黃瀟航，李詩藝，李永霞，李夢蕊，賀金峪，張 龍，劉道泉，江和基，黃志堅(jiān)，殷光文

(1.福建農(nóng)林大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院(蜂學(xué)學(xué)院)，福州 350002；2.福建省動(dòng)物藥物工程實(shí)驗(yàn)室，福州 350002；3.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，福州 350013；4.福州市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，福州 350009)

中華蟾蜍屬兩棲綱蟾蜍科動(dòng)物,在中國廣泛分布。蟾皮、蟾酥、干蟾、蟾蜍頭、蟾蜍膽、蟾蜍肝等名貴中藥材均產(chǎn)自蟾蜍，在臨床應(yīng)用效果較好[1]。其中，耳后腺分泌物——蟾酥在臨床中具有抗菌、消炎等功效。蟾蜍相關(guān)成分如蟾酥、蟾蛻等均具有較高的藥用價(jià)值，目前國內(nèi)生產(chǎn)的中成藥中，“蟾酥注射液”、“復(fù)方蟾皮膠囊”等含有蟾蜍成分的中成藥已經(jīng)超過了100種[2]。

棘頭蟲是一類常見的蠕蟲，其吻部具有倒鉤小刺狀結(jié)構(gòu)，蟲體較大，肉眼可見，生活史復(fù)雜，多見其寄生于動(dòng)物腸道內(nèi)，偶見其他臟器的移行性寄生,在豬和水禽中感染較常見,大量寄生易造成動(dòng)物宿主的腸黏膜等組織器官機(jī)械性損傷，繼發(fā)炎癥。兩棲動(dòng)物棘頭蟲感染種類較為豐富，夏偉麗等[3]整理的蛙類棘頭蟲感染名錄中指出國內(nèi)在蛙體內(nèi)檢出棘頭蟲8種，隸屬于1門、2綱、2目、2科、3屬。此外，關(guān)于兩棲動(dòng)物棘頭蟲的感染報(bào)道及蛙棘頭蟲等感染情況，多數(shù)研究以形態(tài)學(xué)鑒定研究為主，分子生物學(xué)方面的研究報(bào)道相對較少。形態(tài)學(xué)鑒定對鑒定者具有較高的專業(yè)素質(zhì)要求，且對于幼蟲等生活史階段鑒別難度較大。

近年來興起的分子生物學(xué)成為了物種鑒定的一種較好的選擇，線粒體細(xì)胞色素c氧化酶亞基Ⅰ(cytochrome c oxidase subunit Ⅰ，COⅠ)對物種演化研究具有重要參考價(jià)值，該基因片段具有變異頻率高、種間差異性顯著等特點(diǎn)，目前在國內(nèi)線蟲[4]和絳蟲[5]等蠕蟲、甚至節(jié)肢動(dòng)物[6-7]的種類鑒定上已有了較成熟的應(yīng)用。本研究解剖死亡蟾蜍，在體腔臟器上發(fā)現(xiàn)了大量棘頭蟲感染現(xiàn)象，采用形態(tài)學(xué)觀察和分子生物學(xué)鑒定綜合分析，以期為兩棲類棘頭蟲等寄生蟲的分類、鑒定和遺傳變異研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器

10%中性福爾馬林溶液(4%甲醛)購自泉州泓克生物科技有限公司；滅菌生理鹽水、手術(shù)器械、蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒均購自北京索萊寶生物公司；DNA提取試劑盒(FastDNA SPIN Kit)購自MP Biomedicals公司；EasyTaqMix聚合酶購自北京全式金生物技術(shù)股份有限公司；膠回收試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司。正置白光拍照顯微鏡Eclipse Ci-L(Nikon(Japan))、掃描瀏覽軟件CaseViewer2.4(3DHISTECH(Hungary))、全景切片掃描儀PANNORAMIC DESK/MIDI/250/1000(3DHISTECH(Hungary))；SZ680連續(xù)變倍體視顯微鏡和SMAR顯微鏡均購自重慶奧特光學(xué)儀器責(zé)任有限公司。

1.2 動(dòng)物檢查

實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)的一只體重153 g的雌性藥用中華蟾蜍，形態(tài)消瘦，疑似患有寄生蟲病，拒食后發(fā)生死亡，對死亡的蟾蜍進(jìn)行剖檢發(fā)現(xiàn)，多臟器及系膜處有大量棘頭蟲感染寄生。對病死蟾蜍的皮下肌肉、口腔、咽、食道、胃、肺臟、小腸等依次進(jìn)行剖檢觀察，除了采集病理組織部分外，其余均做完全剖檢處理，并統(tǒng)計(jì)感染蟲數(shù)。

1.3 病理組織學(xué)觀察

對感染較嚴(yán)重的器官進(jìn)行蟲體感染計(jì)數(shù)后，采集部分組織樣品浸泡于10%中性福爾馬林溶液，標(biāo)本固定后由福州都拜特生物公司進(jìn)行病理組織學(xué)標(biāo)本的制備。使用HE染色方法進(jìn)行病理組織切片的制備,參照病理組織學(xué)相關(guān)分析方法對組織樣品進(jìn)行研究。

1.4 傳統(tǒng)方法檢測

采用蠕蟲剖檢法、結(jié)節(jié)壓片法、飽和食鹽水漂浮法、水洗沉淀法進(jìn)行寄生蟲檢測，用SZ680連續(xù)變倍體視顯微鏡對感染棘頭蟲的病變情況進(jìn)行觀察，并拍攝記錄。采用結(jié)節(jié)壓片法檢查腸道結(jié)節(jié)內(nèi)的棘頭蟲，并使用光學(xué)顯微鏡進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察。臨床操作及形態(tài)學(xué)鑒定參照孔繁瑤[8]方法進(jìn)行。在統(tǒng)計(jì)計(jì)數(shù)后，保存部分臟器寄生的棘頭蟲用于后期的分子生物學(xué)鑒定。

1.5 分子生物學(xué)鑒定

用DNA提取試劑盒對來自心臟、肝臟、胃、腸、生殖腺的5株蟲體進(jìn)行DNA提取，樣品編號為JS-01～JS-05，以提取的DNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)。COⅠ基因擴(kuò)增引物為LCO1490：5′-GGTCAA-CAAATCATAAAGATATTGG-3′；HCO2198：5′-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3′[7]，引物由福州尚亞生物公司合成制備。PCR反應(yīng)體系25 μL：2×FineTaqMix 酶12.5 μL，上、下游引物各1 μL,DNA模板2 μL,ddH2O8.5 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性3 min；98 ℃變性10 s，47 ℃退火30 s，68 ℃延伸1 min,共35個(gè)循環(huán)；68 ℃總延伸7 min。PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.0%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。擴(kuò)增獲得的陽性條帶切膠回收送往福州鉑尚公司進(jìn)行測序。測序后獲得的序列使用DNAMAN和Mega 7.0軟件進(jìn)行生物信息學(xué)分析，選取代表株JS-01使用DNAStar 7.0軟件進(jìn)行相似性比對分析。用Mega 7.0軟件中Neighbor-Joining(NJ)法構(gòu)建基于COⅠ基因序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹，采用Boostrad測量重復(fù)1 000次。

2 結(jié) 果

2.1 臨床剖檢結(jié)果

臨床剖檢結(jié)果發(fā)現(xiàn)，棘頭蟲寄生于蟾蜍的肺臟、肝臟、胃、卵巢、脾臟等多個(gè)臟器，未發(fā)現(xiàn)線蟲、絳蟲、吸蟲等其他臨床常見的蠕蟲寄生，初步判斷本病例中導(dǎo)致蟾蜍發(fā)生虛弱死亡的致病原為棘頭蟲。感染數(shù)量統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表1。

表1 棘頭蟲感染寄生部位及感染情況

2.2 病理組織學(xué)觀察結(jié)果

采集病理組織，HE染色結(jié)果顯示，在棘頭蟲感染寄生的部位均出現(xiàn)了較嚴(yán)重的機(jī)械損傷和炎癥反應(yīng)。病理組織學(xué)觀察結(jié)果顯示，棘頭蟲的感染造成了空腸黏膜機(jī)械性壓迫和損傷(圖1A)；肺臟寄生造成了肺臟黏膜層的機(jī)械性損傷和出血(圖1B)；肝臟寄生造成了鐵血黃素增加，充血及伴有大量的炎性反應(yīng)(圖1C)；脾臟充血腫大，鐵血黃素增加，伴有部分細(xì)胞壞死(圖1D)；心肌壞死，有炎性細(xì)胞浸潤(圖1E)；胃基底層完整，但胃黏膜嚴(yán)重脫落，且胃壁外側(cè)有大量蟲體寄生(圖1F)；腸腔道內(nèi)膜損傷較嚴(yán)重，腸絨毛完整性破壞，內(nèi)部可觀察到炎性細(xì)胞聚集(圖1G)；直腸外壁可觀察到大量的蟲體呈現(xiàn)機(jī)械性寄生，組織結(jié)構(gòu)完整性大量破壞(圖1H)；卵巢組織內(nèi)可觀察到大量寄生個(gè)體，造成卵巢組織損壞嚴(yán)重(圖1I)。

A，回腸；B，肺臟；C，肝臟；D，脾臟；E，心臟；F，胃；G，十二指腸；H，直腸；I，卵巢A,Ileum;B,Lung;C,Liver;D,Spleen;E,Heart;F,Stomach;G,Duodenum;H,Rectum;I,Ovaries圖1 蟾蜍棘頭蟲感染病理組織學(xué)觀察(100×)Fig.1 Histopathological observation on the infection of Sphaerirostris lanceoides in toad (100×)

2.3 傳統(tǒng)方法檢測結(jié)果

通過水洗沉淀法和飽和食鹽水漂浮法對腸道內(nèi)容物進(jìn)行了檢測,未發(fā)現(xiàn)蟲卵。同時(shí)采集寄生組織壓片進(jìn)行光學(xué)形態(tài)觀察，蟲體具有較長的吻部，其中具有大量的鉤刺結(jié)構(gòu)，在蟲體內(nèi)未觀察到蟲卵，初步判斷體腔內(nèi)寄生的蠕蟲為棘頭蟲(圖2)。用70%酒精溶液浸泡保存部分蟲體樣本，統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)棘頭蟲638只，其中腸、胃、膀胱、肝臟感染強(qiáng)度最高。形態(tài)學(xué)鑒定比對結(jié)果顯示，分離的棘頭蟲與似矛球吻棘頭蟲特征相符。

2.4 分子生物學(xué)鑒定結(jié)果

感染5個(gè)不同部位的5株棘頭蟲蟲株COⅠ基因PCR擴(kuò)增獲得大小約為688 bp的目的片段(圖3)。 通過拼接測序獲得條帶大小為690～710 bp，GC含量為40.14%～40.83%。使用DNAMAN進(jìn)行相似性分析，5株目的蟲株多序列比對mtCOⅠ擴(kuò)增部分片段相似性在99.80%以上，這提示獲得的5株棘頭蟲均為同一種棘頭蟲。通過NCBI數(shù)據(jù)庫下載相關(guān)物種序列用于Mega 7.0進(jìn)化樹構(gòu)建，選取目的株JS-01通過NCBI-BLAST數(shù)據(jù)庫比對，與似矛球吻棘頭蟲(MG931943.1)相似性最高，為99.5%，與其他棘頭蟲蟲種Corynosomastrumosum(LC465399.1)、Andracanthaleucocarboi(MF527023.1)mtCOI相似性分別為74.3%和73.2%。根據(jù)分子種屬相似性可初步確定獲得的蟲株為似矛球吻棘頭蟲(圖4)。由圖5可知，JS-01～JS-05形成一獨(dú)立小分支，屬間樹枝間數(shù)值大小>50，可信度高，測序的JS株樣品序列與現(xiàn)有報(bào)道的似矛球吻棘頭蟲距離最近，在親緣關(guān)系上接近于似矛球吻棘頭蟲(MG931943.1)。結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果，顯示其為似矛球吻棘頭蟲。

A，組織壓片法觀察到的棘頭蟲；B，光學(xué)顯微鏡下觀察到的棘頭蟲吻部；C，光學(xué)顯微鏡下觀察到的棘頭蟲生殖系統(tǒng)結(jié)構(gòu)A,Sphaerirostris lanceoides observed by tissue compression method;B,The head of Sphaerirostris lanceoides observed under optical microscope;C,The reproductive system structure of Sphaerirostris lanceoides observed under optical microscope圖2 棘頭蟲形態(tài)學(xué)觀察(40×)Fig.2 Morphological observation of the Sphaerirostris lanceoides (40×)

M,5K DNA Marker;1，陰性對照;2～6,分別為JS-01～JS-05M,5K DNA Marker;1，Negative control;2-6,JS-01 to JS-05,respectively圖3 COⅠ基因PCR擴(kuò)增電泳圖Fig.3 PCR amplification electrophoresis of COⅠ gene

圖4 基于JS-01株棘頭蟲COⅠ基因的相似性比對Fig.4 Similarity comparison based on COⅠ gene from Sphaerirostris lanceoides JS-01 strain

圖5 基于棘頭蟲COⅠ基因構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.5 Phylogenetic tree based on COⅠ gene of Sphaerirostris lanceoides

3 討 論

鳥類被認(rèn)為是似矛球吻棘頭蟲的終末宿主，但該蟲體也有感染其他動(dòng)物的報(bào)道[9]。Jing等[10]在2018年首次報(bào)道了似矛球吻棘頭蟲在兩棲動(dòng)物腸道中的寄生案例，但未見多臟器感染案例的相關(guān)報(bào)道。本次臨床案例中對蟾蜍腸、肺臟、肝臟、胃、卵巢、脾臟等多個(gè)臟器進(jìn)行剖檢分析，發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致蟾蜍發(fā)生虛弱死亡的寄生蠕蟲為似矛球吻棘頭蟲，腸道和生殖腺等腺體是主要的寄生感染部位，推測全身性的感染寄生由消化道寄生蟲移行導(dǎo)致。組織病理學(xué)觀察顯示，似矛球吻棘頭蟲在蟾蜍體內(nèi)的寄生表現(xiàn)為機(jī)械性損傷、炎性癥狀等，對蟾蜍造成嚴(yán)重?fù)p傷，其中以肝臟機(jī)械性損傷、腸黏膜脫落、炎性增生為典型癥狀，與李春濤等[11]報(bào)道的黃鱔棘頭蟲感染的臨床病理變化相近，表明該類棘頭蟲的感染寄生能給蟾蜍造成嚴(yán)重病理損傷。

現(xiàn)有文獻(xiàn)表明，COⅠ基因具有較為廣泛的應(yīng)用，尤其在線蟲[12-15]、絳蟲[16-18]、吸蟲[19-20]、昆蟲[21]等分子生物學(xué)研究方面。本研究對感染蟾蜍優(yōu)勢蟲種mtDNA中的COI部分片段進(jìn)行了擴(kuò)增鑒定，發(fā)現(xiàn)與似矛球吻棘頭蟲相似性超過了99.0%，而與Corynosoma、Andracantha等屬相似性不足80.0%，在系統(tǒng)進(jìn)化樹上形成明顯分支。在種內(nèi)相似性方面，測定的JS-01～JS-05多序列比對，種內(nèi)相似性則超過99.0%。似矛球吻棘頭蟲分子生物學(xué)方面的研究報(bào)道較少，本研究對COⅠ基因部分片段的擴(kuò)增研究表明，COⅠ基因種內(nèi)變異小，種間差異性較大，能在似矛球吻棘頭蟲、Corynosomastrumosum、Andracanthaleucocarboi種屬間進(jìn)行有效的區(qū)分。

棘頭蟲主要通過鼠婦等昆蟲作為中間宿主，因此野鳥、昆蟲等病原攜帶動(dòng)物在養(yǎng)殖場的活動(dòng)是圈養(yǎng)蟾蜍感染該類棘頭蟲的重要潛在途徑。筆者認(rèn)為，可通過采取架設(shè)天網(wǎng)、使用顆粒料代替昆蟲等阻斷方式來減少圈養(yǎng)蟾蜍個(gè)體的感染風(fēng)險(xiǎn)。目前在兩棲動(dòng)物寄生蟲治療方面研究報(bào)道較少，已知阿維菌素對虎紋蛙棘頭蟲的臨床驅(qū)蟲試驗(yàn)具有較好的效果[22]，但也有報(bào)道發(fā)現(xiàn)伊維菌素類似成分阿維菌素等衍生化合物會(huì)對兩棲動(dòng)物生存造成負(fù)面影響[23]，因此預(yù)防性驅(qū)蟲時(shí)應(yīng)在選藥、用量等方面予以重視。該例病蟾因感染似矛球吻棘頭蟲而發(fā)生死亡，在兩棲動(dòng)物體內(nèi)多臟器感染寄生未見相關(guān)臨床案例和組織病理學(xué)研究，本研究結(jié)果可為藥用蟾蜍棘頭蟲病的防控提供臨床癥狀、病理、分子生物學(xué)等相關(guān)參考。

4 結(jié) 論

本研究報(bào)道了蟾蜍棘頭蟲的多臟器感染，病理學(xué)研究表明棘頭蟲的感染可能是造成宿主蟾蜍虛弱、死亡的重要原因；形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)的研究表明該案例中的棘頭蟲是似矛球吻棘頭蟲。本研究結(jié)果對蟾蜍棘頭蟲病的診斷和防治具有重要的參考價(jià)值。