謝 雯，張春梅，任 昊，張懷霞，張瑩瑩，陳 倩，賈建磊*

(1.青海大學農牧學院，青海 西寧 810016； 2.青海大學實驗管理處，青海 西寧 810016)

熱休克蛋白27(Heat Shock Protein 27，HSP27)是小分子熱休克蛋白亞家族的重要一員，是高溫等應激因素誘導產生的蛋白[1]，具有抗細胞凋亡和調節(jié)F-肌動蛋白活性等功能[2]，其主要通過抗細胞凋亡和調節(jié)信號傳導來參與機體的多種復雜生理過程。

顆粒細胞為卵母細胞發(fā)育提供營養(yǎng)物質和能量[3-4]。HSP27蛋白是卵泡發(fā)育過程中產生的第一類蛋白，能在卵泡內的顆粒細胞層中表達[5-6]。HSP27基因在哺乳動物卵泡發(fā)育過程中通過介入到細胞凋亡信號通路直接干擾細胞凋亡，通過影響下丘腦促性腺激素釋放激素(Gonadotropin-releasing hormone，GnRH)、垂體促性腺激素中的促卵泡激素(Follicle Stimulating Hormone，FSH)和促黃體生成素(Luteinizing Hormone，LH)對卵巢顆粒細胞或膜細胞的調節(jié)，進而調控哺乳動物卵泡發(fā)育及排卵過程[7]。因此，HSP27蛋白可以通過抑制顆粒細胞的凋亡來促進卵母細胞成熟[8]。

目前，對于HSP27基因的研究主要集中在運用分子遺傳學和DNA分子遺傳標記技術探索母體繁殖障礙疾病的作用機制，Shochet等[9]、Bahr等[10]研究發(fā)現HSP27蛋白的磷酸化會影響胎兒生長受限期間的胎盤發(fā)育；Hromadnikova等[11]研究發(fā)現sHSP的mRNA水平能反映母體對妊娠相關并發(fā)癥的應激反應程度。關于HSP27基因在顆粒細胞凋亡及卵母細胞成熟中的研究較少，因此本文以三大原始綿羊品種之一的藏羊為研究對象，構建HSP27基因真核表達體系，通過生物信息學分析并預測HSP27基因及其相互作用網絡在藏羊卵巢卵母細胞成熟過程中的作用通路，從分子生物學角度分析了HSP27基因對藏羊產羔性狀作用通路的影響，為提高藏羊產羔率提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗用成年健康經產高原型藏母羊5只(3～4歲)，購自青海省海南藏族自治州共和縣哇玉香咔梅哚牧業(yè)有限公司，屠宰后采集兩側卵巢，剝離卵巢周圍表面韌帶及組織脂肪，無菌水沖洗后置于液氮中帶回實驗室，-80 ℃保存。

1.2 試驗方法

1.2.1HSP27基因PCR擴增及克隆 根據GenBank上提交的HSP27全基因mRNA的堿基序列(登錄號：NC_037352.1)，運用Primer Premier 5.0軟件設計HSP27基因編碼區(qū)PCR引物(表1)。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 目的基因引物序列

將藏羊卵巢總RNA提取后反轉錄為cDNA，進行PCR擴增，產物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。擴增體系20 μL：模板cDNA(50 mg/μL)1.5 μL，Taq PCR預混酶2.0 μL，上、下游引物(100 μmol/L)各0.5 μL，PCR Loading Buffer 2.5 μL，dNTP(2.5 mmol/L)2.0 μL，ddH2O 11.0 μL(TransGen Biotech PerfectStart Uni RT&qPCR kit)。擴增條件：95 ℃預變性4 min；95 ℃變性30 s，59 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30個循環(huán)；72 ℃保持10 min。使用T4 DNA連接酶將純化的PCR產物連接到pMD19-T中，過夜(4 ℃)構建重組質粒，將重組質粒轉化至DH5α感受態(tài)細胞中，將得到的菌液通過分區(qū)劃線法培養(yǎng)在含卡那抗性的LB固體培養(yǎng)基上，過夜(37 ℃)培養(yǎng)。挑取白色斑點轉移至具有氨芐抗性的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)(37 ℃,過夜)，通過PCR篩選陽性克隆，送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

1.2.2HSP27基因真核表達體系的構建與單克隆抗體的制備 將pcDNA3.1a真核表達質粒載體和構建的pMD19-T-HSP27克隆載體進行雙酶切(XhoI、KpnI)，用連接酶連接目的基因片段和空載體后轉化至DH5α感受態(tài)細胞中，冰浴30 min；熱激(42 ℃)90 s，冰浴1 min；加入1 mL液體LB培養(yǎng)基于搖床培養(yǎng)(37 ℃，180 r/min，1.5 h)，取菌液涂布于含卡那抗性的LB固體培養(yǎng)基，過夜(37 ℃)培養(yǎng)，挑取白色斑點，通過PCR篩選陽性克隆，送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

在含有10%胎牛血清的Grace′s培養(yǎng)基中培養(yǎng)Sf 9昆蟲細胞；將重組質粒轉染于Sf 9昆蟲細胞，在28 ℃條件下培養(yǎng)，當細胞“病變”超過80%時分別收集上清液和沉淀，用SDS-PAGE凝膠電泳檢測，利用蛋白純化試劑盒進行重組蛋白的純化。

以重組HSP27蛋白為抗原免疫Bal b/c 6～8周齡雌性小鼠，末次免疫后取小鼠的血清進行ELISA抗體檢測，選擇抗體效價最高的小鼠脾細胞與SP 2/0骨髓瘤細胞進行融合，融合后待雜交瘤細胞長至96孔板的1/4時，用已建立的間接ELISA法對所有孔進行檢測，選擇檢測結果呈陽性的孔，用有限稀釋法進行2～3次亞克隆，直至抗體陽性率達到100%時擴大培養(yǎng)并凍存。

圖1藏羊卵巢總 RNA 提取圖Fig.1Extraction of total RNA from sheep ovary圖2HSP27基因PCR擴增圖Fig.2PCR amplification of HSP27 gene

1.2.3 重組HSP27蛋白相互作用蛋白的鑒定及生物信息學分析 在4 ℃條件下，用500 μL的0.5% NP40裂解緩沖液裂解母羊卵巢30 min；將沉淀物在PBS中洗滌2次后在4 ℃條件下用500 μL的1% NP40裂解緩沖液裂解，并用水浴超聲波儀(2級)處理(4個循環(huán))；將3 mg總蛋白加入50 μg IgA進行免疫沉淀；將單獨表達空載體的Sf 9細胞用作陰性對照。用Expasy和NetPhos 3.1 Server在線軟件分析預測目的蛋白的氨基酸含量和磷酸化位點，Bio-rad電泳儀進行雙向電泳，Q Exactive質譜儀與Easy nLC系統鑒定目的蛋白，以試驗組和對照組蛋白差異倍數的絕對值(≥3)為篩選條件來鑒定差異蛋白。利用Wolf PSORT預測互作蛋白的亞細胞定位，結合NCBI數據庫，利用GENEMANIA軟件及Uniprot(http：//www.uniprot.org/)數據庫對目的蛋白進行基本性質分析。

2 結果與分析

2.1 藏羊HSP27基因的克隆與鑒定

藏羊卵巢總RNA提取圖可見清晰的兩條帶(28S與18S)(圖1)，提取效果較好，可直接用于反轉錄。用反轉錄PCR擴增HSP27基因編碼區(qū)序列，擴增片段與目的片段大小一致(618 bp)且特異性良好(圖2)，結合NCBI數據庫中的BLAST軟件在線對比，擴增所得序列與參考序列的一致性達99.72%，可判定擴增序列為藏羊的HSP27基因序列。將擴增序列與pMD19-T載體進行連接，并將連接產物轉化至DH5α感受態(tài)細胞中，培養(yǎng)后挑選菌落使用限制性內切酶XhoI、KpnI 做酶切后，獲得618 bp的插入片段；空質粒未被酶切，表明藏羊HSP27基因的克隆成功(圖3)。

圖3 克隆雙酶切鑒定圖

2.2 重組pcDNA3.1a-HSP27真核載體的構建

利用限制性內切酶XhoI、KpnI對重組的真核載體pcDNA3.1a-HSP27、pcDNA3.1a分別進行雙酶切檢測，由圖4可見，重組的真核表達載體pcDNA3.1a-HSP27在5 000 bp和618 bp左右有兩條清晰的可見條帶，測序結果與已知序列完全相同，表明pcDNA3.1a-HSP27真核載體構建成功。

圖4 真核載體構建雙酶切鑒定圖

2.3 藏羊HSP27基因單克隆抗體的制備

由圖5可見，重組HSP27蛋白主要在沉淀中，有利于蛋白的純化。經4次免疫后小鼠的血清抗體效價達到1∶32 000，表明pcDNA3.1a-HSP27經真核表達所得到的融合蛋白可以誘導小鼠產生良好的免疫反應(圖6)。用單克隆抗體在藏羊卵巢全蛋白中進行特異性檢測，免疫后小鼠血清與藏羊卵巢中HSP27蛋白可獲得特異性目的條帶，表明制備的抗體具有較好的免疫活性(圖7)。

2.4 藏羊HSP27基因編碼蛋白的氨基酸含量及磷酸化位點預測

利用Expasy和NetPhos 3.1 Server在線軟件分析HSP27基因編碼蛋白的氨基酸含量及磷酸化位點，結果表明該蛋白含有20種氨基酸，其中絲氨酸和脯氨酸的含量最高(9.5%)，蛋氨酸和半胱氨酸含量最低(0.5%)；圖8顯示該蛋白有18個絲氨酸磷酸化位點、8個蘇氨酸磷酸化位點和3個酪氨酸磷酸化位點，其中18個絲氨酸磷酸化位點包括Ser9、Ser15、Ser44、Ser48、Ser50、Ser70、Ser74、Ser78、Ser79和Ser82等。

圖8 HSP27基因編碼蛋白的磷酸化位點分析圖

2.5 藏羊卵巢HSP27蛋白相互作用蛋白的鑒定

圖9為用雙向電泳法分離免疫共沉淀復合物的情況，經鑒定有15種目的蛋白能與HSP27蛋白相互作用，分別為HSP27、熱休克蛋白10(HSP10)、細胞外信號調節(jié)激酶1(ERK1)、Bcl-2、骨成型蛋白受體1B(BMPR-1B)、亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)、Ras同源物基因家族成員D(RhoD)、膜聯蛋白A2(Annexin A2，ANXA2)、鈣調蛋白(Calmodulin)、轉膠蛋白(Transgelin)、生長分化因子5(GDF5)、半乳糖凝集素1(Galectin-1)、磷脂酰乙醇胺結合蛋白(Phosphatidylethanolamine Binding Protein，PEBP)、L-乳酸脫氫酶-1(L-lactate dehydrogenase 1，LDH-1)及銅-鋅超氧化物歧化酶(Cu-Zn Superoxide dismutase，SOD[Cu-Zn])。通過免疫印跡法(Western Blot)確認了14種已識別候選蛋白與HSP27蛋白的特異性相互作用(圖10)。

圖9 藏羊卵巢HSP27蛋白及其相互作用蛋白的雙向電泳圖

圖10 HSP27蛋白相互作用蛋白的Western Blot驗證

利用Expasy在線軟件分析目的蛋白的基本性質，結果如表2所示。由表2可知15種目的蛋白等電點為4.09～9.80；除HSP27、HSP10和LDH-1外，親水性數值都為負(屬于疏水蛋白)；Bcl-2在205～226個氨基酸中存在跨膜區(qū)域，BMPR-1B在127～148個氨基酸中存在跨膜區(qū)域，其他13種蛋白不存在跨膜區(qū)域；所有蛋白都沒有信號肽。

表2 目的蛋白基本性質分析表

表3表明HSP27、RhoD和Galectin-1主要分布于細胞外基質，HSP10和ERK1主要分布于線粒體，Bcl-2、MTHFR、ANXA2、Transgelin、GDF5、PEBP、LDH-1和SOD[Cu-Zn]主要分布于細胞質，BMPR-1B主要分布于細胞質膜，Calmodulin主要分布于高爾基體。

表3 目的蛋白亞細胞位置的預測分數

表3(續(xù))

2.6 HSP27基因互作網絡分析及通路預測

以前期篩選的15種目的蛋白的調控基因為基礎，結合NCBI數據庫，利用可視化軟件GENEMANIA構建出互作網絡，見圖11?；赑hysical interactions、Shared protein domains、Predicted、Co-expression和Genetic interactions算法共得到34個節(jié)點的蛋白互作網絡，覆蓋了14種目的蛋白，其中MTHFR未與目的蛋白構成互作網絡?；诨プ鹘Y果設計HSP27基因調節(jié)藏羊卵母細胞成熟和顆粒細胞凋亡的代謝途徑(圖12)，在該預測途徑中發(fā)現HSP27基因能激活MAPK、mTOR和TGF-β信號通路，HSP27基因在藏羊卵泡發(fā)育中具有重要作用。

圖11 HSP27基因互作網絡圖

圖12 HSP27基因通路預測圖

綜合以上結果，檢索KEGG數據庫發(fā)現，HSP27蛋白與BMPR-1B、GDF5、ERK1、Calmodulin、Bcl-2和SOD[Cu-Zn]具有強烈交互作用。

3 討論與結論

本研究將HSP27基因目的片段插入pMD19-T載體后，將其與pcDNA3.1a真核表達質粒載體連接，構建出HSP27基因真核表達體系并制備單克隆抗體。HSP27基因的編碼區(qū)長為618 bp，HSP27蛋白的分子量為22.334 KD，分子式為C999H1539N281O299S2，等電點為6.22。

本研究結果表明藏羊HSP27基因編碼蛋白共含有20種氨基酸，其中含量最高的是絲氨酸，占總氨基酸的9.5%，且該蛋白有18個絲氨酸磷酸化位點，包括Ser9、Ser15、Ser44、Ser48、Ser50、Ser70、Ser74、Ser78、Ser79和Ser82等。夏佳音等[12]研究發(fā)現HSP27蛋白主要有3個磷酸化位點，分別為Ser15、Ser78和Ser82，這與本文的研究結果有著一定的相似性。磷酸化的HSP27蛋白可與F-actin、β-Arrestin2結合，使其具有穩(wěn)定細胞骨架和抑制細胞凋亡的功能，從而達到維護細胞穩(wěn)定和阻止細胞凋亡的作用[13-14]。

本研究發(fā)現HSP27蛋白具有結合HSP27、HSP10、ERK1、Bcl-2、BMPR-1B、MTHFR、RhoD、ANXA2、Calmodulin、Transgelin、GDF5、Galectin-1、PEBP、LDH-1和SOD[Cu-Zn]等15種目的蛋白的能力。GDF5、BMPR-1B通過促進孕酮、雌二醇等的合成使卵巢顆粒細胞加快分化，促進卵泡成熟[15-16]；HSP10直接或間接地參與細胞增殖凋亡、生殖等過程[17]；RhoD被激活后參與細胞分化、細胞因子的產生和細胞凋亡等多種細胞生理過程[18]；Calmodulin是細胞內鈣離子信號的主要受體，在細胞增殖、凋亡等許多方面起著重要的作用[19]；Transgelin通過抑制GnRH的分泌間接影響動物的繁殖性能[20]；MTHFR基因突變會導致機體細胞的周期調控、DNA復制等生物過程紊亂[21]；SOD[Cu-Zn]可抑制卵母細胞的有絲分裂和減數分裂[22]。HSP27蛋白與14種已識別候選蛋白具有特異性相互作用，可調控細胞的增殖、分化和凋亡。

本研究通過預測HSP27基因在藏羊卵母細胞成熟及顆粒細胞調亡中的作用通路，發(fā)現HSP27基因能激活MAPK、mTOR和TGF-β信號通路。通過檢索KEGG數據庫發(fā)現，HSP27蛋白與BMPR-1B、GDF5、ERK1、Calmodulin、Bcl-2和SOD[Cu-Zn]具有強烈交互作用。MAPK信號通路在卵母細胞減數分裂過程起調控作用，參與FSH誘導卵母細胞減數分裂[23]。卵母細胞生發(fā)泡破裂期發(fā)生的時候，磷酸化的HSP27蛋白能激活p38-MAPK通路導致孕酮等蛋白水平上升從而促進卵母細胞發(fā)育成熟[24]。mTOR信號通路是細胞生長的主導信號調節(jié)通路，其調節(jié)卵母細胞的減數分裂成熟等一系列卵巢功能[25]。TGF-β信號通路對卵泡細胞的分化和類固醇激素的合成具有重要的調節(jié)作用。因此，HSP27基因在藏羊卵巢卵泡發(fā)育和卵母細胞成熟過程中具有重要作用。