安志霞，潘陽陽，范碧玥，馬小燕，葉得河，張治杰，邱山桐，姚亞樂，王 萌

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,蘭州 730070)

恩諾沙星(enrofloxacin，ENR)又稱乙基環(huán)丙沙星、恩氟沙星，屬于第三代氟喹諾酮類抗菌藥，具有廣譜抗菌活性，因此被廣泛應(yīng)用于畜牧業(yè)，是動(dòng)物專用的抗菌藥[1]。ENR的抗菌機(jī)制是抑制細(xì)菌DNA旋轉(zhuǎn)酶，干擾細(xì)菌DNA的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和修復(fù)重組，使細(xì)菌不能正常生長繁殖而發(fā)揮殺菌作用[2]。ENR進(jìn)入體內(nèi)的代謝產(chǎn)物為環(huán)丙沙星。研究表明，人攝入大劑量或長期攝入含有環(huán)丙沙星的動(dòng)物源性食品可能會(huì)引起肝損傷[3]。氟喹諾酮類藥物對(duì)肝臟的損傷可能是通過產(chǎn)生過氧化物和自由基誘導(dǎo)氧化應(yīng)激產(chǎn)生的[4-6]。ENR在SD大鼠[7]、施氏鱘[8]、雞[9]等動(dòng)物模型中均有一定的肝毒性，使試驗(yàn)動(dòng)物血清中的谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine transferase，ALT)和谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartate transferase，AST)活性顯著上升[7-9]。

中藥在肝損傷疾病的防治中扮演著越來越重要的角色[10]，目前有許多中藥已被證實(shí)有良好的保肝效果。連翹是木犀科連翹屬植物，其主要以果實(shí)入藥，主要成分有苯乙醇苷類、黃酮類和木脂素類等[11]，具有抑菌、抗炎、抗氧化衰老及保肝的藥理活性[12]。趙晨棟等[13]通過試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)連翹提取物可能通過抗氧化作用及抑制CYP2E1酶活性，緩解對(duì)乙酰氨基酚誘導(dǎo)的肝損傷。連翹葉為木犀科植物連翹的干燥葉，也可供藥用。連翹葉為非藥用部位，一般多被丟棄，對(duì)連翹葉的開發(fā)利用較少。研究表明，連翹葉的成分主要為黃酮類、多糖類、有機(jī)酸類和木脂素類等[14]。據(jù)相關(guān)分析，連翹葉中的化學(xué)成分與連翹果實(shí)十分相似，甚至有些成分還高于連翹果實(shí)，如連翹苷和連翹脂苷A[15-17]。連翹葉含多種藥理活性，如抗氧化、抑菌及肝保護(hù)作用[18-19]。劉靜[20]研究發(fā)現(xiàn)，連翹葉提取物(Forsythiasuspenseleaves extract，F(xiàn)SLE)對(duì)CCl4誘導(dǎo)的肝損傷具有良好的保護(hù)作用；白美美[19]研究發(fā)現(xiàn)，連翹葉紅茶對(duì)CCl4誘導(dǎo)的肝損傷具有良好的保護(hù)作用；朱淑云[21]研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)SLE對(duì)四氧嘧啶所致的肝損傷有明顯的保護(hù)作用。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)基于系統(tǒng)生物學(xué)理論，研究模式為“多成分網(wǎng)絡(luò)靶點(diǎn)作用”，為中藥的治療機(jī)制、新用途等方面的研究提供了新的研究思路和方法，也廣泛應(yīng)用于中獸藥的研發(fā)。本研究基于連翹葉多成分、多靶點(diǎn)作用的研究思路，應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)，通過對(duì)FSLE成分、靶點(diǎn)、生物功能及通路分析，探討FSLE治療ENR誘導(dǎo)的肝損傷(ENR-induced liver injury，EILI)的機(jī)制，以期為肝損傷的治療提供候選藥物和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物 48只4周齡潔凈級(jí)昆明小鼠，體重25 g±3 g，雌雄各半，購自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所。動(dòng)物飼養(yǎng)于甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室，自由進(jìn)食飲水。動(dòng)物試驗(yàn)經(jīng)甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(GAU-LC-2020-33)。

1.1.2 主要試劑及儀器 FSLE、生理鹽水、羧甲基纖維素鈉(carboxymethylcellulose sodium，CMC)和ENR(生物技術(shù)級(jí))均購自上海源葉生物科技有限公司；AST、ALT、丙二醛(malondialdehyde，MDA)、還原型谷胱甘肽(glutathione，GSH)、過氧化氫(hydrogen peroxide，H2O2)和總超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)檢測(cè)試劑盒均購自南京建成生物工程研究所；RIPA裂解液、苯甲基磺酰氟(PMSF)、5×蛋白上樣緩沖液、BCA蛋白試劑盒和超敏ECL化學(xué)發(fā)光即用型底物均購自北京索萊寶科技有限公司；AMPK多克隆抗體購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；β-actin抗體和羊抗兔二抗均購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒和熒光定量試劑盒均購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；TolsZel UP購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

YRE2000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀購自鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；CT15RE日立微量高速冷凍離心機(jī)購自株式會(huì)社日立制作所；SpectraMax i3x多功能酶標(biāo)測(cè)定儀購自Molecular Devices公司；Amersham Imager600全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)購自GE公司；LightCycler96熒光定量PCR儀購自羅氏集團(tuán)；蛋白電泳儀及轉(zhuǎn)膜裝置購自Bio-Rad公司；Scientz-48L冷凍型高通量組織研磨器購自寧波新芝生物科技股份有限公司；Alpha1-2冷凍干燥機(jī)購自CHRIST公司；Leica ASP300S自動(dòng)組織脫水機(jī)、HistoCore Arcadia H石蠟包埋機(jī)和HistoCore MULTICUT輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)均購自萊卡公司。

1.2 FSLE制備及其有效成分鑒定

1.2.1 連翹葉來源及提取物的制備 2020年8月中旬于甘肅省天水市秦嶺鎮(zhèn)采摘連翹葉，于通風(fēng)處自然晾干，并儲(chǔ)存至陰涼干燥處，使用前將連翹葉研制為粉末。

稱取30 g連翹葉粉末，按照料液比1∶8加入60%乙醇，浸泡20 min，60 ℃水浴回流1 h，抽濾，收集濾液，濾渣中加入60%乙醇240 mL，纖維素酶0.15 g，50 ℃水浴回流2 h，抽濾，合并2次濾液，于50 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后置于冷凍干燥機(jī)凍干，收集FSLE凍干后的產(chǎn)物，并將其研制為粉末，置于陰涼干燥處。

1.2.2 FSLE有效成分鑒定及初步篩選 將1 g凍干后的FSLE粉末送至南京集思慧遠(yuǎn)生物科技有限公司使用液相-質(zhì)譜法(LC-MS)檢測(cè)成分。

LC-MS條件：液相色譜柱，Waters ACQUITY UPLC HSS T3(2.1 mm×100 mm，1.8 μm)；液相色譜A相為水相，含5 mmol/L乙酸銨和5 mmol/L乙酸，B相為乙腈；樣品盤溫度，4 ℃；進(jìn)樣體積，3 μL；分析時(shí)間，15 min。

質(zhì)譜參數(shù)：鞘氣流速，30 Arb；輔助器流量，10 Arb；毛細(xì)管溫度，350 ℃；碰撞能量，NCE模式下10/30/60；噴霧電壓，正離子模式4.0 kV，負(fù)離子模式-3.8 kV。

1.3 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析

1.3.1 FSLE活性成分篩選 將FSLE主要有效成分的CAS號(hào)輸入到PubChem(https:∥pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)中，下載2D結(jié)構(gòu)，將下載好的結(jié)構(gòu)導(dǎo)入到Swiss ADME數(shù)據(jù)庫(http:∥www.swiss adme.ch/)中，以胃腸吸收為“High”，類藥性大于2個(gè)“YES”為依據(jù)篩選FSLE活性成分。

1.3.2 FSLE活性成分靶點(diǎn)與肝損傷靶點(diǎn)的獲取 將篩選后的活性成分導(dǎo)入到Swiss Target Prediction網(wǎng)站中(http:∥www.swiss target prediction.ch/)，預(yù)測(cè)FSLE相關(guān)靶點(diǎn)，并進(jìn)行整理，去重。

在GeneCards(http:∥www.genecards.org/)數(shù)據(jù)庫中輸入“Drug-induced liver injury”，作為EILI靶點(diǎn)，并對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理，去掉分?jǐn)?shù)較低的靶點(diǎn)。

1.3.3 FSLE治療EILI核心靶點(diǎn)的篩選 將FSLE及EILI的活性成分靶點(diǎn)分別導(dǎo)入到STRING(https:∥cn.string-db.org/)數(shù)據(jù)庫，獲得各自的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，通過Cytoscape 3.8.0軟件中的Merge交集功能篩選核心靶點(diǎn)。

1.3.4 FSLE治療EILI的GO功能、KEGG通路富集分析 取FSLE和EILI靶點(diǎn)的交集靶點(diǎn)，使用Metascape(https:∥metascape.org/)在線分析工具進(jìn)行FSLE治療EILI的GO功能和KEGG通路富集，物種選擇為Homosapiens。通過微生信在線網(wǎng)站(http:∥www.bioinformatics.com.cn/)進(jìn)行繪圖。

1.3.5 成分-靶點(diǎn)-信號(hào)通路可視化網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 將篩選得到的FSLE活性成分-疾病交集靶點(diǎn)及通路整理為nextwork.xsml文件，并編輯好type文件導(dǎo)入到Cytoscape 3.8.0軟件，構(gòu)建“成分-靶點(diǎn)-信號(hào)通路”可視化網(wǎng)絡(luò)。

1.4 動(dòng)物模型體內(nèi)驗(yàn)證

1.4.1 動(dòng)物分組及給藥 取2 g FSLE溶于生理鹽水中，分別配制成200、400和600 mg/kg的藥液，將ENR溶于0.5% CMC溶液中配制為350 mg/kg的藥液，4 ℃保存?zhèn)溆谩＿m應(yīng)性飼喂1周后，將48只昆明小鼠隨機(jī)分為6組：空白組(NC組)、FSLE對(duì)照組(FSLE組，600 mg/kg)、EILI模型組(LD組)、連翹葉低劑量治療組(LFSLE+LD組，200 mg/kg)、連翹葉中劑量治療組(MFSLE+LD組，400 mg/kg)、連翹葉高劑量治療組(HFSLE+LD組，600 mg/kg)。其中NC組灌胃0.5% CMC溶液，F(xiàn)SLE組灌服600 mg/kg FSLE；除NC組與FSLE組外，其余組小鼠均給予等量的ENR 350 mg/kg，每日2次連續(xù)4 d，在給藥4 d后，LFSLE+LD、MFSLE+LD和HFSLE+LD組分別按200、400和600 mg/kg的劑量灌胃給予FSLE藥液，每日2次，連續(xù)3 d，其余各組灌胃給予等量的0.5% CMC溶液。

1.4.2 小鼠肝臟功能指標(biāo)的測(cè)定 在試驗(yàn)第7天給藥后禁食12 h，不限制飲水，小鼠眼眶靜脈叢采血，室溫條件下靜置30 min，4 ℃、3 000 r/min離心10 min分離血清，嚴(yán)格按照試劑盒說明書測(cè)定ALT及AST的活性。

1.4.3 小鼠肝臟組織病理形態(tài)學(xué)觀察 采集各組小鼠肝臟同一部位組織，固定于4%多聚甲醛中，固定24 h以上，經(jīng)過脫水、浸蠟、透明、包埋、切片后HE染色，于光學(xué)顯微鏡下觀察各組小鼠肝臟組織的病理形態(tài)學(xué)特征。

1.5 FSLE對(duì)小鼠肝損傷關(guān)鍵靶點(diǎn)AMPKα1和AMPKα2表達(dá)的影響

1.5.1 小鼠肝臟AMPKα1和AMPKα2基因表達(dá) 采用Trizol法提取小鼠肝臟總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)AMPK通路關(guān)鍵基因AMPKα1和AMPKα2表達(dá)，以β-actin為內(nèi)參，引物信息見表1。引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物序列

1.5.2 小鼠肝臟組織AMPKα1和AMPKα2蛋白表達(dá) 稱取小鼠肝臟組織80 mg左右，加入1 mL含蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液，充分裂解30 min后28 820 r/min離心5 min，取上清液，BCA法測(cè)定蛋白濃度，按蛋白上樣緩沖液∶蛋白樣1∶4的比例加入5×蛋白上樣緩沖液，100 ℃水浴10 min，進(jìn)行10% SDS-PAGE、轉(zhuǎn)膜、封閉，加入一抗(AMPK多克隆抗體，稀釋比1∶900，β-actin(單克隆抗體，1∶4 000稀釋)，4 ℃孵育過夜。PBST清洗30 min后，加入二抗(羊抗兔，1∶5 000稀釋)室溫孵育2 h，PBST清洗60 min，ECL顯影成像，Image J軟件分析條帶。

1.6 小鼠肝臟氧化應(yīng)激指標(biāo)測(cè)定

取適量肝臟樣品制成10%勻漿，4 ℃、2 500 r/min離心10 min取上清液備用。按照試劑盒說明書測(cè)定SOD活性及GSH、MDA和H2O2含量。

1.7 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)應(yīng)用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件GraphPad Prism 9.0進(jìn)行t檢驗(yàn)和單因素方差分析(One-way ANOVA)考察組間差別，試驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié) 果

2.1 FSLE有效成分初步鑒定

由圖1可知，F(xiàn)SLE成分較多且較復(fù)雜，由獲得的精確分子質(zhì)量及相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，并結(jié)合本課題組研究，對(duì)FSLE的主要有效成分進(jìn)行初步篩選。主要篩選具有保肝作用的成分，具體成分見表2。初步鑒定得到31種活性成分，主要為30種黃酮類化合物和1種五環(huán)三萜類化合物熊果酸，其余成分主要為萜類、木脂素及有機(jī)酸。

A，F(xiàn)SLE正離子流色譜圖；B，F(xiàn)SLE負(fù)離子流色譜圖A，Positive flow chromatography of FSLE；B，Negative flow chromatography of FSLE圖1 FSLE離子流色譜圖Fig.1 Total ion current chromatogram of FSLE

表2 FSLE主要有效成分

續(xù)表

2.2 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析

2.2.1 FSLE活性成分篩選 將31種成分根據(jù)胃腸吸收及類藥性進(jìn)行篩選，得到20種活性成分，包含19種黃酮類化合物及1種五環(huán)三萜類化合物(表3)。 熊果酸的胃腸吸收較低，但由于其含量較高，且有明確的保肝作用，因此也選為活性成分。

2.2.2 FSLE活性成分及疾病靶點(diǎn)預(yù)測(cè) 將所選活性成分導(dǎo)入到Swiss Target Prediction中，整理去重后得到相關(guān)藥物成分靶點(diǎn)338個(gè)。通過GeneCards數(shù)據(jù)庫搜索“Drug-induced liver injury”作為EILI的靶點(diǎn)，整理去掉分值較低的靶點(diǎn)后共篩選出913個(gè)疾病靶點(diǎn)，作為候選靶點(diǎn)。

2.2.3 FSLE治療肝損傷核心靶點(diǎn)篩選 通過STRING在線網(wǎng)站及Cytoscape 3.8.0軟件中的Merge功能進(jìn)行篩選，得到12個(gè)核心成分靶點(diǎn)(圖2)。FSLE可能通過作用于MAPK1、MAPK3、ESR1、PIK3CA、HSP90AA1、SRC、APP、PIK3R1、MAPK8、EGFR、VEGFA和AKT1靶點(diǎn)治療EILI。

2.2.4 FSLE治療EILI的GO功能和KEGG通路富集分析 在Excel表格中取FSLE與EILI的交集，即得124個(gè)交集靶點(diǎn)。將交集靶點(diǎn)輸入到Metascape中進(jìn)行GO功能和KEGG通路富集分析。GO功能分析繪制為柱狀圖(圖3)，其中，生物過程涉到細(xì)胞對(duì)化學(xué)應(yīng)激的作用、對(duì)無機(jī)物的作用、細(xì)胞對(duì)氮化合物的作用和激酶活性的正調(diào)控的過程等；細(xì)胞組分涉及到膜筏、囊泡腔、受體復(fù)合體和膜面等成分；分子功能涉及到蛋白激酶活性、磷酸酶結(jié)合、蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶活性和核受體活性等。根據(jù)P<0.05，篩選出排名前20的KEGG通路富集分析并繪制成氣泡圖(圖4)。KEGG通路富集分析顯示，F(xiàn)SLE治療EILI的通路主要富集在癌癥通路、流體剪切應(yīng)力與動(dòng)脈粥樣硬化通路、癌癥中的microRNA通路、膀胱癌、癌癥中的轉(zhuǎn)錄失調(diào)、5-HT神經(jīng)突觸、AMPK信號(hào)通路、卵巢類固醇生成、軸突導(dǎo)向、鈣信號(hào)通路、細(xì)胞因子與細(xì)胞因子受體相互作用、藥物代謝等。去掉與癌癥相關(guān)及與肝損傷無關(guān)的通路，F(xiàn)SLE治療肝損傷的直接通路有：AMPK信號(hào)通路、細(xì)胞因子與細(xì)胞因子受體的相互作用、藥物代謝、補(bǔ)體和凝血級(jí)聯(lián)、p53信號(hào)通路、膽汁分泌、酪氨酸代謝、PPAR信號(hào)通路和色氨酸代謝。

表3 FSLE活性成分

2.2.5 成分-靶點(diǎn)-信號(hào)通路可視化網(wǎng)絡(luò) 將FSLE活性成分靶點(diǎn)、藥物與疾病交集靶點(diǎn)和通路相關(guān)靶點(diǎn)導(dǎo)入到Cytoscape 3.8.0軟件繪制“成分-靶點(diǎn)-信號(hào)通路”可視化網(wǎng)絡(luò)(圖5)。采用Network Analyzer計(jì)算網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù)，結(jié)果顯示，該網(wǎng)絡(luò)的節(jié)點(diǎn)數(shù)為378，邊數(shù)為1 915?？煽闯鯢SLE治療EILI各靶點(diǎn)之間密切連接。FSLE中成分的平均度值(Degree)為69.80，其中高于平均Degree值的成分有13種，Degree值排名前5的分別為棕鱗矢車菊黃酮素、甜橙黃酮、桔皮素、異澤蘭黃素和山奈素；信號(hào)通路的平均Degree值為11.31，其中高于平均Degree值的通路有5條，分別為癌癥通路、癌癥中的microRNAs通路、流體剪應(yīng)力和動(dòng)脈粥樣硬化、癌癥中的轉(zhuǎn)錄失調(diào)和AMPK信號(hào)通路。除去癌癥相關(guān)通路，F(xiàn)SLE治療EILI的關(guān)鍵通路為AMPK信號(hào)通路，故FSLE可能通過AMPK通路發(fā)揮治療EILI的作用。

圖2 核心靶點(diǎn)篩選Fig.2 Core target screening

圖3 GO功能分析柱狀圖Fig.3 Chart histogram of GO function analysis

圖4 KEGG通路富集分析氣泡圖Fig.4 Bubble diagram of KEGG pathway analysis

菱形代表成分；長方形代表靶點(diǎn)；箭頭代表通路Diamond represents components;Rectangle represents targets;Arrow represents pathways圖5 成分-靶點(diǎn)-信號(hào)通路Fig.5 Component-target-signal pathway network

2.3 FSLE抗EILI的體內(nèi)驗(yàn)證

2.3.1 FSLE對(duì)小鼠血清ALT和AST水平的影響 由圖6可知，與NC組相比，LD組小鼠血清ALT和AST活性顯著升高(P<0.05)，提示EILI造模成功；與LD組相比，HFSLE+LD、MFSLE+LD和LFSLE+LD組小鼠血清AST活性均顯著降低(P<0.05)，HFSLE+LD組小鼠血清ALT活性顯著降低(P<0.05)，說明FSLE可有效減輕EILI。

2.3.2 FSLE對(duì)小鼠肝臟組織病理變化的影響 HE染色結(jié)果顯示，NC組的小鼠肝臟組織細(xì)胞形態(tài)正常，細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞間隙致密，肝臟組織以中央靜脈為中心呈放射狀排列、結(jié)構(gòu)完整，無炎性細(xì)胞浸潤(圖7A)；LD組小鼠肝臟組織肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)較為紊亂，肝索基本消失，界限不清，肝細(xì)胞出現(xiàn)水腫現(xiàn)象，有部分核溶解現(xiàn)象，并伴有少量出血和炎性細(xì)胞(圖7C)，表明小鼠EILI模型成功建立；與LD組相比，HFSLE+LD組細(xì)胞完整，排列整齊，水腫現(xiàn)象減少，肝索清晰，無大量炎性細(xì)胞及壞死灶(圖7D)；MFSLE+LD組肝細(xì)胞形態(tài)出現(xiàn)好轉(zhuǎn)，水腫現(xiàn)象減輕(圖7E)；LFSLE+LD組小鼠肝臟組織形態(tài)好轉(zhuǎn)，雖有水腫現(xiàn)象但水腫減輕，無核溶解現(xiàn)象，細(xì)胞排列較為緊密(圖7F)。

肩標(biāo)不同字母表示差異顯著(P<0.05)；肩標(biāo)相同字母表示差異不顯著(P>0.05)。下同Values with different letter superscripts mean significant difference (P<0.05)；While with the same letter superscripts mean no significant difference (P>0.05).The same as below圖6 FSLE對(duì)小鼠血清AST和ALT活性的影響Fig.6 Effect of FSLE on the activity of serum AST and ALT in mice

A～F，分別為NC、FSLE、LD、HFSLE+LD、MFSLE+LD和LFSLE+LD組A-F,NC,FSLE,LD,HFSLE+LD,MFSLE+LD and LFSLE+LD groups,respectively圖7 FSLE對(duì)小鼠肝臟組織病理學(xué)變化的影響(HE，400×)Fig.7 Effect of FSLE on histopathological changes of mouse liver (HE，400×)

2.4 FSLE對(duì)小鼠肝損傷關(guān)鍵靶點(diǎn)AMPKα1和AMPKα2表達(dá)的影響

2.4.1 FSLE對(duì)小鼠肝損傷AMPKα1和AMPKα2基因表達(dá)的影響 由圖8可知，與NC相比，LD組AMPKα1和AMPKα2基因mRNA表達(dá)量均顯著下降(P<0.05)；與LD組相比，HFSLE+LD組可顯著上調(diào)AMPKα1和AMPKα2基因mRNA表達(dá)量(P<0.05)。

圖8 FSLE對(duì)AMPKα1(A)和AMPKα2(B)基因mRNA表達(dá)水平的影響Fig.8 Effects of FSLE on AMPKα1 (A) and AMPKα2 (B) genes mRNA expression levels

2.4.2 FSLE對(duì)小鼠肝損傷關(guān)鍵靶點(diǎn)AMPK蛋白表達(dá)的影響 由圖9可知，與NC組相比，LD組小鼠肝臟的AMPK蛋白表達(dá)量顯著下降(P<0.05);與LD組相比，HFSLE+LD組可顯著提高AMPK的蛋白表達(dá)量(P<0.05)。

圖9 FSLE對(duì)AMPK蛋白表達(dá)水平的影響Fig.9 Effects of FSLE on AMPK protein expression levels

2.5 FSLE對(duì)小鼠肝臟氧化應(yīng)激水平的影響

由圖10可知，與NC組相比，LD組小鼠肝臟SOD活性及GSH含量顯著降低(P<0.05)，小鼠肝臟MDA及H2O2含量顯著升高(P<0.05)；與LD組相比，HFSLE+LD組小鼠肝臟SOD活性及GSH含量顯著上升(P<0.05)，HFSLE+LD、MFSLE+LD小鼠肝臟MDA及H2O2含量顯著降低(P<0.05)，且HFSLE+LD組基本達(dá)到正常水平。表明FSLE對(duì)ENR誘導(dǎo)的小鼠肝損傷的保護(hù)作用可能與其提高機(jī)體抗氧化應(yīng)激水平有關(guān)。

圖10 FSLE對(duì)小鼠肝臟氧化應(yīng)激水平的影響Fig.10 Effect of FSLE on the level of oxidative stress in mouse liver

3 討 論

本研究基于LC-MS分析及網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)，對(duì)FSLE治療EILI進(jìn)行研究。通過LC-MS分析鑒定出30種黃酮類化合物和1種萜類化合物。研究表明，黃酮類化合物和萜類化合物均有顯著的肝臟保護(hù)作用[22-23]。根據(jù)胃腸吸收和類藥性，篩選出20種活性較高的成分參與調(diào)控EILI，排名靠前的主要包括甜橙黃酮、山奈素和桔皮素。通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩選出核心靶點(diǎn)12個(gè)，即MAPK1、MAPK3、ESR1、PIK3CA、HSP90AA1、SRC、APP、PIK3R1、MAPK8、EGFR、VEGFA和AKT1。FSLE治療EILI可能是通過這些核心靶點(diǎn)來實(shí)現(xiàn)的。通過KEGG通路富集分析并構(gòu)建“成分-靶點(diǎn)-信號(hào)通路”可視化網(wǎng)絡(luò)顯示，AMPK信號(hào)通路[24]、p53信號(hào)通路[25]和PPAR信號(hào)通路[26]都與肝損傷密切相關(guān)。其中AMPK信號(hào)通路具有多種重要的生物學(xué)功能，其生物功能主要包括蛋白質(zhì)合成、核糖體蛋白翻譯、脂肪酸合成、線粒體生物合成氧化代謝、脂肪酸氧化和脂肪酸攝取[27]，在酒精性脂肪肝損傷[28]、氧化應(yīng)激造成的肝損傷[29]及藥物性肝損傷[30]的治療中都發(fā)揮著重要作用。

在肝臟中，ALT主要存在于細(xì)胞漿內(nèi)，AST主要存在于肝細(xì)胞線粒體中，當(dāng)肝細(xì)胞受到損害時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的ALT和AST會(huì)釋放到血液中，故血清中的ALT和AST水平會(huì)增加，因此ALT和AST為評(píng)價(jià)肝損傷的常用指標(biāo)[31]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，ENR可顯著提高小鼠血清中ALT和AST的活性，結(jié)合病理切片結(jié)果，如肝細(xì)胞水腫、核溶解、壞死及炎性細(xì)胞浸潤等，說明EILI模型成功建立。FSLE可顯著降低小鼠血清中ALT和AST活性，改善肝細(xì)胞水腫和壞死等現(xiàn)象，提示FSLE能有效恢復(fù)EILI小鼠的肝臟功能指標(biāo)。劉靜[20]通過腹腔注射CCl4誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷模型中，小鼠血清ALT和AST活力顯著升高，當(dāng)給予FSLE后，小鼠血清ALT和AST活力顯著降低，這與本試驗(yàn)結(jié)果一致。

AMPK是一種調(diào)節(jié)能量穩(wěn)態(tài)及代謝應(yīng)激的能量傳感器，在熱休克、氧化應(yīng)激和缺血的條件下被激活[32]。研究表明，AMPK在線粒體合成、線粒體氧化應(yīng)激中發(fā)揮重要的作用[33]。AMPK的激活通過上調(diào)線粒體抗氧化酶表達(dá)[34]，加速線粒體更新[35]，維持正常線粒體形態(tài)[36]，導(dǎo)致細(xì)胞線粒體活性氧(reactive oxygen species，ROS)生成減少，減輕氧化應(yīng)激。在本試驗(yàn)中，F(xiàn)SLE可顯著上調(diào)EILI小鼠肝臟AMPK基因和蛋白的表達(dá)。這與王春麗[37]發(fā)現(xiàn)的菊花提取物通過激活A(yù)MPK通路緩解氧化應(yīng)激、減輕肝損傷的結(jié)果基本一致。

肝臟是機(jī)體內(nèi)以代謝和合成功能為主的器官，每個(gè)肝細(xì)胞中含上千個(gè)線粒體，線粒體是產(chǎn)生ROS的主要細(xì)胞器[38]。因此，肝臟既易產(chǎn)生ROS，但也易受ROS的攻擊。研究表明，ROS可導(dǎo)致蛋白質(zhì)修飾、脂質(zhì)過氧化和核酸損傷。脂質(zhì)過氧化一旦開始，即會(huì)進(jìn)行鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，直到生成脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物，如MDA[39]。MDA是一種常用的生物標(biāo)記物，用于評(píng)價(jià)生物體內(nèi)的氧化應(yīng)激水平，間接反映細(xì)胞損傷的程度[40]。SOD是一種重要的抗氧化酶，SOD活力的高低間接反映了機(jī)體清除氧自由基的能力[41]。SOD通過歧化反應(yīng)，將氧自由基轉(zhuǎn)化為H2O2與O2，故在一定程度上SOD活力的高低可說明機(jī)體對(duì)抗氧化應(yīng)激的能力。GSH是細(xì)胞內(nèi)天然的抗氧化酶，對(duì)維持細(xì)胞的氧化還原平衡十分重要[42]。GSH耗竭后可導(dǎo)致脂質(zhì)的過氧化，引起肝細(xì)胞損傷[43]。在本試驗(yàn)中與LD組相比，F(xiàn)LSE顯著提高EILI小鼠肝臟中SOD活力和GSH含量，降低H2O2和MDA含量。LFSLE+LD組MDA濃度顯著降低，可能是FSLE對(duì)MDA的敏感性較高，這可能與連翹葉清除脂質(zhì)能力有關(guān)[44]。朱淑云[21]通過四氧嘧啶誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生氧化損傷，致使小鼠肝臟中MDA顯著升高，SOD顯著降低，當(dāng)給予FSLE后，MDA顯著降低，SOD顯著升高，與本試驗(yàn)結(jié)果基本一致。

4 結(jié) 論

本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩選到FSLE可能主要通過AMPK信號(hào)通路發(fā)揮抗EILI的作用。動(dòng)物體內(nèi)試驗(yàn)表明，F(xiàn)SLE可顯著降低小鼠血清ALT和AST活力，可能通過上調(diào)AMPK基因和蛋白的表達(dá)來減輕肝臟的氧化應(yīng)激，從而發(fā)揮抗EILI的作用。