香瓜茄多組織部位和病害脅迫條件下qRT-PCR內參基因的選擇

黃麗萍，李思鴻，鐘啟文,3*，王晉民

( 1.青海大學，青海 西寧 810016； 2.青海大學農林科學院，青海 西寧 810016；3.青海省蔬菜遺傳與生理重點實驗室，青海 西寧 810016)

香瓜茄(Solanummuricatum)原產于南美洲，屬茄科茄屬香瓜茄種，為多年生雙子葉草本植物。其果實成熟后呈淡黃色并帶有紫色或紫紅色條紋，鮮嫩多汁，風味獨特，口感清甜且熱量低，富含多種礦物質和維生素[1],枝干造型獨特，具有欣賞價值，因而近年來逐漸受到人們的喜愛。當前對香瓜茄的研究主要集中于園藝學性狀、化學成分分析、栽培、貯藏等傳統(tǒng)農學研究和功能性研究，隨著香瓜茄市場規(guī)模愈加壯大，利用基因表達分析鑒定與香瓜茄種質資源、風味及營養(yǎng)相關的關鍵物質的調控基因，成為研究人員開展品質育種工作研究的重要方向[2]。qRT-PCR技術是研究基因表達的重要技術手段，主要應用于檢測不同細胞類型和組織的mRNA表達水平,也能精確檢測相關基因在各種情況下的表達豐度，如植物生長形成、品質、產量等相關基因表達，這些研究均離不開穩(wěn)定的內參基因[3-4]。

目前，已有學者成功鑒定出多個物種不同條件下的內參基因，同時在IGG (http://icg.big.ac.cn)中已經收錄了超過150種植物的多種內參基因信息[5]。在植物體中常用的內參基因包括β-微管蛋白基因(tubulin,TUB)、多聚泛素酶基因(ubiquitin，UBQ)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因(glyceral-dehyde-3-phosphatedehydrogenase，GAPDH)、肌動蛋白基因(actin，ACT)、核糖體RNA基因(如18SrRNA、26SrRNA)、轉錄延伸因子基因(elongationfactors1alpha，EF1α)等[6]。內參基因在各個組織部位都有表達，但仍然受到組織部位差異和外界脅迫的影響，呈現(xiàn)不同的表達穩(wěn)定性，并不存在在任何組織部位和任何條件下都能穩(wěn)定表達的內參基因，如EF1α被認為是馬鈴薯在生物(晚疫病)和非生物脅迫(鹽脅迫)下最穩(wěn)定的內參基因，而EF1α和APRT則是冷脅迫下最穩(wěn)定的內參基因[7]。所以需要尋找特定條件下表達變化最小的內參基因，以盡可能地反映靶基因真實的轉錄水平，或選擇多個內參基因組合的方式來提高內參基因篩選的可靠性[8]。為了加強對新興水果香瓜茄的深入研究，本研究以初花期香瓜茄的不同組織部位及病害脅迫下苗期香瓜茄的葉片為試驗材料，選取9個常用內參基因GAPDH1、UBI、UK、β-TUB、GAPDH2、EF1α、ACT、APT、18SrRNA，對比分析它們在香瓜茄中的表達水平，采用geNorm、NormFinder和BestKeeper軟件評估候選內參基因表達穩(wěn)定性，旨在為香瓜茄的相關基因分析提供穩(wěn)定的內參基因。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

采集青海大學農林科學院種子繁育的初花期香瓜茄植株，取根(O1)、莖(O2)、葉(O3)和花(O4)等4個組織部位作為多組織樣品。采集青海西寧地區(qū)含4種病毒(未完全脫毒)的香瓜茄組培苗苗期植株葉片(S1)及含1種病毒的香瓜茄種子繁育實生苗苗期植株葉片(S2)，甘肅武威地區(qū)出現(xiàn)花斑、卷葉等癥狀的香瓜茄苗期植株葉片(S3)，云南石林地區(qū)出現(xiàn)疫病癥狀的香瓜茄苗期植株葉片(S4)，作為病害脅迫條件下的樣品。采集的樣品先進行液氮速凍，然后置于-80 ℃冰箱保存取用。

1.2 RNA提取和逆轉錄

采用Trizol法提取樣品總RNA，利用1%(w/v)瓊脂糖凝膠電泳驗證總RNA完整性，通過NanoDrop 2000超微量分光光度計(美國，NanoDrop Technologies)測定RNA的純度，通過Fast-King cDNA第一鏈合成試劑盒反轉錄系統(tǒng)(中國，生工生物工程(上海)股份有限公司)進行反轉錄獲得cDNA，對總RNA樣本進行反轉錄時總量需調配至100 ng。

1.3 候選內參基因及qRT-PCR引物設計

在IGG中選取近緣茄科作物的9個內參基因作為候選內參基因，運用Primer Premier6設計引物，得到9個候選內參基因引物，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，基因名稱、引物序列及片段擴增長度如表1所示。

表1 候選內參基因qRT-PCR引物序列

1.4 qRT-PCR反應及分析

取1.2中的cDNA樣品(cDNA樣品稀釋至10-1)為模板，以表1中的引物序列為引物，進行qRT-PCR反應。采用Roche LightCycler480Ⅱ實時熒光定量PCR系統(tǒng)，按照SYBR Green法進行qRT-PCR反應，熒光定量染料選用Premix Ex Taq(TaKaRa)。反應體系(20 μL)：1 μL模板，各0.6 μL的正向及反向引物(10 μmol/L)，10 μL 2X SanTaq PCR Mix預混液及7.8 μL ddH2O。反應程序：95 ℃預變性30 s；95 ℃變性5 s，退火30 s，72 ℃延伸30 s，反應40個循環(huán)。58 ℃至95 ℃范圍內連續(xù)測定熒光強度獲得熔解曲線，用于評估引物特異性；每個樣品內熒光信號達到設定閾值時所經歷的循環(huán)數(shù)為Cq，分析內參基因穩(wěn)定性。每個樣品重復3次。

1.5 數(shù)據處理和分析

運用geNorm、NormFinder和BestKeeper等3種軟件[9]對9個候選內參基因在初花期香瓜茄不同組織部位及病害脅迫條件下苗期香瓜茄葉片中的表達穩(wěn)定性進行分析。geNorm和NormFinder是基于微軟Excel軟件下的算法。geNorm作為使用最廣泛的軟件，以配對差異值(V)和M值作為衡量內參基因表達穩(wěn)定性的主要指標，M值越低的基因表達越穩(wěn)定[10]。通過計算單個基因和所有其他被測對照基因之間的平均兩兩變異，測量基因表達穩(wěn)定性M。使用時首先需要在微軟Excel軟件中將qRT-PCR所得到的候選內參基因Cq值，根據公式Q = 2Cq(min)-Cq(sample)轉化為基因相對表達量Q(Cq(min)為各組織樣本和病害脅迫下候選內參基因的最小Cq值)；然后將基因相對表達量Q數(shù)據導入geNorm程序，得到候選內參基因穩(wěn)定性折線圖，該圖最左邊基因的M值與基因的穩(wěn)定性呈負相關，即M值越小，代表基因的穩(wěn)定值越高，反之則越低。由于本試驗中的候選內參基因大于3個，需要對數(shù)據進行歸一化處理，在2個連續(xù)的歸一化因子(NFn和NFn+1)之間計算Vn/n+1(其中n為基因表達歸一化的內參基因的數(shù)量)，配對差異值(V)以0.15為界限，大于臨界值需要引入該內參基因對后一位內參基因進行標準化。

NormFinder軟件是根據給定樣本集和試驗處理中的多個內參基因的表達穩(wěn)定性進行排序，排序等級最低的為該條件下表達最穩(wěn)定的基因，即M值越小，表示基因的穩(wěn)定性越高。其數(shù)據前處理同geNorm軟件一樣，處理后導入的同樣是基因相對表達量，根據軟件的不同算法得到表達穩(wěn)定值M，根據M值進行穩(wěn)定性排序。

BestKeeper軟件則是通過比較各候選內參基因在不同樣品間Cq值產生的標準偏差(SD)、變異系數(shù)(CV)及相關系數(shù)(r)來確定候選內參基因的穩(wěn)定性。當內參基因表達穩(wěn)定性越好，內參基因一般呈現(xiàn)較高的r值，較小的SD值和CV值。此外，當SD值大于1 時，則表明候選內參基因的表達不穩(wěn)定。較前兩個軟件其優(yōu)勢在于，它不單單能夠評估內參基因的穩(wěn)定性，而且可以對多種目的基因的轉錄水平進行評估。

最后，通過對三種軟件分析結果進行比較，從多個候選基因中篩選出最優(yōu)的內參基因。

2 結果與分析

2.1 總RNA提取及質量檢測

對初花期香瓜茄不同組織部位及病害脅迫條件下苗期香瓜茄葉片提取的總RNA，使用1.0% 瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA質量時發(fā)現(xiàn)，電泳條帶清晰，28S∶18S條帶接近2∶1。同時，利用NanoDrop 2000超微量分光光度計進行純度檢測，結果如表2所示，A260/A280 比值均在1.615～2.565，證明RNA完整性良好。對于本試驗中出現(xiàn)的A260/A280≥2，但A260/A230≤1，可能是胍鹽殘留；A260/A280≤2，但A260/A230與A260/A280相比顯著下降，可能是出現(xiàn)了蛋白殘留;1≤A260/A280≤1.5，1≤A260/A230≤1.5，可能是由于酚殘留。綜合考慮凝膠電泳檢測與NanoDrop 2000檢測結果，提取的RNA可用于后續(xù)試驗。

表2 香瓜茄不同樣本的總 RNA 質量和純度檢測

2.2 內參基因qRT-PCR特異性分析

對內參基因進行qRT-PCR，結果顯示9個內參基因的熔解曲線只有單一信號峰出現(xiàn)；再對內參基因引物qRT-PCR產物進行檢測，發(fā)現(xiàn)瓊脂糖凝膠電泳結果顯示單一條帶。綜合以上結果說明9個內參基因引物無二聚體且特異性良好，可以在該qRT-PCR條件下進行后續(xù)試驗研究。

2.3 內參基因穩(wěn)定性分析

2.3.1 geNorm分析 由圖1可知，在8個不同樣本中，除了葉片(O3)的V2/3=0.154和病毒病感病苗葉片(S3)的V2/3= 0.169，配對差異值均大于0.15，需要引入第3個內參基因。其余6個樣本候選內參基因的配對差異值均小于0.15，表明可使用2個內參基因在香瓜茄多組織部位和病害脅迫條件下進行qRT-PCR歸一化；由圖2可知，各樣本結果略有差異，但所有樣本候選內參基因的M值均在1.5以下。當以香瓜茄不同組織為材料時，根(O1)中M值最小的為18SrRNA和APT，莖(O2)和花(O4)中M值最小的為GAPDH2和APT，葉(O3)中M值最小的為EF1α和APT；當以香瓜茄不同病害脅迫條件下苗期香瓜茄葉片為材料時，組培苗葉片(S1)、病毒病感病苗葉片(S3)和疫病感病苗葉片(S4)中M值最小的為GAPDH2和APT，實生苗葉片(S2)中M值最小的為UBI和APT。結合圖1和圖2分析可知，香瓜茄根部內參基因最理想的為18SrRNA和APT；香瓜茄莖和花，組培苗葉片和疫病感病苗葉片內參基因最理想的為GAPDH2和APT；組織處理中葉片(V2/3=0.154)及病害脅迫條件下病毒病感病苗葉片(V2/3=0.169)由于V2/3超過0.15，需要引入第3個基因進行矯正，內參最適數(shù)目為3個，均含APT。由以上分析可知，geNorm軟件分析得到不同條件下香瓜茄最適的內參基因為APT。

圖1 geNorm軟件分析內參基因最適數(shù)目

圖2 候選內參基因的平均表達穩(wěn)定值

2.3.2 NormFinder分析 由表3可知，9個候選內參基因的穩(wěn)定性在初花期香瓜茄不同組織部位及病害脅迫條件下苗期香瓜茄葉片中排序不同，根、莖、葉和花中表達穩(wěn)定性最好的內參基因為APT，其次是18SrRNA，而GAPDH1基因在根、莖、葉中表達穩(wěn)定性最差，β-TUB基因在花中表達最不穩(wěn)定；在病害脅迫處理下，表達穩(wěn)定性最好的內參基因是APT，其次是18SrRNA和UBI，而β-TUB在病毒病感病苗葉片中穩(wěn)定性最差，ACT在組培苗和疫病感病苗葉片中的表達穩(wěn)定性最差。該軟件排序穩(wěn)定性分析結果與geNorm軟件穩(wěn)定性分析結果基本一致。

表3 NormFinder軟件分析香瓜茄中9個候選內參基因穩(wěn)定性

2.3.3 BestKeeper分析 由表4可知，9個候選內參基因中18SrRNA(SD = 0.767)和UBI(SD = 0.902)，SD值低于1.0，其他內參基因的SD值均大于1.0，說明基因18SrRNA和UBI表達穩(wěn)定性最好。而在9個候選基因中，GAPDH2基因的SD值最高(SD = 2.127)，表明該基因表達穩(wěn)定性最差。

表4 BestKeeper軟件分析香瓜茄中9個候選內參基因穩(wěn)定性

因此，綜合BestKeeper軟件穩(wěn)定性分析結果與geNorm和NormFinder軟件穩(wěn)定性分析結果，從9個不同的候選內參基因中，篩選獲得香瓜茄3個表達穩(wěn)定性良好的內參基因APT、18SrRNA和UBI。

3 討論與結論

為了篩選香瓜茄的穩(wěn)定內參基因，本文分析對比了香瓜茄在不同組織部位及病害脅迫條件下9個內參基因的表達穩(wěn)定性，結果表明：geNorm軟件分析確定的最理想內參基因是APT；NormFinder軟件分析確定的穩(wěn)定性最好的內參基因為APT，其次是18SrRNA和UBI；BestKeeper軟件分析確定的符合條件的穩(wěn)定內參基因為18SrRNA和UBI。Tang等[11]用geNorm、NormFinder、BestKeeper和RefFinder 4種軟件分析了馬鈴薯的穩(wěn)定內參基因，在干旱和滲透脅迫條件下EF1α和sec3基因是馬鈴薯中表達最穩(wěn)定的內參基因；但Mariot等[12]用geNorm、NormFinder和BestKeeper 3種軟件在分析馬鈴薯不同塊莖內參基因時發(fā)現(xiàn)，geNorm和NormFinder軟件確定的穩(wěn)定內參基因非常相似，均為C2和sec3基因為穩(wěn)定內參基因，而BestKeeper軟件分析的結果與其他2個軟件不同，確定了第三內參基因CUL3A。本文在利用geNorm、NormFinder和BestKeeper 3種軟件分析香瓜茄不同組織部位和不同非生物脅迫條件下穩(wěn)定內參基因時出現(xiàn)了與Mariot等[12]研究結果同樣的情況，篩選到了3個(APT、18SrRNA和UBI)相對穩(wěn)定的內參基因，證明不同分析軟件的評估方法會影響內參基因穩(wěn)定性的最后排名。

內參基因的表達水平在不同物種中不是恒定的，甚至在同一物種不同組織部位表達也不完全相同。相關研究表明，茄科中馬鈴薯、番茄、辣椒的穩(wěn)定內參基因是不同的[13-15]，如馬鈴薯塊莖中最穩(wěn)定的內參基因是C2、sec3和CUL3A[12]； Cheng等[15]研究發(fā)現(xiàn)UBI基因是辣椒果實發(fā)育中最穩(wěn)定的內參基因；在番茄中，DNAJ、GAPDH和TUA基因[12]早就被用作番茄中基因表達分析的內參基因，而Exposito-Rodriguez等[14]在研究番茄發(fā)育過程中的內參基因時，認為以CAC和TIP41基因為內參基因可以可靠地標準化整個番茄發(fā)育過程中的基因表達情況。本研究結果同樣證明內參基因在同一物種的不同組織部位及病害脅迫條件下的穩(wěn)定性是不完全相同，如NormFinder軟件分析結果表明：APT在香瓜茄葉片中的穩(wěn)定表達值(M)為0.8，花中的穩(wěn)定表達值為 0.472，而在香瓜茄苗期病毒病感病苗葉片中的穩(wěn)定表達值為0.525。

綜上可知，利用geNorm、NormFinder和BestKeeper 3種分析軟件篩選得到APT、18SrRNA和UBI為香瓜茄穩(wěn)定內參基因，其中APT在不同組織部位及病害脅迫條件下都有著良好的表達穩(wěn)定性，最終確定APT基因是本試驗條件下定量檢測香瓜茄基因表達的最理想內參基因。