qū)GC-7901細(xì)胞凋亡影響

表4 不同濃度普魯卡因?qū)GC-7901細(xì)胞增殖、侵襲和凋亡影響

2.4 TTN-AS1靶向miR-133b對(duì)SGC-7901細(xì)胞增殖、侵襲和凋亡的影響 各組細(xì)胞增殖、侵襲和凋亡檢測(cè)結(jié)果顯示，與si-NC組比較，si-TTN-AS1組和si-TTN-AS1+anti-NC組細(xì)胞增殖和侵襲能力明顯降低，凋亡率明顯升高(P<0.05)，與si-TTN-AS1+anti-NC組比較，si-TTN-AS1+anti-miR-133b組細(xì)胞增殖和侵襲能力明顯升高，凋亡率明顯降低(P<0.05)。見圖3，表5。

圖3 TTN-AS1靶向miR-133b對(duì)SGC-7901細(xì)胞凋亡的影響

表5 TTN-AS1靶向miR-133b對(duì)SGC-7901細(xì)胞增殖、侵襲和凋亡的影響

2.5 普魯卡因調(diào)節(jié) TTN-AS1表達(dá)對(duì)SGC-7901細(xì)胞增殖、侵襲和凋亡的影響 轉(zhuǎn)染TTN-AS1 siRNA下調(diào)SGC-7901細(xì)胞TTN-AS1表達(dá)，并結(jié)合1.0 mmol/L普魯卡因處理細(xì)胞，細(xì)胞增殖、侵襲和凋亡檢測(cè)結(jié)果顯示，普魯卡因可明顯抑制SGC-7901細(xì)胞增殖和侵襲能力，促進(jìn)細(xì)胞凋亡(P<0.05)，普魯卡因結(jié)合TTN-AS1 siRNA干預(yù)對(duì)細(xì)胞增殖和侵襲抑制及凋亡促進(jìn)作用更明顯。見圖4，表6。

圖4 普魯卡因單獨(dú)或聯(lián)合TTN-AS1 siRNA對(duì)SGC-7901細(xì)胞凋亡的影響

表6 普魯卡因單獨(dú)或聯(lián)合TTN-AS1 siRNA對(duì)SGC-7901細(xì)胞增殖、侵襲和凋亡的影響

3 討論

普魯卡因是傳統(tǒng)的化療藥物之一，在術(shù)中也作為局部麻醉劑使用，多項(xiàng)研究表明，普魯卡因可抑制腫瘤細(xì)胞生長，如Li等[9]研究顯示，普魯卡因可通過調(diào)節(jié)RhoA抑制ERK/MAPK/FAK通路從而降低結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖和遷移能力；方潔等[10]研究顯示，普魯卡因聯(lián)合肌成束蛋白1可抑制膀胱癌細(xì)胞增殖，阻滯細(xì)胞周期，且誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。以上研究提示普魯卡因在腫瘤中發(fā)揮的重要作用。本研究以胃癌SGC-7901細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，使用0.1 mmol/L、0.5 mmol/L和1.0 mmol/L的普魯卡因處理SGC-7901細(xì)胞，細(xì)胞增殖和侵襲能力明顯降低，凋亡率明顯升高，且呈現(xiàn)濃度依賴性，其中普魯卡因?qū)?xì)胞增殖和凋亡影響與Li等[5]的研究結(jié)果一致。

有研究發(fā)現(xiàn)，普魯卡因可通過調(diào)節(jié)miRNA影響腫瘤細(xì)胞生長，如馬寶豐等[11]研究顯示，普魯卡因可通過miR-15a-5p/PI3K-AKT3途徑抑制乳腺癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移能力。內(nèi)源性競(jìng)爭(zhēng)ceRNA是lncRNA行使生物學(xué)功能的機(jī)制之一[12]，普魯卡因是否可調(diào)節(jié)lncRNA影響胃癌細(xì)胞生長尚未清楚。本研究結(jié)果顯示，普魯卡因可呈濃度依賴性抑制TTN-AS1表達(dá)，增強(qiáng)miR-133b表達(dá)。提示普魯卡因可能通過調(diào)節(jié)TTN-AS1/miR-133b影響胃癌細(xì)胞生長。多項(xiàng)研究表明，腫瘤發(fā)生發(fā)展與lncRNAs密切相關(guān)，其表達(dá)異常可促進(jìn)腫瘤進(jìn)展[13-15]。lncRNA TTN-AS1是新近發(fā)現(xiàn)的lncRNA，已被報(bào)道在多種腫瘤中發(fā)揮促癌作用，如Li等[16]研究顯示，TTN-AS1可通過調(diào)節(jié)miR-376a/DKK-1分子軸促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞生長。Dong等[17]研究顯示，抑制TTN-AS1表達(dá)可明顯降低胃癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移能力，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，機(jī)制與調(diào)節(jié)miR-376b-3p/KLF12有關(guān)。研究表明，miRNA幾乎參與胃癌發(fā)生發(fā)展、凋亡、增殖、耐藥、轉(zhuǎn)移等多個(gè)環(huán)節(jié)[18,19]。miR-133b是miRNA家族成員之一，有研究顯示，過表達(dá)miR-133b可抑制胃癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移能力[20]； miR-133b可靶向調(diào)節(jié)GSTP1逆轉(zhuǎn)肺癌順鉑耐藥[21]。生物信息學(xué)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)TTN-AS1與miR-133b存在連續(xù)的結(jié)合位點(diǎn)，但 TTN-AS1是否可調(diào)節(jié)miR-133b影響胃癌細(xì)胞生長尚未明確。本研究結(jié)果顯示，過表達(dá)TTN-AS1可明顯促進(jìn)miR-133b表達(dá)，而抑制TTN-AS1表達(dá)可增強(qiáng)miR-133b表達(dá)，提示TTN-AS1可負(fù)調(diào)控miR-133b的表達(dá)，抑制TTN-AS1表達(dá)可明顯降低胃癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移能力，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，而下調(diào)miR-133b表達(dá)可減弱抑制TTN-AS1對(duì)細(xì)胞生長的影響，提示TTN-AS1可靶向調(diào)節(jié)miR-133b影響胃癌細(xì)胞生長。進(jìn)一步在細(xì)胞轉(zhuǎn)染TTN-AS1 siRNA后結(jié)合普魯卡因處理細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)聯(lián)合使用對(duì)細(xì)胞增殖、侵襲和凋亡的影響強(qiáng)于單獨(dú)使用。提示普魯卡因可調(diào)節(jié)TTN-AS1影響胃癌細(xì)胞生長。

綜上所述，TTN-AS1可靶向調(diào)節(jié)miR-133b抑制胃癌SGC-7901細(xì)胞增殖和侵襲，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。普魯卡因可抑制SGC-7901細(xì)胞增殖和侵襲，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，機(jī)制可能是引起TTN-AS1表達(dá)改變進(jìn)而調(diào)控miR-133b表達(dá)，從而影響胃癌細(xì)胞生長。本研究為普魯卡因在胃癌中機(jī)制研究提供了一定的理論基礎(chǔ)。