瑞香狼毒根提取物對(duì)蕎麥桃蚜的毒力及其作用機(jī)制

高玉蓮，王貽卉，常 靜，康 鵬，馬崇勇，韓志勇, 李海平*

(1. 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝與植物保護(hù)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010019； 2. 內(nèi)蒙古自治區(qū)草原工作站，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010020；3. 內(nèi)蒙古自治區(qū)烏拉特前旗林業(yè)和草原局草原工作站，內(nèi)蒙古 烏拉特前旗 014400)

瑞香狼毒(StellerachamaejasmeL.)屬于瑞香科(Thymelaeaceae)狼毒屬(Stellera)，民間又稱紅狼毒、饅頭花、斷腸草等，是一種多年生草本植物[1]。瑞香狼毒因其強(qiáng)競(jìng)爭(zhēng)性而成為優(yōu)勢(shì)種，在草原上擴(kuò)散蔓延，是影響草原退化的主要植物種群之一[2]。該植物全株有毒，以根的毒性最大，據(jù)《中國(guó)土農(nóng)藥志》記載，我國(guó)民間常將其根粉用于害蟲防治[3]。近些年的研究表明，瑞香狼毒對(duì)菜粉蝶(Pierisrapae)、蚜蟲、螨等多種害蟲都具有較強(qiáng)的殺蟲活性[4]。

蕎麥(FagopyrumesculentumMoench)起源于中國(guó)，栽培歷史悠久，是全世界重要的雜糧作物之一，主要種植于中國(guó)、俄羅斯、日本、波蘭等國(guó)。蕎麥具有抗旱、耐瘠、適應(yīng)性強(qiáng)、生育期短等特點(diǎn)，是我國(guó)生態(tài)脆弱地區(qū)重要的糧食、飼草飼料及救荒作物[5]。蕎麥全身是寶，其中苦蕎具有降血脂、降血糖、降尿糖、療胃疾和改善便秘的營(yíng)養(yǎng)保健功能，其預(yù)防和治療高血壓的功能是其他作物不可比擬的，因此被認(rèn)為是21世紀(jì)人類重要的健康食物資源[6-8]。

蕎麥抗逆性很強(qiáng)，病蟲草害較其它作物相對(duì)較少、較輕。近年來(lái)隨著人們生活水平的提高和對(duì)蕎麥保健功能的進(jìn)一步認(rèn)知，蕎麥種植面積不斷擴(kuò)大，部分地區(qū)連年耕作，規(guī)模化生產(chǎn)，病蟲害也有逐漸加重的趨勢(shì)[8]。蕎麥上的害蟲主要有螨(二斑葉螨Tetranychusurticae、截形葉螨Tetranychustruncatus)，蚜蟲(桃蚜Myzuspersicae、棉蚜Aphisgossypii)，花薊馬(Frankliniellaintonsa)，西伯利亞龜象(Rhinoncussibiricus)以及草地螟(Loxostegesticticalis)等[9-10]。其中蚜蟲和花薊馬是蕎麥花期的主要害蟲，而蕎麥花期占蕎麥整個(gè)生長(zhǎng)期的2/3左右，對(duì)蕎麥產(chǎn)量影響很大[11-12]。近年內(nèi)蒙古地區(qū)蕎麥上蚜蟲災(zāi)害發(fā)生較重，其中桃蚜危害最重。為保證蕎麥的產(chǎn)量，同時(shí)兼顧蕎麥的綠色保健功能，對(duì)蚜蟲進(jìn)行綠色有效防控是非常重要的。因此，本論文研究了瑞香狼毒根提取物對(duì)蕎麥桃蚜的毒力及其作用機(jī)制，為未來(lái)利用瑞香狼毒防治蕎麥桃蚜提供一定的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

瑞香狼毒根于2018年8月采自內(nèi)蒙古烏蘭察布四子王旗草原，將采集到的瑞香狼毒根清洗干凈并充分陰干，用粉碎機(jī)粉碎，置于陰涼干燥處保存?zhèn)溆谩?/p>

供試蚜蟲為實(shí)驗(yàn)室蕎麥上飼養(yǎng)的桃蚜。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1瑞香狼毒根石油醚提取物的制備 采用常溫浸泡法，用小型粉碎機(jī)(永康紅太陽(yáng)機(jī)電有限公司，浙江)將陰干的瑞香狼毒根粉末過(guò)40目篩，按照料液比為1∶8(g∶mL)加入石油醚，浸泡72 h后過(guò)濾，將提取液置旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海比朗儀器有限公司，上海)上進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，蒸掉大部分石油醚后，將剩余提取物取出自然揮干至膏狀，保存在4℃冰箱備用。

1.2.2瑞香狼毒根石油醚提取物對(duì)桃蚜的毒力測(cè)定 將提取物溶解于少量95%乙醇并用水溶液稀釋成5個(gè)不同的濃度(500，1 000，2 000，4 000，8 000 mg·L-1)，以不加提取物的相應(yīng)溶液為對(duì)照。參考張炳宗[13]的方法，用浸蟲浸葉法測(cè)定毒力。采集蟲口密度大的蕎麥葉，仔細(xì)挑選健康的無(wú)翅成蚜(50頭左右)留在葉面上，將帶蟲的蕎麥葉浸入待測(cè)溶液6～7 s后取出，瀝干，置于鋪有濾紙的培養(yǎng)皿(直徑9 cm)中，放置于(25±1)℃的光照培養(yǎng)箱內(nèi)飼養(yǎng)，每一濃度重復(fù)3次，24 h后記錄死亡情況。以解剖針輕觸蟲體無(wú)任何反應(yīng)記為死亡，計(jì)算死亡率和校正死亡率。用POLO Plus軟件計(jì)算致死中濃度LC50值及95%置信區(qū)間。

1.2.3瑞香狼毒根石油醚提取物處理桃蚜后其體內(nèi)靶標(biāo)酶活性的測(cè)定 乙酰膽堿酯酶(Acetylcholinesterase，AChE)是昆蟲體內(nèi)重要的神經(jīng)傳遞物質(zhì)乙酰膽堿的裂解酶，也是很多殺蟲劑的重要靶標(biāo)酶。采用高希武[14]的方法對(duì)乙酰膽堿酯酶(AChE)活性進(jìn)行測(cè)定。

腺苷三磷酸酶(Adenosine triphosphatase，ATPase)是一類膜結(jié)合酶，該酶系參與釋放能量供細(xì)胞使用的同時(shí)，還參與細(xì)胞基本代謝和生理活動(dòng)，特別是對(duì)于維持細(xì)胞膜內(nèi)外離子濃度梯度有著非常重要的作用，被認(rèn)為細(xì)胞毒性的敏感指標(biāo)。腺苷三磷酸酶活性測(cè)定按照ATPase測(cè)試盒說(shuō)明進(jìn)行。

1.2.4瑞香狼毒根石油醚提取物處理后桃蚜解毒酶活性的測(cè)定 昆蟲在受到外界各種有毒物質(zhì)的傷害時(shí)，解毒酶系會(huì)發(fā)揮其解毒作用。谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(Glutathione-S-transferase，GSTs)、細(xì)胞色素P450(Cytochrome P450，CYP450)和羧酸酯酶(Carboxylesterase，CarE)被認(rèn)為是昆蟲體內(nèi)的主要解毒酶。谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶活性測(cè)定參照Habig等方法[15]；細(xì)胞色素P450活性的測(cè)定參照Brogdon等和Tiwari等的方法[16-17]；羧酸酯酶活性測(cè)定參照Van Aspern的方法測(cè)定并略有改動(dòng)[18]。

1.2.5酶源蛋白含量測(cè)定 為計(jì)算靶標(biāo)酶和解毒酶的活性，需要測(cè)定酶原蛋白質(zhì)含量。采用考馬斯亮藍(lán)G-250法測(cè)定蛋白含量[19]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 2010軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和繪圖，采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析(One-Way ANOVA)和差異顯著性檢驗(yàn)(LSD)，其顯著水平設(shè)為P<0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 瑞香狼毒根石油醚提取物對(duì)桃蚜的毒殺活性

由表1可知，隨著瑞香狼毒根石油醚提取物濃度增大，桃蚜的死亡率和校正死亡率逐漸增加。24 h瑞香狼毒根石油醚提取物對(duì)桃蚜致死中濃度為1 243.7 mg·L-1。

表1 瑞香狼毒根石油醚提取物對(duì)桃蚜的毒力Table 1 Toxicity of petroleum ether extract from Stellera chamaejasme root to Myzus persicae

2.2 瑞香狼毒根石油醚提取物處理對(duì)桃蚜體內(nèi)靶標(biāo)酶活性的影響

2.2.1對(duì)乙酰膽堿酯酶(AChE)的影響 如圖1所示，桃蚜經(jīng)瑞香狼毒根石油醚提取物處理24 h后，其體內(nèi)的AChE活性與對(duì)照相比均顯著降低(P<0.05)，抑制程度與處理濃度沒有直接的相關(guān)性。濃度為1 000 mg·L-1時(shí)，AChE活性最低，與對(duì)照相比降低了21.7%。

圖1 瑞香狼毒根石油醚提取物處理對(duì)桃蚜乙酰膽堿酯酶活性的影響Fig.1 Effect of petroleum ether extract from Stellera chamaejasme root on AChE activity of Myzus persicae注：不同字母表示差異顯著(P<0.05)。下圖同Note:Different letters mean significant difference at the 0.05 level. The same as below

2.2.2對(duì)腺苷三磷酸酶(ATPase)的影響 圖2顯示瑞香狼毒根石油醚提取物處理對(duì)桃蚜ATPase活性的影響。如圖所示，隨瑞香狼毒根石油醚提取物濃度的增大，桃蚜體內(nèi)Na+-K+-ATPase和Ca2+-Mg2+-ATPase活性上升，在濃度為4 000 mg·L-1時(shí)達(dá)到最大值，分別為0.01和0.006 2 μmolPi·mg-1·h-1，其活性分別是對(duì)照的12.0，1.8倍，顯著高于對(duì)照(P<0.05)。之后隨著提取物濃度的增加活性下降，但仍顯著高于對(duì)照。

圖2 瑞香狼毒根石油醚提取物處理對(duì)桃蚜ATPase活性的影響Fig.2 Effect of petroleum ether extract from Stellera chamaejasme root on ATPase activity of Myzus persicae

2.3 瑞香狼毒根石油醚提取物對(duì)桃蚜解毒酶活性的影響

2.3.1對(duì)谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GSTs)的影響 如圖3所示，瑞香狼毒根石油醚提取物處理桃蚜后，對(duì)桃蚜體內(nèi)GSTs活性有明顯的誘導(dǎo)作用，不同濃度與對(duì)照相比均有顯著增加。在濃度為500 mg·L-1時(shí)，GSTs的活性最高，為2.4 mOD·mg Pro-1·min-1，是對(duì)照的1.4倍。

圖3 瑞香狼毒根石油醚提取物處理對(duì)桃蚜谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶活性的影響Fig.3 Effect of petroleum ether extract from Stellera chamaejasme root on GSTs activity of Myzus persicae

2.3.2對(duì)細(xì)胞色素P450的影響 圖4是瑞香狼毒根石油醚提取物處理對(duì)桃蚜細(xì)胞色素P450活性的影響。隨著瑞香狼毒根石油醚提取物濃度的增大，細(xì)胞色素P450活性逐漸增大，不同濃度與對(duì)照相比均有顯著增加(P<0.05)。在濃度為8 000 mg·L-1時(shí)，細(xì)胞色素P450活性最大，是對(duì)照的1.3倍。

圖4 瑞香狼毒根石油醚提取物處理對(duì)桃蚜細(xì)胞色素P450活性的影響Fig.4 Effect of petroleum ether extract from Stellera chamaejasme root on cytochrome P450 activity of Myzus persicae

2.3.3對(duì)羧酸酯酶(CarE)的影響 在瑞香狼毒根石油醚提取物的影響下，桃蚜體內(nèi)羧酸酯酶活性下降，除最大濃度8 000 mg·L-1外，CarE活性與對(duì)照均有顯著差異(P<0.05)(圖5)。

3 討論與結(jié)論

近年來(lái)，隨著人們生活水平和對(duì)食品安全要求的提高，病蟲害的綠色防控技術(shù)越來(lái)越受到重視，綠色農(nóng)藥的概念被提出并在實(shí)踐中不斷發(fā)展應(yīng)用。植物源農(nóng)藥是直接利用具有生物活性的植物或提取其有效成分制成的，已成為病蟲害綠色防控技術(shù)中綠色農(nóng)藥的重要組成部分[20]。

圖5 瑞香狼毒根石油醚提取物處理對(duì)桃蚜羧酸酯酶活性的影響Fig.5 Effect of petroleum ether extract from Stellera chamaejasme root on the CarE activity of Myzus persicae

很早以前人們就發(fā)現(xiàn)瑞香狼毒的殺蟲作用，并在生產(chǎn)中加以應(yīng)用。隨著科技的進(jìn)步，瑞香狼毒的殺蟲作用進(jìn)一步得到研究證實(shí)。陳梅等[21]研究發(fā)現(xiàn)瑞香狼毒根石油醚提取物對(duì)朱砂葉螨(Tetranychuscinnabarinus)有很好的觸殺活性，當(dāng)瑞香狼毒根石油醚提取物濃度為2 mg·mL-1時(shí)，朱砂葉螨的校正死亡率為83.9%。陳瓊等[22]的研究表明，瑞香狼毒Ⅰ段粗分物對(duì)東亞飛蝗(Locustamigratoria)具有較強(qiáng)的毒殺作用，在粗分物濃度為10 mg·mL-1，72 h時(shí)對(duì)東亞飛蝗的校正死亡率為92.5%。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，瑞香狼毒不同溶劑提取物殺蟲程度不同。熊納納等[23]研究了狼毒石油醚、氯仿、乙酸乙酯以及水等4種不同溶劑提取物的殺煙蚜活性，其中，石油醚提取物的殺煙蚜活性最好，在濃度為0.5 mg·mL-1，12 h時(shí)蚜蟲全部死亡。本試驗(yàn)采用瑞香狼毒根石油醚提取物對(duì)蕎麥上的桃蚜進(jìn)行毒力測(cè)定，其LC50為1 243.7 mg·L-1。相對(duì)于他人研究結(jié)果，本試驗(yàn)對(duì)昆蟲的致死中濃度較大。高漫璐等[24]研究瑞香狼毒根石油醚提取物對(duì)東亞飛蝗毒力，結(jié)果顯示對(duì)東亞飛蝗有拒食、胃毒、觸殺等作用，其中拒食作用較大，而48 h的觸殺和胃毒作用分別為2 599.9，11 770 mg·mL-1。這些研究結(jié)果說(shuō)明，瑞香狼毒根石油醚提取物可能含有多種殺蟲成分，對(duì)不同昆蟲的殺滅成分及效果不同，必須分離其主要?dú)⑾x成分，才能進(jìn)一步開發(fā)作為殺蟲劑使用。

眾多研究表明，大量的天然產(chǎn)物和植物提取物具有抑制昆蟲AChE活性的作用?？飩鞲坏萚25]研究發(fā)現(xiàn)，八角茴香(Illiciumverum)提取物抑制了桃蚜的AChE活性，梁為等[26]研究發(fā)現(xiàn)瑞香狼毒超臨界CO2萃取物對(duì)朱砂葉螨AChE有較好的抑制作用，抑制率最高達(dá)50.1%。本試驗(yàn)研究結(jié)果表明，用瑞香狼毒石油醚提取物處理桃蚜后，桃蚜體內(nèi)AChE的活性降低，與陳義娟[27]研究香樟(Cinnamomumcamphora)葉提取物中殺螨活性物質(zhì)的作用機(jī)理結(jié)果相似；但和有機(jī)化學(xué)殺蟲劑如有機(jī)磷、氨基甲酸酯類殺蟲劑對(duì)AChE的絕對(duì)抑制作用不同，對(duì)AChE的抑制率較低。本結(jié)果表明瑞香狼毒根石油醚提取物處理桃蚜后，對(duì)桃蚜體內(nèi)AChE活性有一定的抑制。

ATPase是菊酯類殺蟲劑的主要作用靶標(biāo)之一[28]。張叢等[29]研究發(fā)現(xiàn)4種菊酯類殺蟲劑對(duì)枸杞蚜蟲2種ATPase活性均有抑制作用，Li等[30]研究發(fā)現(xiàn)，3種除蟲菊酯類殺蟲劑對(duì)擬水狼蛛(Piratasubpiraticus)和二化螟(Chilosuppressalis)體內(nèi)Na+-K+-ATPase和Ca2+-Mg2+-ATPase活性均表現(xiàn)出抑制作用，但抑制率最高均不超過(guò)50%。梁為等[26,31]研究瑞香狼毒對(duì)朱砂葉螨的毒理機(jī)制，瑞香狼毒超臨界CO2萃取物和天然化合物東莨菪素都能夠顯著抑制朱砂葉螨Na+-K+-ATPase和Ca2+-Mg2+-ATPase的活性，其中瑞香狼毒超臨界CO2萃取物對(duì)兩者的抑制率高達(dá)44.5%和67.1%。本文研究表明，用瑞香狼毒根石油醚提取物處理桃蚜后，對(duì)桃蚜體內(nèi)的Na+-K+-ATPase和Ca2+-Mg2+-ATPase活性均表現(xiàn)為誘導(dǎo)作用。由此推測(cè)，ATPase可能不是瑞香狼毒對(duì)桃蚜作用的靶標(biāo)酶，但還需要進(jìn)一步研究證實(shí)。

殺蟲劑一方面作用于昆蟲的靶標(biāo)系統(tǒng)，殺死昆蟲；另一方面，昆蟲也會(huì)對(duì)這些有毒物質(zhì)進(jìn)行代謝，降低殺蟲劑對(duì)昆蟲的作用。谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GSTs)、細(xì)胞色素P450酶和羧酸酯酶(CarE)是昆蟲體內(nèi)3種重要的解毒酶，在昆蟲對(duì)外源有毒物質(zhì)的解毒代謝中發(fā)揮重要作用。陳德霞等[32]研究發(fā)現(xiàn)，亞洲小車蝗(Oedaleusasiaticus)取食次生代謝物質(zhì)如黃酮、單寧、生物堿等含量低的牧草，體內(nèi)解毒酶活性也低，反之亦然。有研究表明4種植物源化合物處理亞洲小車蝗后，亞洲小車蝗體內(nèi)GSTs,CYP450和CarE活性較對(duì)照均明顯增加[33]；棉鈴蟲(Helicoverpaarmigera)取食棉酚含量高的寄主植物后，CYP450活性顯著升高[34]?，F(xiàn)有的研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，瑞香狼毒體內(nèi)含有多種植物次生代謝物質(zhì)，如：黃酮類、萜類、香豆素類等。本試驗(yàn)中，瑞香狼毒根石油醚提取物不同濃度處理桃蚜后，桃蚜體內(nèi)GSTs和細(xì)胞色素P450活性均顯著高于對(duì)照，且桃蚜體內(nèi)細(xì)胞色素P450活性與瑞香狼毒根石油醚提取物的濃度呈顯著正相關(guān)關(guān)系。說(shuō)明瑞香狼毒根石油醚提取物進(jìn)入桃蚜體內(nèi)，誘導(dǎo)桃蚜體內(nèi)解毒酶特別是細(xì)胞色素P450和GSTs的活性增加，增強(qiáng)對(duì)瑞香狼毒提取物的代謝，從而降低了瑞香狼毒對(duì)桃蚜的毒性。

奚廣生和李海濤[35]研究表明，人參(Panaxginseng)莖葉、根部皂苷對(duì)桃蚜體內(nèi)的CarE有明顯的抑制作用；吳德東等[36]研究北烏頭(Aconitumkusnezoffii)乙酸乙酯萃取物亞致死劑量對(duì)舞毒蛾(Lymantriadispar)幼蟲的影響，舞毒蛾幼蟲CarE活性受到抑制，抑制程度隨處理時(shí)間延長(zhǎng)逐漸加強(qiáng)。本文研究結(jié)果表明，瑞香狼毒根石油醚提取物抑制了桃蚜體內(nèi)的CarE活性。曹威[37]研究發(fā)現(xiàn)瑞香狼毒素對(duì)棉蚜CarE活性有一定的抑制作用，但不明顯，與本文研究結(jié)果相似。CarE活性受到抑制后，其解毒能力降低，可延長(zhǎng)外源毒物在體內(nèi)的存留時(shí)間，并發(fā)揮其毒效而致昆蟲中毒死亡，因此CarE活性受到抑制可能是瑞香狼毒提取物導(dǎo)致桃蚜死亡的原因之一。但在瑞香狼毒提取物濃度為8 000 mg·L-1時(shí)，桃蚜CarE活性的變化與其它濃度不同，活性和對(duì)照沒有顯著差異。從瑞香狼毒根石油醚提取物對(duì)桃蚜的毒力結(jié)果看，當(dāng)提取物濃度為8 000 mg·L-1時(shí)桃蚜的死亡率為97.5%，在死亡率如此高的情況下存活的桃蚜可能有抗性基因或某些基因發(fā)生突變。植物源化合物是否和其他有毒化合物一樣影響昆蟲的基因表達(dá)或改變昆蟲信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，還需要通過(guò)研究提取物對(duì)桃蚜CarE的體外抑制和基因表達(dá)，才能進(jìn)一步了解。

植物源殺蟲劑由于其體內(nèi)次生代謝物質(zhì)種類繁多、性質(zhì)多樣，對(duì)不同昆蟲的作用程度和機(jī)理也不盡相同。同時(shí)害蟲對(duì)外源性有害物質(zhì)侵入的反應(yīng)機(jī)制也是多樣的，昆蟲通過(guò)各種生物功能的酶系及解毒、代謝系統(tǒng)相互交織聯(lián)系、補(bǔ)充而起到解毒作用[38]。瑞香狼毒對(duì)多種昆蟲具有毒殺作用，但可能對(duì)每種昆蟲的主要?dú)⑾x成份不同，因而殺蟲機(jī)理也各不相同。未來(lái)應(yīng)進(jìn)一步明確瑞香狼毒對(duì)桃蚜的主要?dú)⑾x成份，在此基礎(chǔ)上才能研究其殺蟲機(jī)理，為未來(lái)開發(fā)瑞香狼毒作為殺蟲劑防治蕎麥桃蚜提供更好的科學(xué)依據(jù)。