二烯丙基三硫醚通過調(diào)節(jié)腸道屏障緩解卵清蛋白引起的食物過敏

劉艷艷，潘禮龍，孫?嘉,*

（1.江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇 無錫 214122；2.江南大學(xué)無錫醫(yī)學(xué)院，江蘇 無錫 214122）

食物過敏是機(jī)體對攝入的某些食物產(chǎn)生的相關(guān)不良免疫反應(yīng)[1]。這種過敏性反應(yīng)主要由免疫球蛋白E（immunoglobulin E，IgE）介導(dǎo)，也有一些是非IgE介導(dǎo)的過敏反應(yīng)，表現(xiàn)出胃腸道功能紊亂[1]。IgE型食物過敏主要是由食物特異性IgE抗體激活肥大細(xì)胞引起[2]。食物過敏目前是全球主要的公共衛(wèi)生問題，食物過敏患病率的估測值隨年齡、地理位置和研究方法的不同而變化，但總體結(jié)論是該病很普遍，并且患病率一直在增加，尤其是在某些西方國家患病率高達(dá)10%[3]。1995年，世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）和聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織（Food and Agriculture Organization of the United Nations，F(xiàn)AO）公布了八大類常見過敏食物，包括花生、大豆、雞蛋、牛奶、甲殼類、魚類、堅(jiān)果和小麥，90%以上的食物過敏反應(yīng)都是由這8 類食物引起的[4]。食物過敏的發(fā)病原因復(fù)雜、過敏原眾多，當(dāng)前針對食物過敏的主要治療方法有避免接觸食物過敏原、腎上腺素處理、抗組胺處理，以及口服和舌下免疫治療，但長期的醫(yī)藥治療給大多數(shù)患者帶來厭惡或疼痛感；因此，通過食物進(jìn)行免疫調(diào)節(jié)治療成為了當(dāng)前迫切的需求。

目前，研究發(fā)現(xiàn)IgE型食物過敏與肥大細(xì)胞、2型免疫因子等免疫系統(tǒng)組成密切相關(guān)。食物抗原引起的過敏主要發(fā)生在胃腸道、口腔和皮膚中，攝入的蛋白質(zhì)絕大多數(shù)被胃中的胃酸和小腸中的消化酶分解，其余的食物蛋白質(zhì)和多肽被腸上皮細(xì)胞（intestinal epithelial cells，IEC）和位于派爾集合淋巴結(jié)上方的M細(xì)胞從內(nèi)腔轉(zhuǎn)運(yùn)至黏膜[5]。IEC可以處理腔內(nèi)抗原，并經(jīng)樹突細(xì)胞（dendritic cells，DC）呈遞給T細(xì)胞上的主要組織相容性復(fù)合體（major histocompatibility complex，MHC）II類復(fù)合物，促進(jìn)原始T細(xì)胞向輔助型T2（T helper 2，Th2）細(xì)胞分化導(dǎo)致食物過敏[5-6]。IgE介導(dǎo)的過敏反應(yīng)依賴于Th2細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-4、IL-5和IL-13等，Th2細(xì)胞因子誘導(dǎo)B細(xì)胞產(chǎn)生抗原特異性IgE抗體。2型天然淋巴細(xì)胞（the group 2 innate lymphoid cell，ILC2）和Th2型細(xì)胞類似，可在IEC來源的IL-25、IL-33和胸腺基質(zhì)淋巴生成素（thymic stromal lymphopoietin，TSLP）的作用下，產(chǎn)生IL-4和IL-13[7]，促進(jìn)腸道上皮干細(xì)胞向杯狀細(xì)胞和簇絨細(xì)胞分化以及促進(jìn)肥大細(xì)胞擴(kuò)增[8]。當(dāng)再次接觸過敏原時(shí)，IgE會和肥大細(xì)胞表面的高親和力受體Fc受體FcεR結(jié)合，從而促進(jìn)肥大細(xì)胞脫顆粒，釋放組胺、白三烯等物質(zhì)，引起紅腫等過敏癥狀[9]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，食品和天然材料通過免疫調(diào)節(jié)作用可以減輕過敏性疾病的癥狀[10]，例如Shin等[11-12]發(fā)現(xiàn)黃芩苷可調(diào)節(jié)Th細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)來減輕卵清蛋白（ovalbumin，OVA）引起的食物過敏癥狀，Huang等[13]則發(fā)現(xiàn)薯蕷皂苷元是通過誘導(dǎo)小鼠腸道中的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（regulatory T cells，Treg）發(fā)揮抗過敏作用。

腸上皮是抵御外部環(huán)境最重要的屏障，作為選擇性滲透屏障，既允許營養(yǎng)物質(zhì)、電解質(zhì)和水的吸收，又能保障對管腔內(nèi)毒素、抗原和菌群有效的防御。腸上皮通過形成復(fù)雜的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)連接相鄰細(xì)胞并密封細(xì)胞間空間，從而維持其選擇性屏障功能。腸屏障功能障礙是導(dǎo)致食物過敏、腸炎和腹腔疾病等疾病的主要因素[14]。在食物過敏的發(fā)病過程中，腸道通透性的增加導(dǎo)致完整蛋白質(zhì)暴露的增加，加劇食物引起的過敏反應(yīng)[5]。相反，增強(qiáng)腸屏障功能則可以緩解食物過敏癥狀，Bae等[15]發(fā)現(xiàn)黃芩苷可通過調(diào)節(jié)緊密連接蛋白的表達(dá)水平增強(qiáng)腸屏障功能，最終減弱食物過敏性免疫反應(yīng)。

二烯丙基三硫醚（diallyl trisulfide，DATS）是大蒜中的主要活性成分之一，張志軍等[16]利用氣相色譜法測得腌制大蒜中的DATS質(zhì)量濃度為416.800 μg/mL～8.335 mg/mL。研究發(fā)現(xiàn)，DATS可調(diào)節(jié)多種癌癥發(fā)展的標(biāo)志性階段，包括細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡、血管生成、侵襲和轉(zhuǎn)移，DATS可在細(xì)胞周期的多個(gè)階段阻滯癌細(xì)胞，其中G2/M阻滯被最廣泛報(bào)道[17]。此外，DATS也具有一定的抗炎作用，張芳等[18]在小鼠中發(fā)現(xiàn)DATS可以通過抑制核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）核轉(zhuǎn)移和髓過氧化物酶活性，從而對脂多糖誘導(dǎo)的肺部氧化損傷和炎癥反應(yīng)有一定的逆轉(zhuǎn)作用。大蒜素為大蒜中的含硫化合物成分，賴雁威等[19]發(fā)現(xiàn)大蒜素可能通過干擾Toll樣受體4（Toll-like receptors，TLR4）/NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、抑制下游NF-κB活化、抑制炎癥因子釋放、恢復(fù)腸道酶活性及能量代謝、改善腸黏膜功能，從而促進(jìn)慢性腹瀉大鼠腸黏膜修復(fù)。但是作為大蒜素中主要成分之一的DATS對于腸道屏障的作用還鮮被研究，其對食物過敏小鼠的影響也鮮被探究。所以，本研究主要通過在小鼠食物過敏模型中灌胃補(bǔ)充DATS，探究其對食物過敏的影響及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

Balb/c小鼠（5周齡，雌性）購于上海靈暢生物科技有限公司，生產(chǎn)許可證號：SCXK（滬）2018-0003，使用許可證號：0100161211000LX，在江南大學(xué)無錫醫(yī)學(xué)院動物實(shí)驗(yàn)中心無特定病原體（specific pathogen free，SPF）級屏障環(huán)境中飼養(yǎng)。飼養(yǎng)間條件：溫度23～25 ℃、相對濕度40%～60%?？諝饨粨Q次數(shù)10～15 次/h，光照周期明暗12 h/12 h，提供動物實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)飼料，自由飲食飲水。

卵清蛋白、Al(OH)3、熒光素異硫氰酸酯-葡聚糖（fluorescein isothiocyanate-dextran，F(xiàn)ITC-dextran） 美國Sigma-Aldrich公司；DATS 美國Boc Sciences公司；TRIzol試劑、Super Script II逆轉(zhuǎn)錄酶 加拿大Invitrogen公司；SYBR Green Supermix染料 翌圣生物科技（上海）有限公司；ZO-1抗體、β-actin抗體武漢愛博泰克生物科技有限公司；ZO-2抗體 美國Proteintech公司；Occludin抗體 美國Bimake公司；Claudin-1抗體 英國Abcam公司；OVA特異性IgE（OVA specific IgE，OVA-sIgE）、小鼠肥大細(xì)胞蛋白酶1（mouse mast cell protease 1，mMCP-1）酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒南京森貝伽公司；乙醇、氯仿、異丙醇 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；總RNA提取試劑盒（TRIzol法）寶生物工程（大連）有限公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒 上海碧云天公司；二抗（山羊抗兔IgG H&L（HRP）） 美國Thermo Fisher Scientific公司。

1.2 儀器與設(shè)備

電子分析天平 梅特勒-托利多（上海）儀器有限公司；切片電子掃描儀 匈牙利3DHISTECH公司；超聲波破碎儀 美國Sonics公司；高通量組織研磨機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司；微型冷凍離心機(jī)、分光光度計(jì)、全波長酶標(biāo)儀 美國Thermo Fisher Scientific公司；Infinite M200多功能酶標(biāo)儀 瑞士Tecan公司。

1.3 方法

1.3.1 構(gòu)建小鼠過敏模型

全部動物實(shí)驗(yàn)均由江南大學(xué)動物倫理委員會批準(zhǔn)（實(shí)驗(yàn)動物倫理編號：JN.No20190630b0480830[186]），并遵循國家、國際動物實(shí)驗(yàn)倫理原則開展。將5周齡左右的雌性Balb/c小鼠隨機(jī)分為對照組、食物過敏組（FA組）和DATS組（FA＋DATS組），每組6～8只。制備小鼠食物過敏模型的過程可分為致敏和激發(fā)兩個(gè)階段。致敏階段：實(shí)驗(yàn)組分別在實(shí)驗(yàn)的第0天（第一次腹腔注射的時(shí)間為第0天）和第14天向小鼠體內(nèi)腹腔注射0.2 mL含50 μg OVA和1 mg Al(OH)3佐劑的無菌生理鹽水。激發(fā)階段：從第28天開始，每隔1 d灌胃含50 mg OVA的無菌生理鹽水進(jìn)行激發(fā)，連續(xù)6 次，對照組灌胃等體積的生理鹽水。FA＋DATS組每天灌胃10 mg/kg DATS溶液。最后一次經(jīng)50 mg OVA（或生理鹽水）灌胃1 h后，向小鼠體內(nèi)注射致死劑量的戊巴比妥鈉并快速收集新鮮的血液、空腸組織等，血液35 000 r/min離心10 min后吸取上清液獲得血清，將血清樣品和空腸組織保存于－80 ℃冰箱。

1.3.2 腹瀉率與體溫的監(jiān)測

在造模的激發(fā)階段，每次灌胃OVA或生理鹽水30 min后記錄各組小鼠的腹瀉發(fā)生情況。在最后一次經(jīng)50 mg OVA灌胃1 h內(nèi)，每隔20 min測量各組小鼠直腸溫度并記作體溫。通過分析灌胃激發(fā)階段腹瀉發(fā)生率和體溫下降幅度的情況判斷食物過敏癥狀的嚴(yán)重程度。

1.3.3 腸道通透性的測定

腸道黏膜通透性通過FITC-dextran質(zhì)量濃度來反映。將小鼠禁食4 h后灌胃500 mg/kg的FITC-dextran，4 h后處死小鼠，將血液離心后收集血清，通過Infinite M200多功能酶標(biāo)儀測定吸光度（激發(fā)波長492 nm、發(fā)射波長525 nm）。將FITC-dextran標(biāo)準(zhǔn)樣品在磷酸鹽緩沖液中連續(xù)稀釋成一系列質(zhì)量濃度，測定吸光度，獲得線性標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，并計(jì)算得出血清中的FITC-dextran質(zhì)量濃度。

1.3.4 小鼠空腸組織病理學(xué)檢測

收集新鮮的空腸組織，經(jīng)體積分?jǐn)?shù)4%多聚甲醛固定、脫水、石蠟包埋后，制成5 μm厚的組織切片并進(jìn)行蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色。經(jīng)過烤片后，依次將切片放入二甲苯和體積分?jǐn)?shù)70%、80%、90%、95%、100%的乙醇溶液中后，置于HE中染色30 s，流水沖洗15 min后置于分化液中7 s，流水沖洗20 min后HE染色2 s，將切片依次置于70%、80%、95%、95%、100%的乙醇溶液及二甲苯中。使用中性樹膠封片后，于顯微鏡下觀察小鼠空腸組織病理學(xué)變化，根據(jù)腸絨毛受損情況、上皮屏障破損和免疫細(xì)胞浸潤等指標(biāo)對空腸組織進(jìn)行評價(jià)。

1.3.5 總RNA提取與實(shí)時(shí)熒光定量PCR

利用TRIzol法根據(jù)試劑盒說明書對總RNA進(jìn)行提取?？漳c組織樣品先在高通量組織研磨器中進(jìn)行破碎，再使用氯仿進(jìn)行抽提，離心后吸取上清液，加入等體積的異丙醇沉淀RNA，離心后棄去上清液，用體積分?jǐn)?shù)75%乙醇溶液洗滌兩次后，溶于二乙基焦碳酸酯（diethylprocarbonate，DEPC）水中。使用Super Script II逆轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。

采用SYBR Green Supermix染料和待測基因的特異性引物（生工生物工程（上海）股份有限公司合成）進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（reverse transcriptionquantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR），反應(yīng)體系為：1 μL正向序列引物、1 μL反向序列引物、10 μL SYBR Green Supermix染料、2 μL cDNA、6 μL水。RT-qPCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)熱5 min；95 ℃持續(xù)15 s，60 ℃持續(xù)60 s，反應(yīng)40 個(gè)循環(huán)。按照基因相對表達(dá)水平＝2－ΔΔCt來計(jì)算目的基因（Il-4、Il-5、Il-13、Il-25、Il-33、Tslp、Tjp1、Tjp2、Ocln、Cldn1）相對管家基因的表達(dá)量。RT-qPCR使用的引物如表1所示。

表1 RT-qPCR使用的特異性引物Table 1 Specific primers used for RT-qPCR

1.3.6 血清OVA-sIgE和mMCP-1質(zhì)量濃度測定

血清OVA-sIgE和mMCP-1質(zhì)量濃度按照ELISA試劑盒說明書測定。

1.3.7 Western blot分析

將空腸組織在RIPA裂解液中勻漿后于4 ℃、14 000 r/min條件下離心15 min，得到的上清液即為總蛋白提取物。利用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白質(zhì)量濃度。蛋白樣品經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分離后，電轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜上，經(jīng)封閉后分別加一抗（ZO-1抗體、ZO-2抗體、Occludin抗體、Claudin-1抗體、β-actin抗體）4 ℃過夜孵育，用相應(yīng)二抗（山羊抗兔IgG H&L（HRP））在搖床上室溫孵育1 h，顯色后于凝膠成像系統(tǒng)中曝光觀察。使用AlphaView軟件對條帶進(jìn)行灰度分析，以β-actin作為內(nèi)參，通過與相應(yīng)內(nèi)參的灰度比計(jì)算蛋白的相對表達(dá)量。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

所有結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。使用GraphPad Prime 7軟件進(jìn)行單因素方差分析，用于評估各組之間的顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 DATS處理對小鼠食物過敏癥狀的影響

為了探究DATS在食物過敏中是否發(fā)揮作用，首先測定了表征IgE介導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)性食物過敏癥狀的指標(biāo)，包括過敏性腹瀉發(fā)生率、體溫下降幅度、血清中OVA-sIgE和mMCP-1的水平[20-21]。如圖1A、B所示，經(jīng)6 次OVA激發(fā)后，F(xiàn)A組小鼠與對照組相比出現(xiàn)腹瀉的小鼠數(shù)量顯著增加，小鼠體溫下降幅度增加，與FA組小鼠相比，補(bǔ)充DATS組的小鼠則表現(xiàn)出腹瀉發(fā)生率下降和體溫下降幅度減小。

OVA誘導(dǎo)的小鼠食物過敏發(fā)病依賴于腸道中產(chǎn)生的抗原特異性IgE，從而激活下游的肥大細(xì)胞，而mMCP-1是由肥大細(xì)胞脫顆粒產(chǎn)生。如圖1C、D所示，與對照組相比，F(xiàn)A組小鼠血清中OVA-sIgE和mMCP-1水平高度顯著上調(diào)（P＜0.001），DATS的添加可以極顯著或高度顯著降低二者在血清中的水平（P＜0.01、P＜0.001）。DATS補(bǔ)充后可能通過調(diào)節(jié)腸道屏障功能和腸道免疫反應(yīng)發(fā)揮抗過敏作用，所以接下來進(jìn)一步通過HE染色觀察空腸形態(tài)學(xué)變化以及利用RT-qPCR檢測DATS對小鼠腸道免疫反應(yīng)的作用。

由圖1E可知，對照組小鼠中空腸組織形態(tài)完整，絨毛未出現(xiàn)脫落，固有層也未腫脹，F(xiàn)A組小鼠空腸組織絨毛破碎脫落，而DATS的補(bǔ)充可以緩解空腸組織形態(tài)的破壞，絨毛脫落得到緩解。因此，認(rèn)為DATS可以緩解食物過敏的癥狀。

圖1 DATS處理對食物過敏癥狀的影響Fig. 1 Effect of DATS on food allergy symptoms

2.2 DATS處理對過敏小鼠空腸組織Th2型細(xì)胞因子基因表達(dá)量的影響

食品過敏發(fā)生時(shí)，Th2型細(xì)胞因子IL-4、IL-5和IL-13的水平會顯著增加[22]，如圖2所示，F(xiàn)A組小鼠空腸組織中Th2型細(xì)胞因子Il-4、Il-5和Il-13的基因表達(dá)水平高度顯著上調(diào)（P＜0.001），與FA組小鼠相比，DATS處理后小鼠Th2型細(xì)胞因子基因的表達(dá)水平極顯著下調(diào)（P＜0.01）。結(jié)果表明灌胃補(bǔ)充DATS后可以通過調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)抑制Th2型細(xì)胞因子的產(chǎn)生，DATS可能在小鼠腸道中發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)功能。

圖2 小鼠空腸組織中Il-4（A）、Il-5（B）和Il-13（C）的表達(dá)水平Fig. 2 Il-4 (A), Il-5 (B) and Il-13 (C) expression levels in mouse jejunum tissue

2.3 DATS處理對腸道上皮細(xì)胞因子基因表達(dá)量的影響

在食物過敏的早期，腸道上皮來源的IL-25、IL-33和TSLP表達(dá)量增加，可以促進(jìn)Th2型細(xì)胞和ILC2產(chǎn)生Th2型細(xì)胞因子IL-4、IL-5和IL-13[23]。由于檢測到當(dāng)補(bǔ)充DATS后，Th2型細(xì)胞因子表達(dá)量下降，所以測定了小鼠空腸組織中Il-25、Il-33和Tslp基因水平的變化。如圖3所示，F(xiàn)A組小鼠與對照組小鼠相比，空腸中腸道上皮細(xì)胞因子Il-25、Il-33和Tslp的基因表達(dá)水平均極顯著或高度顯著上調(diào)（P＜0.01、P＜0.001），而在補(bǔ)充DATS后，Il-33、Tslp表達(dá)水平無顯著變化，Il-25基因表達(dá)水平極顯著下降（P＜0.01），這提示DATS可能通過抑制IL-25的產(chǎn)生緩解食物過敏。以往研究發(fā)現(xiàn)，IL-25在小鼠腸道中僅由一種特定的上皮細(xì)胞簇狀細(xì)胞產(chǎn)生[24]，并且觀察到DATS補(bǔ)充后可以有效緩解腸道上皮細(xì)胞受損，所以猜測DATS補(bǔ)充后可能通過調(diào)節(jié)腸道上皮細(xì)胞來源的IL-25水平發(fā)揮抑制Th2型免疫反應(yīng)的作用。

圖3 小鼠空腸組織中Il-25（A）、Il-33（B）和Tslp（C）表達(dá)水平Fig. 3 Il-25 (A), Il-33 (B) and Tslp (C) expression levels in mouse jejunum tissue

2.4 DATS處理對過敏小鼠腸道屏障作用的影響

腸道屏障功能對維持體內(nèi)平衡非常重要，屏障功能的破壞會導(dǎo)致腸道疾病，如腸漏綜合征、炎癥性腸病（inflammatory bowel disease，IBD）和食物過敏[15,25]。有研究表明，食物過敏小鼠的腸道屏障會受損，腸道通透性增加[26]。通過灌胃FITC-dextran檢測小鼠空腸黏膜通透性，結(jié)果如圖4所示。與對照組小鼠相比，F(xiàn)A組小鼠血清中FITC-dextran質(zhì)量濃度高度顯著增加（P＜0.001），而FA＋DATS組小鼠與FA組小鼠相比，血清中FITC-dextran質(zhì)量濃度高度顯著降低（P＜0.001）。此外，通過檢測腸上皮中緊密連接蛋白及相關(guān)基因Claudin-1（Cldn1）、Occludin（Ocln）、ZO-1（Tjp1）和ZO-2（Tjp2）的表達(dá)，探究DATS是否能調(diào)節(jié)小鼠食物過敏模型中的腸屏障功能。和預(yù)期結(jié)果一樣，F(xiàn)A組小鼠與對照組小鼠相比，Occludin、ZO-1和ZO-2的表達(dá)在基因水平和蛋白水平上均顯著降低（P＜0.05、P＜0.01、P＜0.001），而在補(bǔ)充DATS后，與FA組相比，這些緊密連接蛋白的表達(dá)水平則上調(diào)。這些結(jié)果表明緊密連接蛋白表達(dá)水平的增強(qiáng)可能有助于減輕食物過敏。因此認(rèn)為DATS可能通過提高緊密連接蛋白的表達(dá)水平來抑制食物過敏原如OVA在腸道屏障中的滲透。

圖4 小鼠腸道屏障緊密連接蛋白表達(dá)量的變化Fig. 4 Changes in intestinal epithelial tight junction protein expression in mice

3 討 論

本研究發(fā)現(xiàn)DATS可通過調(diào)節(jié)緊密連接蛋白的表達(dá)增強(qiáng)腸道屏障功能減輕食物過敏免疫反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)選擇大蒜素的主要活性成分之一DATS作為大蒜有機(jī)硫化物的代表成分，探究其是否對食物過敏小鼠發(fā)揮保護(hù)作用。首先通過在食物過敏小鼠中灌胃DATS發(fā)現(xiàn)食物過敏小鼠中出現(xiàn)的腹瀉、體溫降低以及血清OVA-sIgE和mMCP-1水平上調(diào)等癥狀均表現(xiàn)出減輕現(xiàn)象，表明添加的DATS可能在食物過敏中發(fā)揮保護(hù)性作用。

進(jìn)一步探究DATS對空腸中Th2型細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)作用以及對腸道緊密連接蛋白的調(diào)節(jié)作用，發(fā)現(xiàn)DATS可通過降低空腸組織中Th2型細(xì)胞因子水平發(fā)揮保護(hù)性作用，并上調(diào)緊密連接蛋白的表達(dá)增強(qiáng)腸道屏障功能減弱食物過敏癥狀。Xu Yi等[27]利用巨細(xì)胞病毒（cytomegalovirus，MCMV）感染小鼠后發(fā)現(xiàn)Th1型細(xì)胞因子和T-bet（T-box基因家族的轉(zhuǎn)錄因子）的表達(dá)顯著下調(diào)，而GATA-3（GATA基因家族的轉(zhuǎn)錄因子）和Th2型細(xì)胞因子的表達(dá)量顯著上調(diào)，但是當(dāng)使用大蒜素處理后發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)錄因子GATA-3和Th2型細(xì)胞因子的表達(dá)量顯著降低。宿主為應(yīng)對食物抗原等產(chǎn)生Th2型免疫反應(yīng)，該反應(yīng)不僅涉及DC、T細(xì)胞和B細(xì)胞等多種免疫細(xì)胞，而且涉及非免疫細(xì)胞上皮細(xì)胞等，其中CD4＋T細(xì)胞發(fā)揮關(guān)鍵作用。原始CD4＋T細(xì)胞可分化為至少4種類型的Th細(xì)胞，即Th1、Th2、Th17和Treg，其中Th2型細(xì)胞對于宿主抵抗細(xì)胞外寄生蟲（例如蠕蟲）的入侵以及減輕哮喘和其他過敏性炎癥（如食物過敏）的發(fā)展具有重要作用。Th2細(xì)胞通過產(chǎn)生各種細(xì)胞因子來發(fā)揮功能，包括IL-4、IL-5和IL-13等。主要由Th2型細(xì)胞分泌的IL-4和IL-5作為過敏性疾病的主要介質(zhì)，在過敏免疫反應(yīng)中起著關(guān)鍵作用，不僅誘導(dǎo)CD4＋T細(xì)胞從原始T細(xì)胞向Th2細(xì)胞分化，而且誘導(dǎo)B細(xì)胞的增殖、分化和激活，從而產(chǎn)生IgE[15]。分泌抗原傳遞（secretory antigen passages，SAP）通過IL-13-CD38-環(huán)狀二磷酸腺苷核糖（cyclic adenosine diphosphate ribose，cADPR）依賴性過程將食物過敏原引導(dǎo)至固有層黏膜肥大細(xì)胞，食物過敏原可通過IL-13/CD38/cADPR途徑介導(dǎo)通過小腸上皮細(xì)胞，調(diào)節(jié)食物過敏反應(yīng)的發(fā)生[28]。此外，IL-13在食物過敏中對于腸道上皮干細(xì)胞向杯狀細(xì)胞和簇狀細(xì)胞的轉(zhuǎn)變也非常重要[20]。因此，認(rèn)為DATS的補(bǔ)充可以顯著下調(diào)空腸組織中Th2型細(xì)胞因子的表達(dá)水平，可能是通過調(diào)節(jié)腸道中Th2型免疫反應(yīng)抑制細(xì)胞因子的產(chǎn)生實(shí)現(xiàn)的[29-30]。

近來人們越來越關(guān)注由上皮細(xì)胞衍生的細(xì)胞因子IL-33、IL-25和TSLP引起的2型免疫應(yīng)答。Leyva-Castillo等[8]證明膠帶剝離引起角質(zhì)形成細(xì)胞釋放的IL-33與腸道簇狀細(xì)胞衍生的IL-25協(xié)同作用，可促進(jìn)腸道ILC2的增殖和激活，從而促進(jìn)IL-4的產(chǎn)生，引起肥大細(xì)胞在腸道中的激活，從而加劇過敏性皮炎引起的食物過敏反應(yīng)。而TSLP可以上調(diào)樹突狀細(xì)胞上共刺激分子OX40L、CD80和CD86的表達(dá)，這是T細(xì)胞向Th2型極化所必需的[31]。本實(shí)驗(yàn)通過測定腸道上皮細(xì)胞因子Il-25、Il-33和Tslp基因表達(dá)水平，確定DATS可能通過降低IL-25水平而發(fā)揮保護(hù)性作用。

IL-25在腸道中的唯一來源是腸道上皮細(xì)胞中的簇狀細(xì)胞，源自簇狀細(xì)胞的IL-25可以進(jìn)一步激活I(lǐng)LC2分泌IL-13，介導(dǎo)小腸中的2型免疫相關(guān)反應(yīng)[32-24]。Hussain等[33]發(fā)現(xiàn)高脂飲食會破壞腸道屏障，降低緊密連接蛋白的表達(dá)，從而促進(jìn)食物過敏的發(fā)生。食物過敏的小鼠腸道屏障完整性的改變與Occludin、Claudin-1、ZO-1、ZO-2表達(dá)水平的降低有關(guān)[34-35]，所以本實(shí)驗(yàn)分別利用RT-qPCR和Western blot檢測了其在基因和蛋白水平表達(dá)的差異，結(jié)果表明，補(bǔ)充DATS后可上調(diào)空腸組織中緊密連接蛋白ZO-1、ZO-2以及Occludin的表達(dá)，有效緩解腸道屏障損傷，增強(qiáng)腸道屏障功能，從而緩解食物過敏癥狀。

綜上，食物來源大蒜素的有效活性成分DATS可恢復(fù)腸道屏障，從而改善了OVA誘導(dǎo)的食物過敏反應(yīng)。因此，DATS有潛力作為抗過敏劑用于預(yù)防或治療食物過敏。