馬倩 胡自釗

摘 要：高效液相色譜法是檢測(cè)食品添加劑、污染物、真菌毒素等的主要檢測(cè)設(shè)備。提高高效液相色譜檢測(cè)水平、快速準(zhǔn)確地完成檢測(cè)是液相色譜檢測(cè)工作者需要思考的基本問題。本文通過剖析高效液相色譜法檢測(cè)經(jīng)常出現(xiàn)的問題，提出了檢測(cè)分析的技術(shù)要點(diǎn)和控制措施，并對(duì)可疑的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行綜合分析，以提高高效液相色譜檢測(cè)技術(shù)水平，為從事高效液相色譜檢測(cè)工作的人員提供理論和實(shí)操參考。

關(guān)鍵詞：高效液相色譜;檢測(cè)技術(shù);思考

Thinking About the Technology of High-Performance Liquid Chromatography

MA Qian， HU Zizhao

（Center of Quality and Technology Inspection and Testing of Ankang， Ankang 725000， China）

Abstract： The high-performance liquid chromatography is the main testing equipment for food additives， contaminants， mycotoxins， etc. Improving the level of high-performance liquid chromatography detection and completing the inspection， rapidly and accurately is the basic issue that liquid chromatography inspection workers need to think about. This paper analyzed the common problems of high-performance liquid chromatography， put forward the technical points and control measures of detection and analysis， and carried out a comprehensive analysis of the suspicious test results， so as to improve the technical level of high-performance liquid chromatography detection， to provide theoretical and practical reference for personnel engaged in high-performance liquid chromatography detection.

Keywords： high-performance liquid chromatography; detection technique; thinking

高效液相色譜儀是一種高壓、高速、高效和高靈敏度的檢測(cè)儀器，尤其適合高沸點(diǎn)、熱穩(wěn)定性差、相對(duì)分子質(zhì)量大的有機(jī)物的定量和定性分析，在醫(yī)藥、環(huán)保、生命科學(xué)和食品安全檢測(cè)中被廣泛運(yùn)用[1-3]。但在實(shí)際操作中，受目標(biāo)檢測(cè)物含量低和樣品成分復(fù)雜的影響，會(huì)出現(xiàn)漏檢、錯(cuò)檢、檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)等現(xiàn)象。本文通過剖析高效液相色譜法檢測(cè)經(jīng)常出現(xiàn)的問題，提出檢測(cè)分析的技術(shù)要點(diǎn)和控制措施，并對(duì)有問題的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行綜合分析，以提高高效液相色譜檢測(cè)技術(shù)水平，滿足食品安全監(jiān)管需要。

1 高效液相色譜法檢測(cè)過程中存在的問題

液相色譜檢測(cè)是以色譜峰的保留時(shí)間來進(jìn)行定性分析，同一物質(zhì)在同一色譜條件下應(yīng)有相同的保留時(shí)間。但在實(shí)際食品添加劑檢測(cè)中經(jīng)常會(huì)遇到復(fù)雜基質(zhì)樣品，由于雜質(zhì)成分與待測(cè)化合物性質(zhì)相似或接近，就可能在色譜行為上表現(xiàn)一致，即使完全按照檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)操作，也有各種因素干擾結(jié)果的準(zhǔn)確性，對(duì)于這些峰，僅靠保留時(shí)間定性，容易出現(xiàn)漏檢、錯(cuò)檢、數(shù)據(jù)不準(zhǔn)確和檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)等問題。①漏檢是不能檢出該檢的組分，特別是低含量和復(fù)雜的組分，如黃曲霉毒素，毒性大、含量低，容易漏檢。②錯(cuò)檢是對(duì)檢測(cè)結(jié)果的誤判，得出錯(cuò)誤結(jié)論，俗稱“假陽性”。③數(shù)據(jù)不準(zhǔn)確是檢測(cè)數(shù)據(jù)遠(yuǎn)遠(yuǎn)偏離真值，甚至忽高忽低，不能真實(shí)反映出樣品內(nèi)組分情況。④檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)是在檢測(cè)樣品多、指標(biāo)多的情況下，從樣品進(jìn)入預(yù)處理到出具檢測(cè)報(bào)告的時(shí)間長(zhǎng)，甚至超過法定時(shí)限。因此，快速、準(zhǔn)確地應(yīng)用色譜分析來定性、定量目標(biāo)物是檢測(cè)機(jī)構(gòu)獲取準(zhǔn)確、可靠的分析數(shù)據(jù)的關(guān)鍵。

2 高效液相色譜法檢測(cè)技術(shù)的質(zhì)量控制

2.1 樣品前處理

前處理包括取樣、制樣、提取和凈化。正確的樣品前處理是保障檢測(cè)數(shù)據(jù)科學(xué)、準(zhǔn)確的第一步。不正確、不規(guī)范的預(yù)處理可能導(dǎo)致譜圖產(chǎn)生雜峰、詭峰，影響目標(biāo)峰的分析。嚴(yán)格控制預(yù)處理過程，盡力減少雜峰，突出目標(biāo)物，避免在目標(biāo)物出峰位置有干擾峰，造成假陽性的錯(cuò)誤檢測(cè)結(jié)論[4-5]。

取樣要有代表性，嚴(yán)格按照規(guī)程進(jìn)行混勻、縮分。①根據(jù)樣品狀態(tài)來制樣。固體要將其粉碎后再混勻;液體樣品制備前要搖勻;結(jié)晶樣品溶解后攪拌均勻，如有結(jié)晶析出的蜂蜜樣品，需將樣品的瓶蓋旋緊后置于水?。囟炔怀^60 ℃）中溫?zé)?，待蜂蜜樣品全部溶化后攪勻、冷卻，再稱取樣品，從而保證樣品性質(zhì)的一致性。②根據(jù)檢測(cè)項(xiàng)目的不同來制樣，如堅(jiān)果炒貨食品，檢測(cè)污染物時(shí)需去殼處理，檢測(cè)添加劑時(shí)則需帶殼處理。

2.2 選擇合適的檢測(cè)方法

樣品的特性千差萬別，選擇準(zhǔn)確的檢測(cè)方法是保障結(jié)果準(zhǔn)確的必要手段，這就需要結(jié)合產(chǎn)品特性，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)要求選擇合規(guī)、合理的檢測(cè)方法。此外，應(yīng)及時(shí)關(guān)注最新出臺(tái)的標(biāo)準(zhǔn)，若有變更，則需按照變更后的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行環(huán)境、人員、設(shè)備和方法的驗(yàn)證，確認(rèn)具備實(shí)驗(yàn)?zāi)芰?，再按照變更的檢測(cè)方法進(jìn)行檢測(cè)。

2.3 對(duì)儀器、試劑進(jìn)行有效控制

2.3.1 對(duì)儀器的控制

為了保證儀器設(shè)備的日常使用和維護(hù)，檢驗(yàn)室應(yīng)指定儀器的管理人員，并明確職責(zé)。儀器的操作者必須通過培訓(xùn)、考核后上崗，熟知儀器的工作性能、操作規(guī)程和安全指標(biāo)。檢測(cè)儀器必須進(jìn)行計(jì)量檢定，檢定合格后，方能進(jìn)行檢測(cè)工作。通常要求在兩次檢定周期內(nèi)至少開展1次期間核查，針對(duì)使用頻率較高的儀器，儀器使用人員應(yīng)增加核查頻次，監(jiān)測(cè)儀器的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性，把控正常損耗對(duì)儀器檢測(cè)結(jié)果的影響。此外，做好儀器的日常維護(hù)，完成相關(guān)記錄。

2.3.2 對(duì)試劑的控制

實(shí)驗(yàn)室要有試劑管理規(guī)程，并按要求分類儲(chǔ)存，如避光、冷藏、有毒有害和易燃易爆等要有相應(yīng)的儲(chǔ)存地點(diǎn)，并明示標(biāo)簽。對(duì)于在使用或保管中的標(biāo)準(zhǔn)品需進(jìn)行期間核查，通過質(zhì)量控制保證標(biāo)準(zhǔn)品量值的準(zhǔn)確可靠以及可溯源性[6]。

2.4 優(yōu)化檢測(cè)環(huán)境

檢測(cè)環(huán)境條件對(duì)液相色譜檢測(cè)的準(zhǔn)確性有重要影響，如環(huán)境溫度的不穩(wěn)定會(huì)影響流動(dòng)相的黏度，導(dǎo)致保留時(shí)間發(fā)生變化，影響檢測(cè)結(jié)果的重現(xiàn)性[7-8]。因此，做好日常監(jiān)測(cè)和記錄，保證檢測(cè)環(huán)境符合檢測(cè)需求。同時(shí)，保持檢測(cè)環(huán)境的整潔，避免樣品間的交叉污染，有助于提高檢測(cè)效率。

2.5 提高檢測(cè)人員的操作水平

檢測(cè)員在檢測(cè)過程中應(yīng)嚴(yán)格按照法律法規(guī)及標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程都要保持科學(xué)嚴(yán)謹(jǐn)?shù)墓ぷ鲬B(tài)度，做到過程有記錄、結(jié)果可追溯。檢測(cè)機(jī)構(gòu)應(yīng)制定人員培訓(xùn)計(jì)劃，持續(xù)有效的培訓(xùn)有助于提升檢測(cè)人員的檢測(cè)水平。此外，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)多組織檢測(cè)員參加外部的能力驗(yàn)證和內(nèi)部的質(zhì)量控制考核，通過盲樣考核、比對(duì)實(shí)驗(yàn)、加標(biāo)回收和留樣復(fù)測(cè)等手段確保檢測(cè)員具備相應(yīng)的檢測(cè)能力。

2.6 檢測(cè)儀器的維護(hù)與保養(yǎng)

科學(xué)的維護(hù)和保養(yǎng)可延長(zhǎng)高效液相色譜儀的使用壽命、提高其運(yùn)行效率。①嚴(yán)格按照要求規(guī)范開關(guān)機(jī)，開機(jī)完畢后、開始檢測(cè)前要進(jìn)行全面檢查，保證設(shè)備處于良好狀態(tài)，不會(huì)對(duì)檢測(cè)產(chǎn)生不良影響。關(guān)機(jī)時(shí)切忌亂丟亂放，以免在下次使用時(shí)出現(xiàn)誤差，影響檢測(cè)結(jié)果。②注意維護(hù)實(shí)驗(yàn)室環(huán)境，不能僅在工作時(shí)保證適宜的溫度和濕度，即使不工作時(shí)也要關(guān)注實(shí)驗(yàn)室的溫度和濕度變化，以免造成設(shè)備故障或檢測(cè)數(shù)據(jù)不穩(wěn)定。

3 可疑結(jié)果的綜合分析

高效液相色譜檢測(cè)結(jié)果往往會(huì)出現(xiàn)數(shù)值不準(zhǔn)確、錯(cuò)檢（假陽性）等情況，嚴(yán)格、規(guī)范地進(jìn)行預(yù)處理是保證檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確的基礎(chǔ)。遇到可疑樣品時(shí)，應(yīng)考慮制樣是否完備，標(biāo)準(zhǔn)是否正確執(zhí)行，前處理過程是否準(zhǔn)確，判定是否合理。排除這些因素后，進(jìn)行可疑樣品復(fù)測(cè)，可采取以下手段進(jìn)一步確認(rèn)。

3.1 調(diào)整色譜條件

有的樣品比較復(fù)雜，會(huì)出現(xiàn)雜質(zhì)峰，干擾結(jié)果判定，可通過調(diào)整流動(dòng)相比例，消除雜質(zhì)峰的影響，準(zhǔn)確地進(jìn)行定性分析。例如，在檢測(cè)肉制品中的防腐劑時(shí)，按照《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中苯甲酸、山梨酸和糖精鈉的測(cè)定》（GB 5009.28—2016）的要求，流動(dòng)相為甲醇+乙酸銨，比例為5∶95，曾出現(xiàn)雜質(zhì)峰影響苯甲酸的定性，將流動(dòng)相甲醇+乙酸銨的比例調(diào)整為10∶90，雜質(zhì)峰偏離苯甲酸出峰位置，有效避免了苯甲酸的錯(cuò)檢。

3.2 加標(biāo)實(shí)驗(yàn)

在樣品前處理時(shí)添加標(biāo)準(zhǔn)品，對(duì)比保留時(shí)間、色譜峰、色譜峰面積的變化，對(duì)可疑檢測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行有效分辨。例如，在豆干樣品初測(cè)時(shí)檢出苯甲酸，根據(jù)《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》

（GB 2760—2014），豆干中不允許添加苯甲酸，因此需進(jìn)行樣品復(fù)測(cè)。通過重新制備樣，加標(biāo)復(fù)測(cè)后，苯甲酸標(biāo)液峰和干擾峰分離，判定初測(cè)為假陽性。

3.3 使用二極管陣列檢測(cè)器檢測(cè)

通過保留時(shí)間和光譜信息圖進(jìn)行綜合定性。當(dāng)保留時(shí)間附近有可疑色譜峰出現(xiàn)時(shí)，比較標(biāo)準(zhǔn)溶液光譜圖與樣品處理液光譜圖的重合性，能夠進(jìn)一步確證可疑色譜峰是否是目標(biāo)待測(cè)物。例如，按照《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中苯甲酸、山梨酸和糖精鈉的測(cè)定》（GB 5009.28—2016）中的第一法——液相色譜法，采用二極管陣列檢測(cè)器對(duì)樣品中的苯甲酸進(jìn)行測(cè)定，分別采集色譜圖和光譜圖，將樣品處理液與標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖進(jìn)行比較，以保留時(shí)間定性，若有檢出，則結(jié)合樣品與標(biāo)準(zhǔn)溶液光譜圖，從峰起點(diǎn)、峰頂點(diǎn)和峰落點(diǎn)再次確認(rèn)。若樣品光譜圖與標(biāo)準(zhǔn)溶液的光譜圖完全不重合，可確證樣品的檢出結(jié)果為假陽性;若光譜圖完全重合，可確證樣品為陽性檢出。因此，結(jié)合保留時(shí)間和光譜圖進(jìn)行綜合分析判定，可有效保證樣品檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。

3.4 液質(zhì)聯(lián)用

由于受價(jià)格和耗材的限制，高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜設(shè)備沒有得到廣泛應(yīng)用，但它的優(yōu)勢(shì)非常突出。它既能利用高效液相色譜對(duì)復(fù)雜化合物的分離能力，又綜合了高分辨率質(zhì)譜對(duì)化合物的準(zhǔn)確定性和定量，能夠同時(shí)測(cè)定多種化合物，且分析結(jié)果的靈敏性和準(zhǔn)確性都能得到保障。童蘭艷等[9]采用高效液相色譜-質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定食品中的9種甜味劑（甜蜜素、安賽蜜、糖精鈉、阿斯巴甜、阿力甜、三氯蔗糖、甜菊糖苷、愛德萬甜和紐甜），與國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法相比，分離效果好、靈敏度高，明顯提高了檢測(cè)效率。

4 結(jié)語

食品檢測(cè)面臨著新要求、新挑戰(zhàn)、新形勢(shì)，高效液相色譜技術(shù)憑借其準(zhǔn)確性高、靈敏度好、分辨率高的優(yōu)勢(shì)被廣泛應(yīng)用于農(nóng)獸藥殘留、食品添加劑、非法添加物、霉菌毒素、氨基酸和糖類檢測(cè)中，但因其操作要求高，未能廣泛普及，如很多市、縣檢測(cè)機(jī)構(gòu)的高效液相色譜儀被閑置，沒能發(fā)揮出其應(yīng)有的作用。

隨著科學(xué)技術(shù)水平的提高，不管是國(guó)家檢測(cè)機(jī)構(gòu)還是第三方檢測(cè)機(jī)構(gòu)，都在不斷完善儀器檢測(cè)管理制度。在實(shí)際操作中正確運(yùn)用高效液相色譜法的技術(shù)要點(diǎn)，使儀器的功能和特點(diǎn)最大限度地被發(fā)揮和利用，才能提高高效液相色譜技術(shù)的使用率和準(zhǔn)確率，保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，更好地監(jiān)管食品安全，真正做到讓老百姓吃得放心。

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