魯 藝，史文君，黃淑丹，肖 明

(1.青海大學(xué)，青海 西寧 810016； 2.青海大學(xué)農(nóng)林科學(xué)院，青海 西寧 810016；3.青海高原林木遺傳育種實(shí)驗(yàn)室，青海 西寧 810016)

苦水玫瑰(RosaSetate×RosaRugosa)是薔薇科(Rosaceae)薔薇屬(Rosa)落葉灌木，是鈍齒薔薇與中國(guó)玫瑰的自然雜交種，是中國(guó)的四大玫瑰品系之一[1-2]?？嗨倒遄鳛樵耘嗥贩N已有兩百多年的歷史，主產(chǎn)地位于甘肅省永登縣苦水鎮(zhèn)。此外，在甘肅省蘭州市、四川省眉山市、山東省平陰縣等地也有少量栽培[2]?？嗨倒鍨閲?guó)內(nèi)外出名的加工型玫瑰品種，是藥食同源的經(jīng)濟(jì)類灌木樹(shù)種，具有極高的經(jīng)濟(jì)、營(yíng)養(yǎng)、藥用等價(jià)值，市場(chǎng)需求較大。生產(chǎn)中多采用無(wú)性繁殖方式進(jìn)行苦水玫瑰種苗繁育[3]。目前，大馬士革玫瑰[4-5]、保加利亞玫瑰[6]、紫枝玫瑰[7]、野生玫瑰[8-10]、平陰玫瑰[11]的組織培養(yǎng)及其影響因素的研究已經(jīng)取得了一些進(jìn)展，一般選用玫瑰莖段為外植體，以MS或WPM培養(yǎng)基作為基本培養(yǎng)基，研究植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑濃度和組合對(duì)不定芽誘導(dǎo)的影響，建立成熟的組培快繁體系。不同玫瑰品種組培方法差異較大，而對(duì)于苦水玫瑰的組織培養(yǎng)技術(shù)研究較少。傳統(tǒng)苦水玫瑰多采用扦插繁殖，后嫁接培養(yǎng)，但苗木繁育周期長(zhǎng)、工序繁雜。當(dāng)前僅有張武等[12]初步研究了苦水玫瑰苗的誘導(dǎo)、增殖、繼代和生根等技術(shù)，但仍存在誘導(dǎo)率低、生根困難、生根率低等問(wèn)題，且未涉及消毒方案的比較試驗(yàn)，因此，對(duì)于苦水玫瑰組培快繁體系的建立仍需進(jìn)一步研究。為進(jìn)一步完善苦水玫瑰組培快繁體系，提高組培的誘導(dǎo)率、增殖率、生根率，本試驗(yàn)對(duì)苦水玫瑰的外植體消毒、不定芽增殖、生根誘導(dǎo)等過(guò)程中的各種影響因素進(jìn)行了研究，旨在為苦水玫瑰育苗提供一定的技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

苦水玫瑰采自于青海省海東市互助土族自治縣威遠(yuǎn)鎮(zhèn)秀美農(nóng)林科技有限公司種植基地北郊山坡旱地(101°55′E，36°50′N)，海拔2 620 m，屬大陸寒溫帶氣候。剪取生長(zhǎng)健壯、無(wú)病蟲害的當(dāng)年生半木質(zhì)化枝條作為供試材料。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件 啟動(dòng)培養(yǎng)、增殖培養(yǎng)、生根培養(yǎng)分別以MS、WPM和1/2MS為基本培養(yǎng)基，添加蔗糖3%、瓊脂0.7%，用NaOH或HCl將培養(yǎng)基pH調(diào)至5.8～6.0，121 ℃高壓滅菌20 min。待培養(yǎng)基冷卻至60 ℃左右時(shí)，添加植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑。培養(yǎng)溫度為(25±2)℃，光照強(qiáng)度為2 000 lx，每天光照時(shí)間為16 h。

1.2.2 外植體處理 2020年5月下旬采集露地栽培的苦水玫瑰植株上半木質(zhì)化枝條，清除枝條表面的污物后，用流水沖洗1.5～3 h。將其剪成4～5 cm長(zhǎng)的帶芽莖段，首先用70%乙醇消毒30 s，接著倒入消毒劑消毒，并不斷搖動(dòng)振蕩，再用無(wú)菌水清洗5～6次，洗去殘留的消毒劑。最后用無(wú)菌濾紙吸干外植體表面水分，將其剪成長(zhǎng)度約 1 cm的帶芽莖段，接種于啟動(dòng)培養(yǎng)基中。

試驗(yàn)設(shè)置消毒劑和消毒時(shí)間2個(gè)因素，A1、A2、A3處理分別為選用1%次氯酸鈉(NaClO)消毒10、14、18 min，A4、A5、A6處理分別為選用0.1%升汞(HgCl2)溶液處理4、6、8 min，共計(jì)6個(gè)處理。

1.2.3 啟動(dòng)培養(yǎng) 以MS為基本培養(yǎng)基，添加1.0 mg/L 6-芐基腺嘌呤(6-benzylaminopurine，6-BA)、0.1 mg/L萘乙酸(naphthalene acid，NAA)、3%蔗糖、0.7%瓊脂粉，作為苦水玫瑰啟動(dòng)培養(yǎng)的培養(yǎng)基。外植體接種于啟動(dòng)培養(yǎng)基中，然后將培養(yǎng)瓶置于培養(yǎng)室進(jìn)行培養(yǎng)，15 d后統(tǒng)計(jì)不同處理下的污染率、褐化率、萌芽率：

污染率=污染外植體數(shù)/接種外植體數(shù)×100%

(1)

褐化率=褐化數(shù)/接種外植體數(shù)×100%

(2)

萌芽率=萌芽外植體數(shù)/接種外植體數(shù)×100%

(3)

1.2.4 增殖培養(yǎng) 增殖誘導(dǎo)培養(yǎng)基以WPM為基本培養(yǎng)基，分別添加不同濃度的6-BA(0.25、0.5、0.75、1.0和1.25 mg/L)和0.2 mg/L NAA，共設(shè)置5個(gè)處理(B1、B2、B3、B4和B5)。每瓶接種3～4株試管苗，每個(gè)處理接種15株，3次重復(fù)，培養(yǎng)條件同上，60 d后觀察生長(zhǎng)增殖情況，統(tǒng)計(jì)不同培養(yǎng)基下的平均株高、增殖系數(shù)：

增殖系數(shù)=接種后所得芽數(shù)/接種總數(shù)

(4)

1.2.5 生根培養(yǎng) 以1/2MS為基本培養(yǎng)基，設(shè)置不同濃度的NAA(0、0.1、0.2、0.3、0.4 mg/L)，共5個(gè)處理(CK、C1、C2、C3和C4)。每瓶接種3～4株試管苗，每個(gè)處理接種15株，3次重復(fù)，培養(yǎng)條件同上，60 d后觀察生根情況，統(tǒng)計(jì)各處理的生根率、平均生根條數(shù)和平均根長(zhǎng)：

生根率=生根數(shù)/接種數(shù)×100%

(5)

平均生根條數(shù)=生根條數(shù)之和/接種總數(shù)

(6)

平均根長(zhǎng)=根長(zhǎng)之和/生根條數(shù)

(7)

1.2.6 煉苗與移栽 將生根苗的封口膜解開(kāi)放置1 w，使生根苗逐漸適應(yīng)外界環(huán)境后，取出生根苗，除去根部殘余培養(yǎng)基。選取根系生長(zhǎng)健壯的生根苗共計(jì)100株，移入裝有滅菌基質(zhì)(珍珠巖∶蛭石∶草炭=1∶2∶1)的5×10孔穴盤中，每孔移入1株生根苗，置于溫室，并加蓋透光塑料罩，溫度(25±2)℃，相對(duì)濕度 70%～90%，定期澆水，移栽 14 d后統(tǒng)計(jì)移栽成活率。

1.3 數(shù)據(jù)分析

使用Excel 2007進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，用SPSS 26.0進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 消毒方法對(duì)苦水玫瑰外植體消毒效果的影響

啟動(dòng)培養(yǎng)(圖1a)前對(duì)外植體進(jìn)行消毒。由表1可知，隨著1%NaClO消毒時(shí)間的延長(zhǎng)，褐化率逐漸提高，萌芽率呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，經(jīng)0.1%HgCl2消毒的外植體的褐化率顯著高于1%NaClO處理的褐化率。A2～A6處理的外植體均有不同程度的褐化和污染現(xiàn)象，其中A2處理(70%酒精消毒30 s，1%NaClO消毒14 min)外植體的褐化率和污染率最低，而萌芽率最高，可達(dá)90.91%。

表1 消毒方法對(duì)苦水玫瑰外植體消毒效果的影響

圖1 苦水玫瑰啟動(dòng)培養(yǎng)、增殖培養(yǎng)和生根培養(yǎng)

2.2 植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑種類及其配比對(duì)苦水玫瑰增殖的影響

以WPM為培養(yǎng)基，添加不同濃度和配比的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑進(jìn)行增殖培養(yǎng)，苦水玫瑰的增殖系數(shù)和苗高生長(zhǎng)情況有顯著性差異(表2)?？嗨倒迤骄旮唠S著6-BA濃度的升高而逐漸下降，增殖系數(shù)隨著6-BA濃度的升高先增加再降低。當(dāng)6-BA濃度為0.50 mg/L和0.75 mg/L時(shí)，增殖系數(shù)分別可達(dá)4.10和4.07，兩者之間無(wú)顯著差異，且顯著高于其他處理組。但B3處理下，試管苗的平均株高較低，植株長(zhǎng)勢(shì)較差，而B2處理叢生芽生長(zhǎng)健壯(圖1b)，因此B2處理為最適6-BA濃度。可見(jiàn)適宜苦水玫瑰組織培養(yǎng)繼代增殖的培養(yǎng)基為WPM+0.5 mg/L 6-BA + 0.2mg/L NAA 。

表2 生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑種類及其配比對(duì)苦水玫瑰增殖培養(yǎng)的影響

2.3 NAA濃度對(duì)苦水玫瑰生根的影響

以1/2 MS為基本培養(yǎng)基，添加不同濃度的NAA進(jìn)行生根培養(yǎng)。由表3可知，添加NAA處理的生根率均顯著高于CK處理，NAA能顯著促進(jìn)苦水玫瑰組培苗生根。在NAA濃度為0～0.4 mg/L的范圍內(nèi)，隨著NAA濃度的升高，生根率和平均生根條數(shù)呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢(shì)，C4處理組培苗生根率最高，平均生根條數(shù)最多，且該處理的組培苗平均株高和根長(zhǎng)與CK處理無(wú)顯著差異。因此，對(duì)組培苗平均株高、生根率、平均生根數(shù)和平均根長(zhǎng)綜合考慮，適宜苦水玫瑰組培苗的生根培養(yǎng)基為1/2MS+0.4 mg/L NAA(圖1c、圖1d)。

表3 NAA濃度對(duì)苦水玫瑰生根的影響

2.4 煉苗與移栽

煉苗后將植株生長(zhǎng)健壯、根系生長(zhǎng)良好的苦水玫瑰苗移栽至混合基質(zhì)(珍珠巖∶蛭石∶草炭=1∶2∶1)中，正常日常管理，14 d后苦水玫瑰生根苗的存活率為67%，生根苗長(zhǎng)勢(shì)良好，葉呈綠色。

3 討論與結(jié)論

(1)外植體消毒滅菌是植物組織培養(yǎng)技術(shù)中的關(guān)鍵一步，不僅要求對(duì)外植體進(jìn)行徹底滅菌，還要盡可能減少對(duì)外植體的損害，保證外植體仍具有旺盛的生長(zhǎng)分化能力，因此選擇合適的消毒方法對(duì)外植體滅菌至關(guān)重要[13]。余志杰等[10]研究指出野生玫瑰莖段的最適消毒方案為75%乙醇0.5 min+0.1%升汞(添加吐溫-20)12 min。趙映潔等[14]研究得出紅拂玫瑰莖段的最適消毒方案為75%乙醇30 s+10%NaClO 10 min。而本研究用苦水玫瑰莖段做外植體，得出先用70%乙醇消毒30 s，再用1%NaClO消毒14 min滅菌效果最佳。消毒方案不同可能是由玫瑰品種、外植體的生長(zhǎng)狀態(tài)、外植體的生長(zhǎng)環(huán)境等的差異造成的。消毒劑的選擇和消毒時(shí)間應(yīng)依據(jù)外植體的類型、大小、木質(zhì)化程度等決定[15]，裂葉垂枝樺木質(zhì)化莖段的最佳消毒時(shí)間為0.1%HgCl210 min，幼嫩莖段的最佳消毒時(shí)間為3 min[16]，不同木質(zhì)化程度莖段的最適消毒時(shí)間不同。消毒時(shí)間過(guò)短會(huì)導(dǎo)致外植體表面滅菌不徹底，出現(xiàn)污染現(xiàn)象；而消毒時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，外植體易受滅菌劑的毒害，導(dǎo)致褐化或死亡。

(2)增殖培養(yǎng)是利用組織培養(yǎng)實(shí)現(xiàn)快繁技術(shù)必不可少的重要環(huán)節(jié)，細(xì)胞分裂素與生長(zhǎng)素的合理使用可促進(jìn)芽苗增殖。目前，已知較高的苦水玫瑰增殖系數(shù)為3.56，使用的培養(yǎng)基為WPM+1.5mg/L 6-BA[12]，與本研究結(jié)果略有差異。本研究中的增殖培養(yǎng)是在多次繼代基礎(chǔ)上進(jìn)行的，具有更高的增殖系數(shù)，增殖系數(shù)隨著6-BA濃度的增加呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，在0.5 mg/L 時(shí)有最大增殖系數(shù)(4.10)，獲得較高質(zhì)量的不定芽?？嗨倒褰M培快繁增殖系數(shù)的提高，為苦水玫瑰快繁奠定了一定基礎(chǔ)。適宜濃度的6-BA能顯著促進(jìn)不定芽的產(chǎn)生，這可能是通過(guò)影響酶(細(xì)胞壁酶、過(guò)氧化物酶、SOD等)的活性促進(jìn)培養(yǎng)物的細(xì)胞分裂和分化[17]。很多玫瑰品種在芽增殖過(guò)程中都對(duì)6-BA表現(xiàn)出了良好的反應(yīng)。徐立軍等[5]用3.0 mg/L 6-BA配合0.1mg/L NAA對(duì)大馬士革玫瑰進(jìn)行增殖培養(yǎng)，增殖系數(shù)達(dá)5.1，且苗木生長(zhǎng)良好。黃穎等[4]用1.0 mg/L 6-BA配合0.05 mg/L NAA取得較好的增殖效果。6-BA濃度過(guò)高或過(guò)低都不利于玫瑰的增殖培養(yǎng)：濃度低時(shí)，組培苗的增殖系數(shù)不高；而濃度過(guò)高時(shí)，不定芽數(shù)逐漸減少，生長(zhǎng)勢(shì)逐漸減弱，對(duì)玫瑰的莖芽伸長(zhǎng)生長(zhǎng)有抑制作用[18]。

(3)生根培養(yǎng)階段，無(wú)機(jī)離子減半有利于生根[19]，用于玫瑰試管苗生根的3種生長(zhǎng)素中，NAA的生根效果較好，而IBA和IAA誘導(dǎo)出的根系較為細(xì)弱，長(zhǎng)勢(shì)較差[6]，且ABA激素與IAA、IBA、NAA等多種激素配合使用不能促進(jìn)玫瑰生根[20]。因此，本試驗(yàn)以1/2 MS為基本培養(yǎng)基，添加不同濃度的NAA展開(kāi)試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)NAA能顯著促進(jìn)苦水玫瑰組培苗生根，趙鋼等[8]研究表明，以1/2 MS+0.1 mg/L NAA培養(yǎng)基誘導(dǎo)野生玫瑰生根的效果最好。此外，本試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)在0～0.4 mg/L濃度范圍內(nèi)，隨著NAA濃度的增加，生根率和生根數(shù)呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，其最適激素配比相比已有的苦水玫瑰生根培養(yǎng)報(bào)道，進(jìn)一步提高了生根率，更加完善了快繁體系。但生長(zhǎng)素具有兩重性，高濃度NAA會(huì)抑制根系的生長(zhǎng)，李曉亮等[21]的研究表明，隨著NAA濃度的逐步增大，玫瑰莖段基部愈傷組織逐漸增多，但莖段成株率和生根率卻逐漸降低，NAA濃度過(guò)高致使莖段大量愈傷化而不能分化形成植株，需合理控制NAA濃度，以促進(jìn)組培苗生根。

本試驗(yàn)對(duì)外植體消毒方法及增殖培養(yǎng)、生根培養(yǎng)的最適培養(yǎng)基進(jìn)行了研究，初步建立了苦水玫瑰的組培快繁體系。結(jié)果表明，苦水玫瑰半木質(zhì)化枝條最適的消毒方案為先用70%乙醇消毒 30 s，然后使用1%NaClO消毒14 min，萌芽率為90.91%；增殖誘導(dǎo)培養(yǎng)基以WPM+0.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA為佳，增殖系數(shù)可達(dá)4.10；生根培養(yǎng)基以1/2 MS+0.4 mg/L NAA為佳，生根率高達(dá)92.31%，平均生根條數(shù)為3.21，平均根長(zhǎng)為0.60 cm。后期可進(jìn)一步對(duì)其抗褐化處理和生根苗移栽后的管理開(kāi)展研究，以提高成活率。