＊李曉婷 靳朝暉 曲曉蒙 秦?zé)?潘亞華

（北京民海生物科技有限公司 北京 102600）

采用實(shí)驗(yàn)室消毒劑效力硬表面測(cè)試方法，使用標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)微生物在使用濃度下將消毒液覆于表面，在規(guī)定時(shí)間內(nèi)，確定挑戰(zhàn)菌對(duì)數(shù)減少情況，證明消毒液在需要作用的表面能夠有效降低微生物水平的能力，確定消毒劑的有效性和適用性。

1.環(huán)境菌株篩選

生產(chǎn)車間環(huán)境控制尤為重要，本次驗(yàn)證根據(jù)潔凈區(qū)常見微生物的種類以及出現(xiàn)的頻率、耐消毒劑程度選擇環(huán)境常見代表菌[1]，對(duì)近1年廠區(qū)內(nèi)所有潔凈區(qū)環(huán)境監(jiān)測(cè)出現(xiàn)的未知菌進(jìn)行菌種鑒定，鑒定出的種屬有革蘭氏陰性桿菌（G-）、革蘭氏陽性球菌（G+），對(duì)環(huán)境常見菌的種屬及出現(xiàn)頻率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)如下：

表1 環(huán)境常見菌的種屬及出現(xiàn)頻率表

根據(jù)車間環(huán)境菌出現(xiàn)頻率和種屬選擇人葡萄球菌人亞種（G+）和放射性根瘤菌（G-）進(jìn)行殺毒效果測(cè)試。

2.試驗(yàn)驗(yàn)證方法

此次驗(yàn)證采用載體噴霧法[2]。采用實(shí)驗(yàn)室消毒劑效力硬表面測(cè)試方法，使用標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)微生物在使用濃度下將消毒液覆于表面，在規(guī)定時(shí)間內(nèi)，確定挑戰(zhàn)菌對(duì)數(shù)減少情況，證明消毒液在需要作用的表面能夠有效降低微生物水平的能力，確定消毒劑的有效性和適用性。

潔凈區(qū)涉及的常見材料有不銹鋼、PVC、軟簾、硬簾、玻璃、彩鋼板，選取此6種材質(zhì)進(jìn)行試驗(yàn)，同時(shí)參照清潔衛(wèi)生管理要求，用消毒劑作表面消毒濕潤(rùn)5min，以確認(rèn)復(fù)方過氧化物的消毒效力。

本次試驗(yàn)選取標(biāo)準(zhǔn)菌株中較難殺滅的枯草芽孢桿菌、黑曲霉、白色念珠菌和環(huán)境菌中出現(xiàn)頻次較高的人葡萄球菌人亞種、放射性根瘤菌進(jìn)行驗(yàn)證。

(1)物料信息

①消毒劑

復(fù)方過氧化物消毒劑:純化水=1:19（20倍稀釋）。

②中和劑

本方案采用化學(xué)中和法[2]。在消毒劑與微生物作用達(dá)到規(guī)定時(shí)間的終點(diǎn)時(shí)，加入足量中和劑將殘留消毒劑迅速中和，使其不再持續(xù)抑制或殺滅微生物的方法。

中和劑用于消除試驗(yàn)微生物與消毒劑的混懸液中以及微生物表面上殘留的消毒劑（即：在一定的反應(yīng)時(shí)間后終止消毒劑對(duì)微生物的殺滅作用）。根據(jù)“過氧化氫消毒液的中和劑篩選試驗(yàn)研究（1001-7658（2010）02-0132-03）楊洪等”選取10g/L硫代硫酸鈉[3]（例：硫代硫酸鈉10g，注射用水定容至1L。）作為中和劑。

(2)試驗(yàn)前準(zhǔn)備

①材料的準(zhǔn)備

A.培養(yǎng)基：胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（TSA）、胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（TSB）、沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（SDA）。B.稀釋液：滅菌的0.9%氯化鈉溶液。C.載體：不銹鋼、PVC、軟簾、硬簾、玻璃、彩鋼板，6種材質(zhì)板：長(zhǎng)×寬：15cm×15cm的材質(zhì)板各3塊。D.中和劑：10g/L硫代硫酸鈉溶液，0.22μm濾膜除菌過濾后備用。E.TPS：胰蛋白胨1.0g、氯化鈉8.5g，用900mL純化水溶解，并調(diào)節(jié)pH值在7.0±0.2，最終用純化水定容至1000mL，121℃、30min濕熱滅菌后使用。F.挑戰(zhàn)菌株：枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉、人葡萄球菌人亞種（G+）、放射性根瘤菌（G-）。G.消毒劑：使用純化水配制成適宜濃度，裝入無菌噴瓶中備用。H.其他試驗(yàn)設(shè)施和條件：已校驗(yàn)的1.0mL滅菌移液槍及所配槍頭；1次性10mL刻度吸管；生物安全柜；振蕩器；培養(yǎng)箱；記號(hào)筆；無菌酒精；無菌擦片；棉拭子。

②菌懸液制備[4-5]

A.芽孢菌懸液的制備。取QC儲(chǔ)備的枯草芽孢桿菌第2代菌種，接種于胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基，于30～35℃培養(yǎng)18～24h，即為第3代培養(yǎng)物。用10.0mL吸管吸取5.0～10.0mL第3代的18～24h胰酪大豆胨液體培養(yǎng)物，接種于平皿中胰酪胨大豆瓊脂培養(yǎng)基表面，將其搖動(dòng)使菌液布滿胰酪胨大豆瓊脂培養(yǎng)基的表面，再將多余肉湯培養(yǎng)物吸出，將平皿置于30～35℃溫箱內(nèi)，培養(yǎng)5～7d。固定染色在顯微鏡（油鏡）下進(jìn)行鏡檢。當(dāng)芽孢形成率達(dá)95%以上時(shí)制備芽孢懸液。芽孢液于80℃水浴10min以殺滅殘余的細(xì)菌繁殖體，待冷至室溫后于2～8℃冰箱中備用。芽孢懸液在使用時(shí)，應(yīng)先進(jìn)行活菌培養(yǎng)計(jì)數(shù)。實(shí)驗(yàn)用菌懸液的含菌量根據(jù)計(jì)數(shù)結(jié)果和實(shí)驗(yàn)要求進(jìn)行調(diào)配。

B.白色念珠菌懸液的制備。取QC儲(chǔ)備的白色念珠菌第2代菌種，接種于沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，于20～25℃培養(yǎng)2～3天，即為第3代培養(yǎng)物。試驗(yàn)時(shí)，取第3代斜面培養(yǎng)物在沙氏葡萄糖瓊脂斜面上連續(xù)傳代，方法與第3代相同，制備第4代培養(yǎng)物。

C.黑曲霉懸液的制備。取QC儲(chǔ)備的黑曲霉第2代菌種，接種于沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，置20～25℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5～7天，即為第3代培養(yǎng)物。取第3代平板培養(yǎng)物接種于沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平皿中，20～25℃培養(yǎng)5～7天。即為第4代培養(yǎng)物。

D.人葡萄球菌人亞種（G+）、放射性根瘤菌（G-）。取QC凍存的人葡萄球菌人亞種菌種（或放射性根瘤菌），接種于胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基，于30～35℃培養(yǎng)18～24h。用10.0mL吸管吸取5.0～10.0mL的18～24h胰酪大豆胨液體培養(yǎng)物，接種于胰酪胨大豆瓊脂培養(yǎng)基表面，將其搖動(dòng)使菌液布滿胰酪胨大豆瓊脂培養(yǎng)基的表面，再將多余肉湯培養(yǎng)物吸出，將平皿置于30～35℃溫箱內(nèi)，培養(yǎng)18～24h。培養(yǎng)物用10.0mL吸管加10.0mL稀釋液于平皿中，以L棒輕輕推刮下菌苔。吸出第一批洗下的菌懸液，再向瓶?jī)?nèi)加5.0mL稀釋液，重復(fù)洗菌一遍。將第一和第二批洗下的菌懸液集中于一含玻璃珠的無菌三角燒瓶中，振搖5min，打碎菌塊，使成均勻的菌懸液。注：以上菌懸液制備完成后在2～8℃儲(chǔ)存，當(dāng)天使用不得過夜。

③菌片制備

用清潔劑清潔每一材質(zhì)板，并用純水仔細(xì)潤(rùn)洗；用75%乙醇消毒后晾干備用。在每種材質(zhì)板上標(biāo)記直徑為10mm圓形區(qū)域，每個(gè)區(qū)域認(rèn)為是一個(gè)載體片，在Nd和Nc染菌。吸取0.01mL菌懸液點(diǎn)接到載體片表面，并用接種環(huán)使菌液在表面充分鋪展開來（1×106～5×106CFU/片）。

每種材質(zhì)按上圖染菌，孔間間距≥5cm。以等邊三角形排列。

3.結(jié)果和討論

(1)中和劑效力確認(rèn)

表2 中和劑效力試驗(yàn)結(jié)果

①中和劑毒性組NC

用于驗(yàn)證中和劑本身是否會(huì)對(duì)微生物產(chǎn)生抑制/殺滅作用。吸取0.1mL濃度為1×106～5×106cfu/mL的試驗(yàn)菌懸液于試管內(nèi)，加入0.4mL TPS（模擬代替消毒液），混勻。加入4.5mL中和劑，作用10min。計(jì)數(shù)得NC。

②中和產(chǎn)物毒性組NT

中和劑與消毒劑混合之后形成的體系稱為“中和產(chǎn)物”，本組用于驗(yàn)證中和產(chǎn)物是否會(huì)對(duì)微生物產(chǎn)生抑制/殺滅作用。吸取0.1mL濃度為1×106～5×106cfu/mL的試驗(yàn)菌懸液于試管內(nèi)，吸加4.9mL中和產(chǎn)物溶液（以0.4mL消毒劑加4.5mL中和劑，作用10min配制而成）于試管內(nèi)，混勻。作用10min，計(jì)數(shù)得NT。

③對(duì)照組N0

菌數(shù)對(duì)照，用于驗(yàn)證在無任何抑菌效果條件下（使用TPS）相應(yīng)的微生物數(shù)量，該數(shù)值用于與前2組結(jié)果的對(duì)比評(píng)判。吸取0.1mL濃度為1×106～5×106cfu/mL的試驗(yàn)菌懸液于試管內(nèi)，吸加0.4mLTPS于試管內(nèi)，混勻。加入4.5mL稀釋液，作用10min，計(jì)數(shù)得N0。

④中和劑驗(yàn)證計(jì)算

記錄每個(gè)稀釋度1.0mL樣品的菌落數(shù)。選取一個(gè)合適梯度的讀數(shù)，該梯度的2塊平板的讀數(shù)（記為a和a’）都應(yīng)處于30cfu至300cfu之間（霉菌為10cfu至100cfu之間）。然后用以下公式計(jì)算NC、NT和N0，中和劑毒性試驗(yàn)記為NC，中和劑效力試驗(yàn)記為NT，對(duì)照組試驗(yàn)記為N0：

表3 挑戰(zhàn)菌水平下降對(duì)數(shù)單位結(jié)果統(tǒng)計(jì)表

其中：d=稀釋液的稀釋系數(shù)；NC=log10中和劑毒性測(cè)試中初始混合液菌濃度；NT=log10中和劑效力測(cè)試中初始混合液菌濃度；N0=log10對(duì)照組測(cè)試中初始混合液菌濃度。

⑤可接受標(biāo)準(zhǔn)[6]

(2)硬面測(cè)試

將每種菌所染載體片分開進(jìn)行試驗(yàn)。每批試驗(yàn)以同一濃度消毒劑溶液（或TPS）對(duì)Nd（Nc）組菌片進(jìn)行均勻噴霧。

操作：將消毒劑噴灑在載體菌片的表面，作為消毒劑效力測(cè)試試驗(yàn)（Nd）；將TPS溶液噴灑在載體片的表面，作為陽性對(duì)照（Nc）；另選取未染菌的載體片，將TPS溶液噴灑在載體片表面，操作與陽性對(duì)照試驗(yàn)完全一致，作為陰性對(duì)照。陰性對(duì)照試驗(yàn)結(jié)果不允許有菌生長(zhǎng)。

待試驗(yàn)菌（或TPS）與消毒劑相互作用至規(guī)定時(shí)間，立即用無菌拭子擦拭各消毒后的載片區(qū)域，然后再將拭子頭折斷投入相應(yīng)的預(yù)裝有5mL中和劑（對(duì)于Nd組）或者5mL稀釋液（對(duì)于Nc組）的試管中，中和10min后，通過充分震蕩的方法將拭子上的微生物全部洗脫至試管中。

然后移取1mL試管中的液體到已標(biāo)記過的培養(yǎng)皿中做平板計(jì)數(shù)，每管接種2個(gè)平皿。對(duì)于菌數(shù)對(duì)照組，則按照10倍稀釋的操作依次稀釋3～4支試管（預(yù)裝有4.5mL稀釋液）并根據(jù)預(yù)計(jì)菌液濃度選擇不少于2個(gè)稀釋梯度進(jìn)行平板計(jì)數(shù)。

白色念珠菌倒置于20～25℃培養(yǎng)1～3天，霉菌應(yīng)將平板正置于20～25℃培養(yǎng)3～7天，芽孢倒置于30～35℃培養(yǎng)3～7天，人葡萄球菌人亞種（G+）倒置于30～35℃培養(yǎng)1～3天，放射性根瘤菌（G-）倒置于30～35℃培養(yǎng)1～3天，拋棄那些長(zhǎng)的太多不能計(jì)數(shù)的平板，將剩余的平板計(jì)數(shù)。

(3)計(jì)算與結(jié)果表達(dá)

①記錄每個(gè)梯度1.0mL樣品的菌落數(shù)(a，a’)。a和a’的平均值都應(yīng)處于30cfu至300cfu之間（霉菌為10cfu至100之間），然后用以下公式計(jì)算Nc和Nd，即每個(gè)載體平面上恢復(fù)生長(zhǎng)的菌落數(shù)的對(duì)數(shù)值。

其中：d=稀釋液的稀釋系數(shù)；NI，NII，NIII陽性對(duì)照或消毒劑測(cè)試中每個(gè)菌片上恢復(fù)生長(zhǎng)的菌落數(shù)；Nc=log10陽性對(duì)照中每個(gè)菌片上的菌落數(shù)；Nd=log10消毒劑測(cè)試中每個(gè)菌片上的菌落數(shù)。

②用以下公式計(jì)算Log下降值。Log下降值=Nc-Nd；若下降值超過了5，一律以＞5來表示。計(jì)算每一種測(cè)試菌株的Log下降值。

③可接受標(biāo)準(zhǔn)。硬面測(cè)試為載體定量殺滅試驗(yàn)，即在一定的接觸時(shí)間內(nèi)，消毒劑能夠使挑戰(zhàn)菌水平下降3個(gè)對(duì)數(shù)單位。

(4)討論

本次驗(yàn)證為過氧化物消毒劑在實(shí)驗(yàn)室的消毒效力研究。通過消毒劑消毒效力驗(yàn)證后再進(jìn)行潔凈區(qū)現(xiàn)場(chǎng)消毒效果的驗(yàn)證，以確認(rèn)消毒劑對(duì)不同消毒對(duì)象（環(huán)境、產(chǎn)品和工藝）的有效性及適用性。

4.結(jié)論

通過消毒劑滅活效果驗(yàn)證可知，中和劑以及中和劑與消毒劑的中和產(chǎn)物對(duì)挑戰(zhàn)菌種生長(zhǎng)無不良影響，在一定的接觸時(shí)間內(nèi)消毒劑能夠使挑戰(zhàn)菌水平下降3個(gè)對(duì)數(shù)單位，表明該消毒劑消毒效力能滿足日常消毒使用。