添加劑對黑麥草青貯品質(zhì)及微生物數(shù)量的影響

付志慧, 格根圖*, 賈玉山, 王志軍, 孫 林, 南丁罕, 岳正山, 閆 峰，任秀珍

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)草原與資源環(huán)境學(xué)院，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部飼草栽培、加工及高效利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010019；2.內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特010031； 3.內(nèi)蒙古正奇農(nóng)牧業(yè)有限公司，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010031；4.內(nèi)蒙古民族大學(xué)農(nóng)學(xué)院，內(nèi)蒙古自治區(qū)飼用作用工程技術(shù)研究中心，內(nèi)蒙古 通遼 028000)

黑麥草(Loliumspp.)是一種生長速度快、產(chǎn)量高、品質(zhì)優(yōu)、適口性好的優(yōu)質(zhì)牧草，深受各種家畜喜愛[1]，常做青貯飼料的原料，是歐洲奶牛養(yǎng)殖的首選飼草品種。在我國，屬南方地區(qū)的優(yōu)勢草種，多用做作物倒茬、草田輪作、種草養(yǎng)畜等，但由于其在北方地區(qū)不能安全越冬的生長特性，在北方地區(qū)尚未推廣開來，但實(shí)現(xiàn)牧用黑麥草規(guī)?；s化生產(chǎn)，對于我國各地區(qū)“就地就近保障飼草料供應(yīng)，實(shí)現(xiàn)農(nóng)牧循環(huán)發(fā)展”，具有重要意義。

由于黑麥草刈割時其鮮草含水量高達(dá)80%以上，若不經(jīng)處理直接青貯容易導(dǎo)致丁酸發(fā)酵[2]。一般情況下將原料直接青貯，植物表面附生的有害微生物會在發(fā)酵進(jìn)程中水解蛋白質(zhì)，造成干物質(zhì)大量損失，從而影響青貯發(fā)酵品質(zhì)[3]。因此，在加工調(diào)制時選擇恰當(dāng)?shù)奶砑觿﹣泶龠M(jìn)青貯發(fā)酵過程或提高青貯飼料的有氧穩(wěn)定性已成為一種常規(guī)青貯手段。田允波[4]、楊雪霞[5]、Rauramaa A等[6]研究表明調(diào)制青貯飼料時添加乳酸菌外源添加劑、纖維素酶制劑等，均會改善青貯飼料的發(fā)酵品質(zhì)，促進(jìn)乳酸發(fā)酵進(jìn)程、提高青貯飼料的消化率。

青貯飼料是一個復(fù)雜的微生物共生體系[7]，牟林林等[8]研究表明青貯發(fā)酵進(jìn)程是諸多微生物共同作用的結(jié)果，這些微生物主要分為兩大類，即對發(fā)酵起著積極作用的有益微生物和降低發(fā)酵品質(zhì)的有害微生物。有益微生物包含植物乳桿菌等微生物，主要產(chǎn)生乳酸迅速降低pH值，同時包含抑制梭菌發(fā)酵的同型發(fā)酵乳酸菌和發(fā)酵糖等，還包括產(chǎn)生乳酸、乙酸和乙醇等的異型發(fā)酵乳酸菌，均能使青貯料保持良好的有氧穩(wěn)定性，延長保存時間；有害微生物包括一般好氧性細(xì)菌、霉菌和梭菌等[8]。一般好氧性細(xì)菌常分解蛋白質(zhì)和氨基酸從而產(chǎn)生NH3；霉菌較易分解糖和乳酸，會導(dǎo)致青貯料發(fā)生有氧腐??；梭菌一般在厭氧狀態(tài)下生長會分解利用糖、有機(jī)酸和蛋白質(zhì)，從而產(chǎn)生丁酸及氨等物質(zhì)，也是導(dǎo)致青貯腐敗的常見原因之一[9-10]。因此，研究青貯前后微生物數(shù)量的變化十分重要。目前，針對黑麥草青貯及添加劑對黑麥草青貯品質(zhì)的影響研究頗多，但結(jié)合添加劑對青貯品質(zhì)及青貯前后微生物數(shù)量變化的研究鮮見報道。本研究旨在探討不同添加劑對北方地區(qū)黑麥草青貯前后微生物數(shù)量的變化及發(fā)酵品質(zhì)的影響，為黑麥草在北方地區(qū)規(guī)?；a(chǎn)中選擇優(yōu)質(zhì)添加劑提供科學(xué)理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料是品種為‘特高’的多花黑麥草，于2019年5月26日種植于內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)牧草試驗(yàn)基地，同年9月2日(孕穗期)第4茬刈割，萎蔫至含水量65%左右，作為青貯原料，原料成分見表1。所用添加劑為A1(植物乳桿菌：由日本國際農(nóng)林水產(chǎn)研究中心蔡義民研究員惠贈)、A2(復(fù)合菌劑：乳酸菌+纖維素酶，購自日本雪印會社)、A3(商業(yè)菌劑：和美科盛乳酸菌標(biāo)準(zhǔn)品+糖蜜，由內(nèi)蒙古正奇農(nóng)牧業(yè)有限公司提供)。

表1 多花黑麥草原料化學(xué)成分及微生物數(shù)量Table 1 Chemical composition and microbial quantity of Italian ryegrass before ensiling

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1試驗(yàn)設(shè)計(jì) 試驗(yàn)采用單因素隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，設(shè)置4個處理，分別為對照(CK)、A1(植物乳桿菌、2.5 g·t-1)、A2(復(fù)合菌劑、17 g·t-1)、A3(商用菌劑、1 000 g·t-1)，添加量以鮮重計(jì)算，使用時活菌數(shù)106cfu·g-1，每個處理3次重復(fù)。將收獲的黑麥草萎蔫至含水量65%左右，切短至3～5 cm，攪拌均勻，裝入聚乙烯青貯袋，每袋300 g左右，采用真空封口機(jī)抽氣密封，放于室內(nèi)常溫條件下避光保存，青貯60 d后開袋，將樣品混勻后進(jìn)行青貯飼料感官評價、營養(yǎng)品質(zhì)、發(fā)酵品質(zhì)及微生物數(shù)量分析。

1.2.2樣品處理 青貯60 d后開袋取樣，將樣品攪拌混合均勻，稱取10 g樣品與90 mL無菌水混合均勻，放入拍打袋中用均質(zhì)拍打器(品牌為凈信，上海凈信實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司購買)拍打120 s，制備浸提液，用定性濾紙過濾后置于離心管中于-35℃冰箱保存待測發(fā)酵品質(zhì)。另取10 g樣品置于三角瓶中，加入90 mL無菌水、無菌生理鹽水(0.85%NaCl)，用封口膜封口，用于測定微生物數(shù)量。將剩余青貯樣品收集置大號信封紙袋中，105℃烘箱中殺青30 min后再將溫度調(diào)至65℃烘干48 h至恒重，用于待測營養(yǎng)品質(zhì)。

1.3 測定指標(biāo)及方法

1.3.1感官品質(zhì)評價 根據(jù)德國農(nóng)業(yè)協(xié)會(DLG)感官青貯評定方法及等級標(biāo)準(zhǔn)[8]從氣味、結(jié)構(gòu)、色澤3方面進(jìn)行評價，滿分為20分，20～16分為優(yōu)良，15～10分為尚好，9～5分為中等，4～0分為腐敗，評定標(biāo)準(zhǔn)見表2。

表2 青貯飼料感官品質(zhì)評定標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Sensory quality evaluation standards of silage

1.3.2營養(yǎng)品質(zhì)測定 采用烘干法[11]進(jìn)行干物質(zhì)(Dry matter，DM)含量的測定；使用FOSSKJ2300型全自動定氮儀進(jìn)行粗蛋白質(zhì)(Crude protein，CP)含量測定[11]；采用GB6439-92燃燒法進(jìn)行有機(jī)物(Organic matter，OM)含量測定[11]；采用ANKOMA2000i全自動纖維儀進(jìn)行中性洗滌纖維(Neutral detergent fiber，NDF)含量測定[12]；采用蒽酮-硫酸比色法進(jìn)行可溶性碳水化合物(Water soluble carbohydrates，WSC)含量測定[13]。

1.3.3發(fā)酵品質(zhì)測定 用pH計(jì)測定取樣品處理時制備的浸提液的pH值[14]；使用高效液相色譜儀(HPLC)測定乳酸(Lactic acid，LA)、乙酸(Acetic acid，AA)、丙酸(Propionic acid，PA)和丁酸(Butyric acid，BA)含量，并計(jì)算乳酸/乙酸(LA/AA)及總酸(Total acid，TA)的含量，從而分析濾液中的有機(jī)酸的含量[15]；氨態(tài)氮(NH3-N)含量用苯酚-次氯酸鈉比色法測定[15]。以氨態(tài)氮和揮發(fā)性脂肪酸(Volatile fatty acid，VFA)為評價指標(biāo)，選用日本草地畜產(chǎn)協(xié)會(2001)制定的青貯飼料發(fā)酵品質(zhì)V-Score評分標(biāo)準(zhǔn)[16]。

1.3.4微生物數(shù)量測定 用樣品處理時制備的待測微生物數(shù)量的菌液，稀釋10-1，10-3，10-5，采用平板計(jì)數(shù)法計(jì)算微生物數(shù)量[17]。乳酸菌采用乳酸菌固體(De Man，Rogosa and Sharpe，MRS)培養(yǎng)基，霉菌和酵母菌采用馬鈴薯葡萄糖瓊脂(Potato Dextrose Agar，PDA)培養(yǎng)基，大腸桿菌采用大腸菌群液體顯色(Blue Light Broth Agar，BLB)培養(yǎng)基，一般好氧性細(xì)菌采用營養(yǎng)瓊脂(Nutrient Agar，NA)培養(yǎng)基，乳酸菌30℃厭氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后計(jì)數(shù)，酵母菌、霉菌、一般好氧性細(xì)菌、大腸桿菌置于30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后計(jì)數(shù)，所有微生物數(shù)據(jù)采用lg(cfu)·g-1of FM表示[18]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

利用Excel 2016進(jìn)行試驗(yàn)數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)整理與表格繪制，使用SAS 9.4進(jìn)行單因素方差分析(One-way ANOVA)，平均值間差異顯著性用Duncan氏法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同添加劑對青貯飼料感官品質(zhì)的影響

由表3可知，添加劑處理組的青貯飼料感官評分均高于CK，其中A2得分最高為19分，其芳香味較濃，莖葉結(jié)構(gòu)保持良好；A3得分略低于A2，其有明顯的芳香味；A1得分低于A3，其芳香味次于A3，莖葉結(jié)構(gòu)稍有改變，但不明顯；添加添加劑處理的青貯色澤與原料相似，烘干后呈淡褐色，A2，A3總體表現(xiàn)為1級(優(yōu)良)，A1，CK表現(xiàn)為2級(尚好)。

表3 不同添加劑處理對青貯飼料感官品質(zhì)評價結(jié)果Table 3 Evaluation results of sensory quality of silage in different additive treatments

2.2 不同添加劑對青貯飼料營養(yǎng)品質(zhì)的影響

由表4可知，青貯60 d后，A1，A2和A3的DM含量均顯著低于CK(P<0.05)。A1處理組的CP含量高于CK,A2和A3，各處理組同CK之間差異不顯著。各處理組的OM含量從高到低分別為CK>A1>A2>A3，各處理組同CK相比差異不顯著。各處理組的NDF含量從高到低依次為A3>CK>A1>A2，其中A2的含量顯著低于A3(P<0.05)。A1，A2，A3的WSC含量顯著低于CK(P<0.05)。

2.3 不同添加劑對青貯飼料發(fā)酵品質(zhì)的影響

由表5可知，各添加劑處理組的pH值均顯著低于CK(P<0.05)，且均低于4.2。A1,A3的LA含量顯著低于CK(P<0.05)，A2的LA含量最高，為88.38 g·kg-1，顯著高于CK,A1和A3(P<0.05)。A3的AA含量最低，為2.38 g·kg-1，顯著低于CK,A1和A2(P<0.05)。A2,A3的BA含量均顯著低于CK和A1(P<0.05)。A1，A3的總酸含量顯著低于CK(P<0.05)，A2的總酸含量高于CK，但差異不顯著；A2的LA/AA的比值最高，且顯著高于CK(P<0.05)；各處理組的NH3-N含量均高于CK，其中A1和A3顯著高于CK(P<0.05)。

表5 不同添加劑處理對青貯飼料發(fā)酵品質(zhì)的影響Table 5 The effects of different additives on the fermentation quality of silage

2.4 不同添加劑對青貯飼料微生物數(shù)量的影響

由表6可知：青貯60 d開袋后，各處理組乳酸菌的數(shù)量均高于CK，但差異不顯著，其中A3乳酸菌數(shù)量最多，為8.58(lg(cfu)·g-1FW)；酵母菌、霉菌及大腸桿菌均未檢測到；A3中一般好氧性細(xì)菌的數(shù)量顯著低于CK和A1(P<0.05)，且為最低，A2較CK一般好氧性細(xì)菌數(shù)量下降，但差異不顯著。

表6 不同添加劑處理對青貯飼料微生物數(shù)量的影響Table 6 The effects of different additive treatments on the microbial population of silage

2.5 不同添加劑青貯飼料的V-Score評分

由表7可知,A1，A3組氨態(tài)氮/總氮顯著高于CK(P<0.05)，A2，A3組乙酸+丙酸的含量小于0.5%，各處理組的丁酸含量均在0.5%以下，其中A2的丁酸含量最低，計(jì)算得到的V-Score評分值最高，為86.26分，評分等級為良好。

表7 不同添加劑青貯飼料的V-Score評分Table 7 V-Score scores of different additive silages

3 討論

3.1 不同添加劑處理對青貯飼料感官品質(zhì)的影響

感官評價方法簡潔易行，由于不需要任何儀器設(shè)備，所以在生產(chǎn)應(yīng)用中比較常見[19]。高品質(zhì)的青貯料在嗅覺上具有酸香味，不僅莖、葉結(jié)構(gòu)保存較完整，而且在顏色上也呈現(xiàn)黃綠色，與原料較接近[19]。本研究結(jié)果表明，添加外源添加劑的各處理組青貯飼料感官評分均高于CK，其中A2,A3感官品質(zhì)均評價為優(yōu)良。說明在調(diào)制青貯飼料時，添加劑的介入能明顯改善青貯飼料的感官品質(zhì)。

3.2 不同添加劑處理對青貯飼料營養(yǎng)品質(zhì)的影響

營養(yǎng)成分是反映飼草利用價值的重要指標(biāo)[18]。在青貯過程中，由于參與發(fā)酵進(jìn)程的乳酸菌需要水分來促進(jìn)其生長和繁殖，所以DM含量對青貯發(fā)酵有很大影響[20]。在本研究中，隨著添加劑的加入，各處理組DM含量均顯著低于CK，說明在青貯發(fā)酵過程中DM均有損耗，有研究表明，在青貯發(fā)酵的有氧階段，有氧微生物的生長而帶來的DM損失通常是不可避免的[21]，這也是由于乳酸菌和纖維素酶都是促進(jìn)發(fā)酵型添加劑，在發(fā)酵進(jìn)程中乳酸菌和纖維素酶會使青貯飼料迅速發(fā)酵，因而增加了對DM的消耗。NDF是反映飼料纖維質(zhì)量優(yōu)劣的關(guān)鍵指標(biāo)之一，其含量高低在實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用中可作為估測奶牛日糧精粗比是否合適的重要依據(jù)[18]。A2處理組的NDF含量低于對照組，這可能是微生物發(fā)酵將纖維素分解形成揮發(fā)性脂肪酸[22]。在青貯料中添加含有纖維素酶成分的添加劑有助于促進(jìn)植物細(xì)胞壁的快速分解，從而使植物纖維成分含量下降，改善牧草的營養(yǎng)價值，進(jìn)一步提高其利用價值[23]。司丙文等[23]研究發(fā)現(xiàn)添加酶菌復(fù)合制劑有助于NDF的降解，在本試驗(yàn)中A2處理組NDF含量最低，此研究結(jié)果與其研究結(jié)果保持一致。A3處理組中加入添加劑后NDF含量上升，這與丁武蓉等[24]研究結(jié)果不一致，可能是由于青貯原料與添加劑中乳酸菌種類不同有關(guān)。WSC是產(chǎn)生乳酸以降低酸堿度的乳酸菌生長過程中的重要底物[20]，在本研究中各處理組的WSC含量顯著低于對照組，說明外源添加劑的加入提高了乳酸菌在發(fā)酵進(jìn)程中對底物的利用效率，其中A1處理組的WSC含量顯著最低，說明加入乳酸菌添加劑后，乳酸菌在發(fā)酵過程中利用了更多的WSC作為底物去調(diào)控整個發(fā)酵過程，導(dǎo)致A1處理組的青貯料中剩余的WSC含量較少，這與劉輝等[25]研究結(jié)果一致。

3.3 不同添加劑處理對青貯發(fā)酵品質(zhì)的影響

添加劑是影響青貯發(fā)酵品質(zhì)的關(guān)鍵要素，不同的添加劑處理，青貯料的品質(zhì)也不相同[26]。在本研究中，隨著添加劑的加入，與對照相比，各處理組pH值顯著降低，且均低于4.2，說明各添加劑處理有效的改善了黑麥草青貯的發(fā)酵品質(zhì)。其中A2處理組pH值最低，主要是由于纖維素酶對青貯料細(xì)胞壁的破壞作用，使細(xì)胞內(nèi)容物順利流出，保證乳酸菌發(fā)酵時底物充足，使得乳酸菌充分發(fā)酵從而產(chǎn)生大量的乳酸以降低pH值，從而進(jìn)一步提高發(fā)酵品質(zhì)[24]，丁武蓉等[24]也得到相同的研究結(jié)果。V-Score評分體系是評價青貯飼料發(fā)酵品質(zhì)常用且重要方法之一[25]，PA作為青貯飼料中重要的揮發(fā)性脂肪酸，其具有抗真菌的作用，能夠有效的抑制青貯料的好氧腐敗，有利于保存青貯飼料營養(yǎng)成分[27]。本研究中，各處理組的PA含量均高于對照組，且A2組的PA含量最高，BA含量顯著低于其他處理組及對照組，且為最低；A2組中總酸的含量高于對照組，但差異不顯著，王繼成等[28]研究也提出，隨著酶量的增加，青貯飼料中總有機(jī)酸含量有提高的趨勢，本試驗(yàn)結(jié)果與其基本一致。本試驗(yàn)中，A2組中LA含量顯著高于CK及其他處理組，且V-Score評分最高，等級為良好，說明A2組的發(fā)酵品質(zhì)最好。青貯飼料中NH3-N的產(chǎn)生主要由于植物酶對蛋白質(zhì)的降解和微生物分解利用蛋白質(zhì)和氨基酸共同作用的結(jié)果[24]，以此來反映青貯料中蛋白質(zhì)的降解程度。A1處理組中，AA含量上升，LA含量下降，這可能與異型發(fā)酵中乳酸菌發(fā)酵將LA一部分轉(zhuǎn)化為AA的發(fā)酵特性有關(guān)[29]，AA含量的升高對提高青貯飼料的有氧穩(wěn)定性起著至關(guān)重要的作用[30]。前人研究表明，AA和PA均能抑制好氣菌生長引起的青貯料腐敗變質(zhì)[31]。

3.4 不同添加劑處理對青貯飼料微生物數(shù)量的影響

青貯料中乳酸菌的數(shù)量多少直接影響青貯發(fā)酵品質(zhì)好壞，乳酸菌的生命代謝活動是青貯能否成功發(fā)酵的重要因素之一[18,32-33]。在本研究中，隨著添加劑的加入，乳酸菌的含量均高于對照組，與陳雷等[34]研究結(jié)果一致。各處理組中，A2組與A3組一般好氧性細(xì)菌數(shù)量均低于對照組，有害微生物數(shù)量的降低從某種程度上減少了青貯飼料的耗氧腐敗，減少了DM的損失[35]，提高了發(fā)酵品質(zhì)。

4 結(jié)論

研究發(fā)現(xiàn)，3種添加劑對黑麥草青貯發(fā)酵品質(zhì)以及微生物數(shù)量都有不同程度的改善，A2組的感官評定為優(yōu)良，V-Score評分等級為良好，乳酸菌數(shù)量最多，一般好氧性細(xì)菌數(shù)量最少；為了提高黑麥草青貯飼料的感官品質(zhì)、營養(yǎng)品質(zhì)和發(fā)酵品質(zhì)同時減少發(fā)酵過程中有害微生物的數(shù)量，增加有益微生物數(shù)量，在制作青貯飼料時添加復(fù)合菌劑(乳酸菌+纖維素酶)的效果最好。