廖子龍 張培榮 吳 澤

1.深圳市鹽田區(qū)人民醫(yī)院病理科 (廣東 深圳 518000)

2.中南大學(xué)湘雅醫(yī)院病理科 (湖南 長(zhǎng)沙 410008)

BRAF基因是一種原癌基因，BRAFV600E位點(diǎn)突變導(dǎo)致細(xì)胞惡性增殖，從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。近年來學(xué)者發(fā)現(xiàn)BRAFV600E突變與甲狀腺乳頭狀癌發(fā)病密切相關(guān)[1]。通過BRAF V600E基因檢測(cè)與HE染色技術(shù)發(fā)現(xiàn)，BRAFV600E在甲狀腺乳頭狀癌患者中的突變比例達(dá)90%[2]。而BRAFV600E抗體是一種鼠單克隆抗體(克隆VE1)，是針對(duì)BRAF突變氨基酸序列(氨基酸596到606 GLATEKSRWSG)的人工合成肽。全部實(shí)體瘤中約有8%可檢出BRAFV600E突變，其中包括39%的乳頭狀甲狀腺癌[3]。該抗體在免疫組化病理層面的臨床應(yīng)用有著重要的意義；特別在只能手工免疫組化染色的醫(yī)療單位，為其提供一項(xiàng)具有操作較為簡(jiǎn)單、費(fèi)用低等優(yōu)點(diǎn)的方法，也將給患者提供更有效的診斷證明和檢查項(xiàng)目的選擇。實(shí)驗(yàn)方法如下。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象選取甲狀腺乳頭狀癌腫瘤標(biāo)本，其中BRAFV600E在腫瘤細(xì)胞中強(qiáng)陽性表達(dá)的組織5例，采用相同的高壓修復(fù)方式和同一批號(hào)的羅氏一抗試劑。以二抗滴加HRP30min設(shè)為實(shí)驗(yàn)組1，滴加ES(反應(yīng)放大劑+高敏型酶標(biāo)抗小鼠/兔IgG聚合物)并根據(jù)放大劑和聚合物的不同作用時(shí)間設(shè)為實(shí)驗(yàn)組2～8，分別為實(shí)驗(yàn)組2(放大劑15min+聚合物15min)、實(shí)驗(yàn)組3(放大劑30min+聚合物15min)、實(shí)驗(yàn)組4(放大劑60min+聚合物15min)，實(shí)驗(yàn)組5(放大劑30min+聚合物20min)，實(shí)驗(yàn)組6(放大劑30min+聚合物30min)，實(shí)驗(yàn)組7(放大劑30min+聚合物45min)，實(shí)驗(yàn)組8(放大劑30min+聚合物60min)，以使用全自動(dòng)免疫組化儀配套羅氏試劑染色設(shè)立對(duì)照組；在相同條件下同時(shí)進(jìn)行染色。

1.2 切片前期處理常規(guī)切片(厚3～4μm)，電熱恒溫箱65°C烤片2h以上，二甲苯脫蠟10min×3－無水酒精2min×2－95%酒精1min－90%酒精1min－80%酒精1min－水洗。

1.3 試劑與儀器BRAFV600E(VE1)抗體；DAB染色試劑盒：(1)Optiview Peroxidase Inhibiror(3%)；(2)Optiview HQ Universal Linker；(3)Optiview HRP Multimer；(4)Optiview DAB；(5)Optiview H2O2(0.04%)(6)Optiview Copper(上海羅氏診斷產(chǎn)品有限公司)。EDTA(PH9.0)修復(fù)液、HRP、ES、加強(qiáng)型DAB顯色試劑盒(福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司)。DHP-420型電熱恒溫培養(yǎng)箱(北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司)。BenchMark XT 全自動(dòng)免疫組化儀(上海羅氏診斷產(chǎn)品有限公司)。

1.4 免疫組化染色流程(1)全自動(dòng)免疫組化儀染色：按照BRAFV600E該抗體設(shè)定好的染色程序進(jìn)行染色，封片。(2)邁新試劑染色流程：EDTA(PH9.0)高壓修復(fù)噴氣后計(jì)時(shí)5min－H2O2(3%)37°C反應(yīng)10min－BRAFV600E抗體37°C孵育60min－HRP 37°C孵育30min或ES 37°C孵育(按不同實(shí)驗(yàn)組設(shè)定的時(shí)間)min－加強(qiáng)型DAB顯色試劑盒37°C作用10min－復(fù)染、封片。每個(gè)步驟間均用PBS+Tween 20液進(jìn)行清洗3次，每次3min。

1.5 結(jié)果判讀染色好的切片由副高以上病理診斷醫(yī)師以及主管技師共同閱片，這種突變特異性抗體表現(xiàn)為一種細(xì)胞漿染色模式，對(duì)腫瘤BRAFV600E抗體明確表達(dá)部位進(jìn)行對(duì)比分析，以對(duì)照組染色結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)，判斷其表達(dá)強(qiáng)度；結(jié)果以陰性(-)、弱陽(+)、中陽(++)、強(qiáng)陽(+++)進(jìn)行標(biāo)注比較[4]。

2 結(jié) 果

實(shí)驗(yàn)組1和實(shí)驗(yàn)組2，表達(dá)均為(-)(見圖1)。而5例實(shí)驗(yàn)組3、4以及2例實(shí)驗(yàn)組5表達(dá)為(+)；5例實(shí)驗(yàn)組6、3例實(shí)驗(yàn)組5以及1例實(shí)驗(yàn)組8表達(dá)為(++)；除了1例實(shí)驗(yàn)組8表達(dá)為(++)，其余實(shí)驗(yàn)組7、8均表達(dá)為(+++)。5例標(biāo)本中對(duì)照組對(duì)BRAF V600E抗體均表達(dá)為(+++)(見圖2)。

圖1 BRAF V600E陰性(-)。圖2 BRAF V600E強(qiáng)陽性(+++)。

組實(shí)驗(yàn)進(jìn)行比較，5例標(biāo)本在相同條件下呈現(xiàn)較高的一致性。實(shí)驗(yàn)組7和實(shí)驗(yàn)組8的表達(dá)強(qiáng)度與對(duì)照組的表達(dá)強(qiáng)度基本一致，但實(shí)驗(yàn)組7時(shí)間較短；該方法可用于甲狀腺乳頭狀癌BRAFV600E抗體免疫組化項(xiàng)目檢測(cè)。

3 討 論

近年來，甲狀腺乳頭狀癌作為甲狀腺癌的主要腫瘤類型，其發(fā)病率逐年增高。研究表明，BRAF基因V600E突變檢測(cè)在甲狀腺乳頭狀癌診斷中具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值，該基因突變與甲狀腺外侵犯、淋巴結(jié)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、腫瘤進(jìn)展或復(fù)發(fā)密切相關(guān)[5-6]?；诨驒z測(cè)時(shí)間長(zhǎng)、費(fèi)用高等因素，BRAFV600E抗體逐漸開始應(yīng)用于病理免疫組化檢測(cè)中。由于該抗體檢測(cè)條件要求較高，目前并沒有一個(gè)公認(rèn)的較好的手工免疫組化操作方法。目前在羅氏全自動(dòng)免疫組化儀加強(qiáng)型試劑染色效果較好，但仍有部分基層單位因各種原因未能使用全自動(dòng)免疫組化儀；本項(xiàng)目通過對(duì)羅氏全自動(dòng)染色流程的解讀，對(duì)修復(fù)條件以及不同試劑的不同孵育時(shí)間進(jìn)行摸索并試驗(yàn)，確定BRAFV600E抗體手工免疫組化染色的最佳染色條件[7-8]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，5例標(biāo)本中對(duì)照組BRAFV600E抗體均表達(dá)為強(qiáng)陽性。各實(shí)驗(yàn)組間的表達(dá)結(jié)果呈現(xiàn)較高的一致性；其中實(shí)驗(yàn)組1和實(shí)驗(yàn)組2，結(jié)果顯示均為陰性(-)，未能表達(dá)BRAFV600E抗體。而5例實(shí)驗(yàn)組3、4以及2例實(shí)驗(yàn)組5表達(dá)為弱陽性(+)；5例實(shí)驗(yàn)組6、3例實(shí)驗(yàn)組5以及1例實(shí)驗(yàn)組8表達(dá)為中陽性(++)；除了1例實(shí)驗(yàn)組8表達(dá)為中陽性(++)，其余實(shí)驗(yàn)組7、8均表達(dá)為強(qiáng)陽性(+++)(表1)。提示適當(dāng)增加反應(yīng)放大劑和高敏型酶標(biāo)抗小鼠/兔IgG聚合物的反應(yīng)時(shí)間可以增強(qiáng)表達(dá)效果；從實(shí)驗(yàn)組2至實(shí)驗(yàn)組7的表達(dá)強(qiáng)度上看，試劑1(反應(yīng)放大劑)反應(yīng)時(shí)間為30min的表達(dá)強(qiáng)度最佳，與反應(yīng)時(shí)間為60min的表達(dá)強(qiáng)度是一致的；試劑2(高敏型酶標(biāo)抗小鼠/兔IgG聚合物)隨著時(shí)間延長(zhǎng)表達(dá)強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，但反應(yīng)30min與45min強(qiáng)度基本一致。因此，從表達(dá)強(qiáng)度和時(shí)間上考慮，選擇反應(yīng)30min最理想。在染色成本方面，主要計(jì)算一抗修復(fù)液、一抗試劑、二抗試劑以及顯示試劑費(fèi)用，該數(shù)據(jù)為根據(jù)廠家采購(gòu)價(jià)粗略計(jì)算；實(shí)驗(yàn)組1每人份為42.12元，實(shí)驗(yàn)組2～8每人份為41.99元，對(duì)照組每人份為103.7元；如此看來，使用全自動(dòng)免疫組化儀的染色成本明顯高于手工染色，這也是一部分單位考慮的因素。在完成染色時(shí)限方面，從抗原修復(fù)開始至DAB顯色結(jié)束進(jìn)行計(jì)時(shí)，實(shí)驗(yàn)組1與實(shí)驗(yàn)組2用時(shí)最短，均為117min，實(shí)驗(yàn)組4與實(shí)驗(yàn)組8用時(shí)較長(zhǎng)，為162min，實(shí)驗(yàn)組3、5用時(shí)132min，實(shí)驗(yàn)組6用時(shí)137min，實(shí)驗(yàn)組7用時(shí)為147min，而全自動(dòng)免疫組化儀染色時(shí)間最長(zhǎng)，為248分min，明顯高于手工染色時(shí)間(表1)。

表1 5例實(shí)驗(yàn)組以及對(duì)照組的時(shí)效性、經(jīng)濟(jì)性對(duì)比情況

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，使用全自動(dòng)免疫組化儀染色效果最理想，但涉及儀器采購(gòu)問題，染色時(shí)間較長(zhǎng)，染色成本也較高； 而手工免疫組化染色中實(shí)驗(yàn)組7的染色效果較理想，能滿足于病理診斷，染色時(shí)間較全自動(dòng)免疫組化儀短，其費(fèi)用也更低；為滿足基層單位BRAFV600E抗體手工免疫組化染色的需求，本實(shí)驗(yàn)提供兩家不同廠家、不同染色條件的手工免疫組化染色方法，可根據(jù)各單位需求做出選擇?；谑止と旧徒Y(jié)果判讀上仍存在一定的人為因素，判讀結(jié)果存在個(gè)別差異性。另本實(shí)驗(yàn)由于病例數(shù)較少，未能產(chǎn)生統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，數(shù)據(jù)還需進(jìn)一步積累分析；并且單一廠家實(shí)驗(yàn)試劑較局限，其他廠家試劑對(duì)BRAFV600E抗體的表達(dá)情況如何？還需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)摸索。