雷 毅，張 晨，李思瑤，陳 艷

（1新疆醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院衛(wèi)生毒理學(xué)教研室，烏魯木齊 830011；2嘉興學(xué)院醫(yī)學(xué)院，浙江 嘉興 314000）

食管癌(Esophageal cancer，EC)是全球八大常見惡性腫瘤之一，我國食管癌發(fā)病率居各類腫瘤第5位，病死率居第4 位[1]。幽門螺桿菌（Helicobacter pylori,HP）是一種厭氧型革蘭氏陰性菌，主要定居于胃黏膜細(xì)胞中并與消化系統(tǒng)相關(guān)疾病密切相關(guān)。細(xì)胞毒性相關(guān)因子（CagA）是幽門螺桿菌中特有的毒力因子，Li等[2]發(fā)現(xiàn)，在食管癌患者中CagA檢出率增高，在食管癌高發(fā)地區(qū)，食管癌患者中CagA 陽性率高達79.5%，幽門螺桿菌感染可以促進細(xì)菌的過度生長和內(nèi)源性亞硝胺物質(zhì)的生成，從而促進食管鱗狀細(xì)胞癌的產(chǎn)生[3]。盡管HP 與胃內(nèi)相關(guān)性疾病的關(guān)系已被證實，但其與食管的病變及癌癥的關(guān)系尚不明確。亞硝胺是一大類具有強致癌性的化學(xué)物質(zhì)，廣泛分布于生活中。單功能烷化劑N-甲基-N'-硝基-N-亞硝 基 胍 (N-Methyl-N'-Nitro-N-Nitrosoguanidine，MNNG)是一種常用來誘導(dǎo)細(xì)胞癌變的亞硝胺類物質(zhì)，常被用于食管癌、胃癌等細(xì)胞模型和動物模型[4-6]的建立。目前普遍認(rèn)為癌癥是多種因素共同作用的結(jié)果，因此采用HP 聯(lián)合MNNG 染毒人食管上皮細(xì)胞，觀察多種外界不良因素對細(xì)胞增殖及周期的影響，為探索食管癌病因及預(yù)防提供依據(jù)。

1 材料、儀器及方法

1.1 材料及儀器人食管上皮細(xì)胞（HEEC）來自ATCC，幽門螺桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株（ATCC26695）來源于廣東省微生物菌種保藏中心。MNNG(上海羅恩)、RPMI 1640(Gibco)、胎牛血清(Gibco)、PBS(Gibco)、胰蛋白酶(Gibco)、巧克力血瓊脂平板（鄭州安圖生物）、細(xì)胞增殖試劑盒(MCE)、細(xì)胞周期試劑盒（聯(lián)科生物）、抗體Cyclin B1（CST）、抗體GAPDH（ABclonal）等。酶標(biāo)儀、倒置熒光顯微鏡、CO2培養(yǎng)箱、BD 流式細(xì)胞儀、厭氧培養(yǎng)箱等。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及細(xì)菌培養(yǎng)HEEC 細(xì)胞培養(yǎng)采用T25細(xì)胞瓶，加入5 mL 含10%胎牛血清和1%雙抗的RPMI 1640 培養(yǎng)基，聯(lián)合感染時采用無雙抗培養(yǎng)基，于37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。HP 接種于巧克力血瓊脂平板中，放入37℃厭氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，調(diào)整厭氧箱氣體濃度至5%O2，10%CO2和85%N2。

1.2.2 HP 濃度測定HP 采用稀釋涂布平板法接種于巧克力血瓊脂平板中，于厭氧箱內(nèi)生長3～5 d 后，平板內(nèi)長出透明針尖狀菌落，于超凈工作臺內(nèi)用一次性接種棉簽輕輕刮取菌落于PBS 中，2500 rpm/min，離心5 min 后，PBS 重懸，紫外分光光度計測其OD660，1OD660=1×108CFU/mL，取感染復(fù)數(shù)（MOI）=100∶1，即細(xì)菌∶細(xì)胞=100∶1加入到細(xì)胞中。

1.2.3 MNNG 半數(shù)抑制濃度（IC50）測定HEEC 細(xì)胞正常培養(yǎng)至80%左右，胰蛋白酶消化，采用血平板計數(shù)法調(diào)整細(xì)胞濃度至3×104個/mL，輕輕吹打均勻后，取100μL/孔接種于96孔板，24 h棄去原培養(yǎng)液，采用倍比稀釋法配置MNNG 濃度為0、10、20、40、80、120、160、200 μmoL/L 的 培 養(yǎng) 基，染 毒24 h 后 棄 去 含MNNG的培養(yǎng)基，加入CCK8試劑，并計算抑制率。抑制率=[（OD 對照-OD 實驗）/（OD 對照-OD 空白）]×100%。

1.2.4 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 HEEC 細(xì)胞分組為對照組、MNNG 處理組、HP處理組以及HP與MNNG 聯(lián)合處理組（簡稱聯(lián)合組），待細(xì)胞生長至80%以上時，取出細(xì)胞，于超凈工作臺內(nèi)PBS 清洗2 次后補加5 mL 培養(yǎng)液，在顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.5 細(xì)胞增殖測定 細(xì)胞分組同上，分別感染1、6、12 h 后，消化離心，并于每孔5000 個接種于96 孔 板，并 設(shè) 置4 個 復(fù) 孔，24 h 后，每100 μL 培養(yǎng)基加入10 μL CCK8 試劑，37℃孵育1～2 h 后用酶標(biāo)儀測OD450。

1.2.6 細(xì)胞周期測定HEEC 消化計數(shù)后以每孔4×104個每孔接種于六孔板，MNNG濃度為1/2 IC50，HP感染復(fù)數(shù)（MOI）=100∶1，分組同上，分別感染1、6、12 h 后收集細(xì)胞，PBS 清洗2 次，70%乙醇固定過夜，離心棄去乙醇，PBS清洗并室溫放置10～15 min使細(xì)胞水化，然后加入1 mL 1×staining buffer，室溫孵育30 min 后，采用最低上樣速度上機檢測。

1.2.7 細(xì)胞周期蛋白Cyclin B1 測定 細(xì)胞染毒處理后，胰酶消化并用PBS 重懸，加入裂解液與蛋白酶抑制劑，于冰上裂解30 min，每隔10 min渦旋混勻，裂解完成后離心收集上清。采用蛋白質(zhì)免疫印跡法（Western blot）檢測Cyclin B1蛋白表達量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理應(yīng)用SPSS21.0 軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，采用單因素方差分析及趨勢性檢驗，均數(shù)兩兩比較采用LSD法，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MNNG 對人正常食管上皮細(xì)胞IC50值測定不同濃度MNNG 對HEEC 細(xì)胞處理后，采用CCK8 法測定其OD450，根據(jù)公式計算其抑制率，經(jīng)計算得出MNNG對HEEC 半數(shù)抑制濃度IC50=40.90 μmoL/L，采用1/2 IC50為MNNG染毒濃度。見圖1。

圖1 不同濃度MNNG對人正常食管上皮細(xì)胞的抑制率

2.2 細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化經(jīng)1 h處理后，各組細(xì)胞形態(tài)未有明顯變化，經(jīng)6、12 h 處理后HP 處理組和聯(lián)合組細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化，對照組和MNNG 處理組無明顯變化，下圖為處理12 h 后各組細(xì)胞形態(tài)。HEEC 細(xì)胞正常形態(tài)呈梭型（圖a），為典型的“上皮樣”細(xì)胞，細(xì)胞大小均勻，長滿后呈“鋪路石”樣排列，細(xì)胞邊緣清晰，胞質(zhì)均勻，細(xì)胞核位于細(xì)胞中心位置。偶見有巨大型細(xì)胞，為該細(xì)胞株特有，數(shù)量在10%左右均為正常。經(jīng)HP 處理后（圖b），可見細(xì)胞內(nèi)胞質(zhì)紊亂，且伴隨有空泡生成，細(xì)胞出現(xiàn)“蜂鳥樣”變化。MNNG處理后的細(xì)胞形態(tài)（圖c）未發(fā)生明顯變化。HP 聯(lián)合MNNG 處理后的細(xì)胞形態(tài)（圖d），出現(xiàn)細(xì)胞質(zhì)不均勻、空泡樣變化等。見圖2。

圖2 不同處理組12 h細(xì)胞形態(tài)(×200)

2.3 HP 聯(lián)合MNNG 對人正常食管上皮細(xì)胞增殖的影響HEEC 細(xì)胞正常情況下生長速度較快，給予HP與MNNG 處理后隨著染毒時間的延長，增殖速度減慢。經(jīng)1、6、12 h 處理后，各組細(xì)胞增殖速度差異均有 統(tǒng) 計 學(xué) 意 義（F=20.46，P＜0.001；F=151.10，P＜0.001；F=484.73，P＜0.001）；經(jīng)過1、6、12 h 處理時間后，經(jīng)趨勢性檢驗發(fā)現(xiàn)其增殖速度為聯(lián)合組＜HP處理組＜MNNG 處理組＜對照組（F1 h趨勢=1089.3，P＜0.001；F6 h趨勢=322.78，P＜0.001；F12 h趨勢=50.01，P＜0.001）。隨著處理時間的延長，對照組增殖速度無明顯變化，其余各處理組增殖速度逐漸變緩，經(jīng)趨勢性檢驗有統(tǒng)計 學(xué) 意 義（FMNNG=65.01，P＜0.001；FHP=370.44，P＜0.001；F聯(lián)合=98.46，P＜0.001）。見表1。

表1 不同處理組不同時間對人正常食管上皮細(xì)胞增殖速度的影響（±s，n=3）

表1 不同處理組不同時間對人正常食管上皮細(xì)胞增殖速度的影響（±s，n=3）

注：與對照組相比，**P＜0.01；與聯(lián)合組相比，#P＜0.05，##P＜0.01。

組別對照組HP處理組MNNG處理組聯(lián)合組FP 1 h OD值1.04±0.03##0.93±0.07**#0.90±0.01**##0.82±0.02**20.46＜0.0016 h OD值1.04±0.02##0.75±0.02**#0.77±0.02**#0.70±0.02**151.10＜0.00112 h OD值1.03±0.03##0.69±0.01**0.72±0.01**0.65±0.01**484.73＜0.001 F 0.0435.31197.5752.33 P 0.958＜0.001＜0.001＜0.001

2.4 HP 聯(lián)合MNNG 對人正常食管上皮細(xì)胞周期的影響經(jīng)1 h 處理后，4 組G0/G1、S、G2/M 細(xì)胞周期差異 有 統(tǒng) 計 學(xué) 意 義（F=22.33，P＜0.001；F=11.57，P＜0.001；F=11.90，P＜0.05），主要為G0/G1 期所占比例的減小與G2/M 期的阻滯；經(jīng)6 h 處理后，4 組G0/G1、S、G2/M細(xì)胞周期差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（F=133.48，P＜0.001；F=4.74，P＜0.05；F=39.55，P＜0.001），主要為G0/G1期所占比例的減小與S期、G2/M 期的阻滯；經(jīng)12 h處理后，4 組G0/G1、S、G2/M 細(xì)胞周期差異有統(tǒng)計學(xué)意 義（F=104.36，P＜0.001；F=63.80，P＜0.001；F=55.91，P＜0.001），此時G0/G1 期所占比例更小，G2/M期阻滯更嚴(yán)重。見表2。隨著染毒時間的延長，其周期差異主要表現(xiàn)為G2/M 期的變化，作用時間越長，G2/M 期阻滯越嚴(yán)重，經(jīng)趨勢性檢驗有統(tǒng)計學(xué)意義（FHP=238.76，P＜0.001；FMNNG=182.47，P＜0.001；F聯(lián)合=58.43，P＜0.001），分別在1、6、12 h 處理后對各處理組的G2/M期阻滯情況進行趨勢檢驗發(fā)現(xiàn)呈線性上升趨勢（F1 h=32.73，P＜0.001；F6 h=70.37，P＜0.001；F12 h=125.41，P＜0.001），聯(lián)合組對G2/M 的阻滯效果大于HP和MNNG單獨處理組。見圖3。

表2 不同處理組不同時間對人正常食管上皮細(xì)胞周期變化的影響（±s，n=3）

表2 不同處理組不同時間對人正常食管上皮細(xì)胞周期變化的影響（±s，n=3）

注：與對照組相比，*P＜0.05，**P＜0.01；與聯(lián)合組相比，#P＜0.05，##P＜0.01。

實驗分組對照組HP處理組MNNG處理組聯(lián)合組FP 1 h G0/G1/%59.14±0.31##62.12±2.20##48.08±3.03*#39.41±5.17**22.33＜0.001 S/%31.88±0.63#26.28±2.17*##35.84±3.3236.52±2.62*11.57＜0.001 G2/M/%8.70±0.65##9.07±1.74##12.82±0.54*#16.55±3.15**11.900.0036 h G0/G1/%58.95±0.42##28.30±0.31**30.69±4.11**30.28±0.97**133.48＜0.001 S/%29.96±1.77#42.29±0.63**41.07±8.22*39.01±2.76*4.740.003 G2/M/%10.74±1.44##29.12±0.32**25.30±4.00**29.61±2.36**39.55＜0.00112 h G0/G1/%58.62±6.93##39.21±2.40**##9.63±1.95**8.05±3.82**104.36＜0.001 S/%26.01±4.60##25.44±0.51##48.34±3.12**48.78±1.26**63.80＜0.001 G2/M/%10.56±2.43##33.88±2.91**#39.79±1.28**39.53±5.02**55.91＜0.001

圖3 不同處理組不同時間對人正常食管上皮細(xì)胞周期影響

2.5 HP 聯(lián)合MNNG 對人正常食管上皮細(xì)胞周期蛋白表達的影響不同組別染毒后，提取蛋白并檢測Cyclin B1 蛋白表達量，與對照組相比，其余3 組細(xì)胞Cyclin B1 蛋白表達量均顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.001），以聯(lián)合組Cyclin B1 表達最高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001），見圖4、5。

圖4 不同處理組Cyclin B1蛋白表達量

圖5 不同處理組Cyclin B1蛋白表達量的比較

3 討論

食管癌是在多種因素共同作用下發(fā)生的。食管癌的發(fā)展是食管上皮細(xì)胞在酸性條件下或營養(yǎng)不良，逐漸柱狀化，并最終惡化。食管癌發(fā)生的危險因素包括吸煙、飲酒、亞硝胺攝入等[7-8]，現(xiàn)在越來越多的證據(jù)也表明食管微生物失調(diào)也可能是食管癌病因的一個潛在危險因素[9]。

在食管癌高發(fā)地區(qū)的食物和水中檢測發(fā)現(xiàn)硝酸鹽、亞硝酸鹽含量顯著增高，這些物質(zhì)攝入后在體內(nèi)和胺類在酸性條件下生成亞硝胺類。國際癌癥研究機構(gòu)(IARC)得出結(jié)論，沒有實質(zhì)性證據(jù)表明硝酸鹽是動物致癌物[10]，但亞硝酸鹽與胺或酰胺的結(jié)合物已被證明對動物有致癌作用。大多數(shù)亞硝胺可通過引起基因突變和DNA 加合物發(fā)揮對動物的致癌作用，流行病學(xué)證據(jù)也表明攝入過多的硝酸鹽、亞硝酸鹽與食管癌、胃癌等相關(guān)疾病[11]的發(fā)生呈正相關(guān)。MNNG 是一種具有強大的誘變和致癌作用的亞硝基化合物，MNNG具有使真核生物誘變和染色體斷裂的能力，與食管癌和胃癌的形成密切相關(guān)，并被廣泛用來誘導(dǎo)胃黏膜上皮細(xì)胞[12]和食管上皮細(xì)胞[13]的惡性轉(zhuǎn)化和大鼠胃腸道癌變模型[14-15]等。

幽門螺桿菌（HP）是唯一被認(rèn)定為人類I 類致癌物的細(xì)菌，與胃炎、胃潰瘍、胃萎縮和胃腺癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[16]。世界上有超過一半的人口感染幽門螺桿菌[17]，并繼續(xù)傳播。雖然幽門螺桿菌主要存在于胃黏膜，但其定植會影響胃和食管的微生物種群，并可能影響食管的癌變。其內(nèi)部分子機制僅被部分揭示[18]，幽門螺桿菌能分泌一些導(dǎo)致慢性炎癥和癌癥的毒素，例如細(xì)胞毒素相關(guān)基因A（CagA）、空泡細(xì)胞毒素(VacA)和黏附素。其中VacA 可以使被侵入的細(xì)胞產(chǎn)生酸性空泡，因此，在幽門螺桿菌處理組和聯(lián)合組細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，胞質(zhì)出現(xiàn)細(xì)胞空泡等變化。幽門螺桿菌可以通過激活核轉(zhuǎn)錄因子（NF-κB）來促進炎癥反應(yīng)，并誘導(dǎo)某些細(xì)胞因子的產(chǎn)生，如IL-1β、IL-2、IL-8 和腫瘤壞死因子(TNF-α)，從而觸發(fā)胃上皮的炎癥反應(yīng)。幽門螺桿菌還可以直接損傷宿主DNA，使DNA 轉(zhuǎn)錄因子如尾端同源框2(Cdx2)失調(diào)，并誘導(dǎo)上皮損傷和酸分泌功能[19]。

細(xì)胞周期（Cell cycle）是細(xì)胞生命活動的基本過程，指從細(xì)胞分裂開始到下一次分裂結(jié)束為止的基本過程，其中DNA 合成和細(xì)胞分裂是兩個主要事件。隨著進一步的研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤的發(fā)生與完整的細(xì)胞周期被破壞息息相關(guān)。本研究通過對人正常食管上皮細(xì)胞HEEC 經(jīng)過MNNG 和幽門螺桿菌處理，模仿進食亞硝基類化合物和被感染幽門螺桿菌后的人正常食管上皮細(xì)胞的周期變化，發(fā)現(xiàn)隨著處理時間的延長G2/M期出現(xiàn)阻滯，這與先前的相關(guān)研究趨勢相同，均為聯(lián)合處理組較為明顯[20]，結(jié)合本次細(xì)胞增殖實驗說明經(jīng)過不同處理的各組細(xì)胞均對細(xì)胞的生長起著一定的抑制作用，并且隨著染毒時間的延長，細(xì)胞的生長更加緩慢，且聯(lián)合處理組的生長最慢，提示HP能協(xié)同促進MNNG 抑制細(xì)胞增殖，促進細(xì)胞周期的紊亂。細(xì)胞周期蛋白（Cyclin）與周期蛋白依賴性蛋白激酶(Cyclin-dependent protein kinases，Cdks)是細(xì)胞周期調(diào)控中的重要因子，周期蛋白家族包括（Cyclin）A、B1、B2、C、D1、D2、D3、E、F 等，其中Cyclin B1 是與細(xì)胞周期G2/M 期密切相關(guān)，當(dāng)G2/M 期升高時，其含量明顯增加，本次研究結(jié)果表明細(xì)胞處于正常生長狀態(tài)時，Cyclin B1蛋白表達量較少，HP或MNNG處理后隨著G2/M 期阻滯增大，Cyclin B1 的表達量也隨之升高，且以HP 聯(lián)合MNNG 組的Cyclin B1 的蛋白表達量最高。Lin等[12]研究發(fā)現(xiàn)幽門螺桿菌聯(lián)合MNNG 處理后的胃黏膜上皮細(xì)胞Cyclin D1 表達明顯增高，而單獨感染時Cyclin D1 正常表達，提示幽門螺桿菌聯(lián)合MNNG 能促進細(xì)胞周期的紊亂，因此在幽門螺桿菌聯(lián)合MNNG 處理人食管上皮細(xì)胞后，周期紊亂的機制可能與周期蛋白的表達失調(diào)相關(guān)，其如何影響細(xì)胞周期的內(nèi)在分子機制還需進一步深入研究。