魚腥草地上部分和根部提取物抑制尖吻蝮蛇毒的比較*

陳峻波，余曉東，熊艷，吳七云，陳千姿，和七一

教育部活性物質(zhì)生物技術(shù)工程研究中心/重慶師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，重慶 401331

毒蛇咬傷是一個(gè)非常嚴(yán)重的公共安全問題，尤其在熱帶和亞熱帶地區(qū)。全世界每年約發(fā)生500多萬(wàn)起蛇咬傷事件，導(dǎo)致9 萬(wàn)多人死亡［1］。在中國(guó)，每年約10 萬(wàn)人被毒蛇咬傷，造成約25% ～30%的致殘率和5% ～ 10%的死亡率［2］。尖吻蝮Deinagkistrodon acutus隸屬蛇亞目蝰蛇科蝮亞科下的一個(gè)有毒單型蛇，是中國(guó)非常著名的毒蛇之一，主要分布在西南部地區(qū)及臺(tái)灣地區(qū)［3］。尖吻蝮蛇毒屬于血循環(huán)毒，由金屬蛋白酶、磷脂酶A2、透明質(zhì)酸酶、細(xì)胞毒素、肌肉毒素等毒液成分組成，蛇傷后造成受害者出現(xiàn)嚴(yán)重的局部損傷，如出血、水腫和傷口部位的組織壞死［4-5］。目前，抗蛇毒血清被認(rèn)為是一種有效的蛇傷治療藥物，能有效地中和蛇毒引起的全身效應(yīng)，但對(duì)蛇毒造成的局部損害保護(hù)有限［6］。同時(shí)，抗蛇毒血清生產(chǎn)成本較高，存在過(guò)敏反應(yīng)風(fēng)險(xiǎn)高、儲(chǔ)存困難等一些內(nèi)在缺點(diǎn)［7］。因此，尋求新的蛇傷治療途徑具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者發(fā)現(xiàn)大量植物提取物或其組分具有抑制蛇毒活性的作用［8-10］。大葉桃花心木Swietenia macrophylla提取物能夠抑制三色矛頭蝮Bothrops asper肌肉毒素PLA2誘導(dǎo)的肌肉損傷［11］；從姜黃根Curcuma longa中分離出的酚類化合物可中和原矛頭蝮B. jararaca蛇毒引起的出血活性和響尾蛇Crotalus durissus terrificus蛇毒的致死作用［12］；從墨旱蓮Eclipta prostrata分離的類固醇可中和響尾蛇蛇毒誘發(fā)的各種毒理作用，如致死性、神經(jīng)毒性、出血等［13］；前期研究中，我們發(fā)現(xiàn)小葉三點(diǎn)金Desmodium microphyllum［14］和徐長(zhǎng)卿Cynan?chum paniculatum［15］的提取物能夠有效抑制尖吻蝮蛇毒引起的出血、水腫和組織壞死等局部損傷；蛇莓Duchesnea indica乙醇提取物能夠抑制尖吻蝮蛇毒蛋白水解酶活性［16］。這些結(jié)果表明，植物提取物可以作為一種治療蛇傷的替代或補(bǔ)充療法。

魚腥草Houttuynia cordataThunb 隸屬于三白草屬多年生開花草本植物，是亞洲地區(qū)著名的藥用植物和受歡迎的蔬菜［17］，因全草帶魚腥味而得名。研究表明，魚腥草具有多種藥理學(xué)作用，如抗炎［18-19］、抗過(guò)敏［20］、抗糖尿?。?1］、抗肥胖［22］、抗氧化［23］、抗癌［24］、抗病毒［25-26］和抗菌活性［27］。在中國(guó)的偏遠(yuǎn)山區(qū)，魚腥草常常被配伍其他中草藥，用于蛇傷的治療。然而，目前尚無(wú)文獻(xiàn)資料來(lái)探討魚腥草治療毒蛇咬傷的有效性和科學(xué)性。基于此，本研究以尖吻蝮蛇毒為研究對(duì)象，探究魚腥草地上部分和根部提取物對(duì)蛇毒主要酶類活性和體內(nèi)毒性的抑制作用。

1 材料和方法

1.1 材料

尖吻蝮蛇毒購(gòu)自湖南烏龍山蛇場(chǎng)，經(jīng)冷凍干燥后于-20 ℃低溫保存?zhèn)溆?。使用前，將凍干的蛇毒粉末溶解在磷酸鹽緩沖液中，在4 ℃條件下，10 000 r/min 離心10 min，取上清備用。昆明雄性小鼠18～20 g 購(gòu)自重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物中心，按照標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)條件飼養(yǎng)。魚腥草于2017 年7 月至9月采于重慶市大學(xué)城校區(qū)，自然干燥后保存。

1.2 試劑與儀器設(shè)備

主要試劑：纖維蛋白原，Biosharp 公司；透明質(zhì)酸鈉，XiyaReagent 公司；溴代十六烷基三甲胺，Amresco 公司；丙烯酰胺，甲叉雙丙烯酰胺，考馬斯亮藍(lán)R250，鼎國(guó)生物；肌酸激酶（CK）檢測(cè)試劑盒，南京建成生物工程研究所；SDS-PAGE電泳上樣緩沖液，上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.3 植物提取物的制備

將魚腥草地上部分與根部分開，分別稱取地上部分及根各200 g，加入1 000 mLφ=75%乙醇浸泡1 h，再回流提取3 h。將提取物使用濾紙進(jìn)行過(guò)濾，濾液在旋轉(zhuǎn)真空蒸發(fā)器（40 ℃，0.1 MPa）中濃縮去除乙醇，濃縮液經(jīng)凍干后儲(chǔ)存于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 抑制蛇毒蛋白水解酶活性測(cè)定

蛇毒蛋白水解酶活性根據(jù)Okoroma［28］的方法進(jìn)行檢測(cè)，以酪蛋白作為底物。稱取0.2 g瓊脂糖，加入16 mL PBS（0.05 mol/L，pH 7.5），加熱至瓊脂糖溶解；再加入4 mL 酪蛋白溶液（12.5 mg/mL），混合均勻后倒板，待平板冷卻凝固后用打孔器打孔。尖吻蝮蛇毒（20 μg）分別與不同質(zhì)量比［m（蛇毒）/m（提取物）=1∶5、1∶10、1∶20、1∶50 和1∶100］的魚腥草地上部分提取物或根部提取物混勻，37 ℃孵育30 min 后點(diǎn)樣于點(diǎn)樣孔，于37 ℃恒溫孵育12 h 后測(cè)量透明圈直徑大小，實(shí)驗(yàn)重復(fù)進(jìn)行3次。酶活性以%表示，以尖吻蝮蛇毒誘導(dǎo)產(chǎn)生的蛋白水解活性定義為100%。

1.5 抑制蛇毒磷脂酶A2活性測(cè)定

蛇毒磷脂酶A2活性根據(jù)Habermann 等［29］的方法進(jìn)行測(cè)定，以蛋黃液作為底物。稱取0.2 g 瓊脂糖，加入20 mL 醋酸鈉溶液（0.05 mol/L，pH 6.5），加熱至瓊脂糖溶解；待瓊脂糖溶液溫度降低至50 ℃左右，加入蛋黃液800 μL（蛋黃液的制備：蛋黃與8.5 mg/mL NaCl 溶液以1∶3 的體積比混合后，于3 000 r/min 條件離心5 min，取上清即得）和CaCl2（0.01 mol/L） 400 μL，混合均勻后倒平板，待平板冷卻凝固后用打孔器打孔。尖吻蝮蛇毒（4 μg）分別與不同質(zhì)量比［m（蛇毒）/m（提取物）=1∶25、1∶50、1∶100 和1∶200］的魚腥草地上部分提取物或根部提取物混勻，37 ℃孵育30 min 后點(diǎn)樣于點(diǎn)樣孔，于37 ℃恒溫孵育9 h后測(cè)量透明圈直徑大小，實(shí)驗(yàn)重復(fù)進(jìn)行3次。酶活性以%表示，以尖吻蝮蛇毒誘導(dǎo)產(chǎn)生的磷脂酶A2活性定義為100%。

1.6 抑制蛇毒透明質(zhì)酸酶活性測(cè)定

蛇毒透明質(zhì)酸酶活性根據(jù)Singer 等［30］的方法進(jìn)行測(cè)定，以透明質(zhì)酸為底物。稱取2 g 瓊脂糖，加入100 mL 醋酸鈉緩沖液（50 mmol/L，pH 5.0），溶解后50 ℃孵育備用；稱取0.2 g透明質(zhì)酸鈉，加入100 mL 相同緩沖液溶解，與瓊脂糖溶液混勻后倒板，待平板冷卻凝固后用打孔器打孔。尖吻蝮蛇毒（50 μg）分別與不同質(zhì)量比［m（蛇毒）/m（提取物）=1∶5、1∶10、1∶20、1∶50 和1∶100］的魚腥草地上部分提取物或根部提取物混勻，37 ℃孵育30 min后點(diǎn)樣于點(diǎn)樣孔，37 ℃恒溫孵育15 h后，加入7.5 mg/mL 的十六烷基三甲基溴化銨溶液，放置2 h 觀察測(cè)量透明圈直徑大小，實(shí)驗(yàn)重復(fù)進(jìn)行3 次。酶活性以%表示，以尖吻蝮蛇毒誘導(dǎo)產(chǎn)生的透明質(zhì)酸酶活性定義為100%。

1.7 中和蛇毒促凝活性測(cè)定

蛇毒促凝活性根據(jù)Gené等［31］的方法測(cè)定。最小凝結(jié)劑量（MCD，minimum coagulant dose）定義為在37 ℃條件下，能夠引起血漿在60 s 內(nèi)凝結(jié)所需的毒液劑量。取最小凝結(jié)劑量的尖吻蝮蛇毒分別與不同質(zhì)量比［m（蛇毒）/m（提取物）=1∶10、1∶50、1∶100、1∶200 和1∶300］的魚腥草地上部分提取物或根部提取物混勻，37 ℃孵育30 min 后，與160 μL 牛血漿混合，于37 ℃下觀察凝結(jié)時(shí)間，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。促凝活性以平均凝結(jié)時(shí)間（單位：s）表示。

1.8 中和蛇毒纖維蛋白原水解活性測(cè)定

蛇毒纖維蛋白原水解活性根據(jù)Rodrigues 等［32］的方法進(jìn)行測(cè)定。尖吻蝮蛇毒（2 μg）分別與不同質(zhì)量比［m（蛇毒）/m（提取物）=1∶5、1∶10、1∶20 和1∶50］的魚腥草地上部分提取物或根部提取物混勻，37 ℃孵育30 min 后，與20 μL 牛纖維蛋白原（2 μg/μL） 混合均勻后于37 ℃孵育1 h。加入20 μL 0.05 mol/L Tris-HCl 上樣緩沖液（pH 6.8，含φ=10%甘油，φ=10%巰基乙醇，20 mg/mL SDS和0.5 mg/mL 溴酚藍(lán)）終止反應(yīng)，在100 ℃下煮沸3 min，通過(guò)φ=12%SDS-PAGE凝膠電泳檢測(cè)蛇毒纖維蛋白原水解活性。

1.9 中和蛇毒體內(nèi)出血活性測(cè)定

蛇毒誘導(dǎo)出血活性根據(jù)Nikai 等［33］的方法測(cè)定。最小出血?jiǎng)┝浚∕HD，minimum hemorrhagic dose）定義為誘導(dǎo)小鼠皮下產(chǎn)生10 mm 出血圈所需的毒液劑量。選取100 只昆明小鼠18～20 g，隨機(jī)分為10 組。實(shí)驗(yàn)組取最小出血?jiǎng)┝康募馕球笊叨痉謩e與不同質(zhì)量比［m（蛇毒）/m（提取物）=1∶10、1∶50、1∶100 和1∶200］的魚腥草地上部分提取物或根部提取物混勻，37 ℃孵育30 min。隨后進(jìn)行小鼠皮下注射，3 h 后，小鼠經(jīng)乙醚深度麻醉致死，解剖觀察皮下出血情況，測(cè)量出血圈的直徑，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。出血活性以%表示，以尖吻蝮蛇毒誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生的出血活性定義為100%，以注射等量生理鹽水的小鼠為正常對(duì)照組。

1.10 中和蛇毒體內(nèi)水腫活性測(cè)定

蛇毒誘導(dǎo)水腫活性根據(jù)Maiorano 等［34］的方法測(cè)定。選取70 只昆明小鼠18 ～ 20 g，隨機(jī)分為7組。實(shí)驗(yàn)組取尖吻蝮蛇毒（3 μg）分別與不同質(zhì)量比［m（蛇毒）/m（提取物）=1∶50、1∶100 和1∶200］的魚腥草地上部分提取物或根部提取物混勻，37 ℃孵育30 min。隨后將混合溶液注射至小鼠右足趾，120 min 后，用游標(biāo)卡尺測(cè)量小鼠右腳掌的厚度，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。水腫活性以毒液注射前后的腳掌厚度之間的百分比差表示，以尖吻蝮蛇毒誘導(dǎo)產(chǎn)生的水腫活性定義為100%。

“當(dāng)官不為民做主，不如回家賣紅薯?！睂?duì)于庸官懶官，老百姓向來(lái)深惡痛絕。近年來(lái)，黨中央對(duì)不作為慢作為問題的治理始終沒有放松。但無(wú)法回避的是，當(dāng)前仍有少部分黨員干部存有著“不求有功，但求無(wú)過(guò)”“多一事不如少一事”“只要不出事，寧愿不做事”的錯(cuò)誤心態(tài)，不思進(jìn)取，得過(guò)且過(guò)，“當(dāng)一天和尚撞一天鐘”，對(duì)待工作更是挑三揀四，消極應(yīng)付。

小鼠腳掌的腫脹率=［（注射120 min 后腳掌的厚度－注射前腳掌厚度）÷注射前的厚度］×100%。

1.11 中和蛇毒體內(nèi)組織壞死活性測(cè)定

蛇毒誘導(dǎo)組織壞死活性根據(jù)Mebs等［35］的方法測(cè)定。選取80 只昆明小鼠18 ～ 20 g，隨機(jī)分為8組。實(shí)驗(yàn)組取尖吻蝮蛇毒50 μg 分別與不同質(zhì)量比［m（蛇毒）/m（提取物）=1∶50、1∶100 和1∶200］的魚腥草地上部分提取物或根部提取物混勻，37 ℃孵育30 min。隨后將混合溶液注射至小鼠右腓腸肌，3 h后，收集血樣制備上清，采用CK檢測(cè)試劑盒對(duì)血清中的肌酸激酶進(jìn)行檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。組織壞死活性以血清中CK 含量水平表示，以尖吻蝮蛇毒誘導(dǎo)產(chǎn)生的組織壞死活性定義為100%。正常對(duì)照組小鼠僅注射等量生理鹽水。

1.12 中和蛇毒體內(nèi)致死毒性測(cè)定

蛇毒致死活性根據(jù)Alam 等［36］的方法測(cè)定。選取100只昆明小鼠18～20 g，隨機(jī)分為10組。實(shí)驗(yàn)組取2 LD50的尖吻蝮蛇毒分別與不同質(zhì)量比［m（蛇毒）/m（提取物）=1∶12.5、1∶25、1∶50 和1∶100］的魚腥草地上部分提取物或根部提取物混勻，37 ℃孵育30 min。隨后混合液進(jìn)行小鼠腹腔注射，記錄24 h內(nèi)小鼠的生存狀況。致死活性以小鼠生存狀況表示，以尖吻蝮蛇毒誘導(dǎo)產(chǎn)生的致死活性定義為100%。正常對(duì)照組小鼠僅注射等量生理鹽水。

1.13 植物化學(xué)成分分析

魚腥草地上部分和根部提取物物化學(xué)成分根據(jù)Harborne［37］和Tiwari等［38］的方法進(jìn)行分析。

1.14 數(shù)據(jù)分析與處理

數(shù)據(jù)結(jié)果采用平均值±平均值標(biāo)準(zhǔn)誤表示。使用SPSS 18.0 軟件單向方差分析和GraphPad Prism version 5.00 軟件進(jìn)行了組間差異的顯著性統(tǒng)計(jì)。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 魚腥草提取物對(duì)尖吻蝮蛇毒主要酶類活性的抑制作用

魚腥草提取物對(duì)尖吻蝮蛇毒蛋白水解酶抑制作用如圖1所示，在測(cè)定范圍內(nèi)，魚腥草地上部分提取物能夠顯著抑制尖吻蝮蛇毒蛋白水解酶活性，且呈劑量效應(yīng)關(guān)系。當(dāng)蛇毒和魚腥草地上部分提取物質(zhì)量比為1∶5、1∶10 和1∶20 時(shí)，對(duì)蛋白水解酶活性抑制率分別為17%、26%和34%。當(dāng)蛇毒和地上部分提取物質(zhì)量比為1∶50 和1∶100 時(shí)，尖吻蝮蛇毒蛋白水解酶活性能被完全抑制（抑制率為100%）；在相同質(zhì)量比條件下，根部提取物僅僅抑制了25%和29%的蛇毒蛋白水解酶活性。

圖1 魚腥草地上部分及根部提取物對(duì)尖吻蝮蛇毒蛋白水解酶的抑制作用Fig.1 Inhibitory effect of extracts from aerial part and root of H. cordata on proteolytic enzyme activity from D. acutus venom

魚腥草提取物對(duì)尖吻蝮蛇毒磷脂酶A2活性的抑制作用如圖2所示。當(dāng)蛇毒和魚腥草地上部分質(zhì)量比為1∶50 和1∶100 時(shí)，蛇毒磷脂酶A2活性抑制率為20%和100%；相比之下，在相同質(zhì)量比條件下，根部提取物對(duì)蛇毒磷脂酶A2活性的抑制率僅為14%和33%。當(dāng)蛇毒與兩種提取物的質(zhì)量比增加至1∶200時(shí)，可100%抑制蛇毒磷脂酶A2活性。

圖2 魚腥草地上部分及根部提取物對(duì)尖吻蝮蛇毒磷脂酶A2的抑制作用Fig.2 Inhibitory effect of extracts from aerial part and root of H. cordata on phospholipase A2 activity from D. acutus venom

魚腥草提取物對(duì)尖吻蝮透明質(zhì)酸酶活性的抑制作用如圖3所示，在蛇毒與提取物質(zhì)量比為1∶5～1∶100 的范圍內(nèi)，魚腥草地上部分和根部提取物均能顯著抑制尖吻蝮蛇毒透明質(zhì)酸酶活性，且呈濃度效應(yīng)關(guān)系。當(dāng)蛇毒和魚腥草地上部分質(zhì)量比為1∶20時(shí)，透明質(zhì)酸酶活性可被完全抑制（抑制率為100%）。相比之下，當(dāng)蛇毒和根部提取物質(zhì)量比為1∶100時(shí)，才能完全抑制蛇毒透明質(zhì)酸酶活性。

圖3 魚腥草地上部分及根部提取物對(duì)尖吻蝮蛇毒透明質(zhì)酸酶的抑制作用Fig.3 Inhibitory effect of extracts from aerial part and root of H. cordata on hyaluronidase activity from D. acutus venom

魚腥草提取物對(duì)尖吻蝮蛇毒誘導(dǎo)血漿凝結(jié)的抑制作用如圖4所示。不同劑量尖吻蝮蛇毒與牛血漿在37 ℃保溫，當(dāng)蛇毒劑量達(dá)10 μg 時(shí)，可在60 s內(nèi)誘導(dǎo)牛血漿凝結(jié)，即為尖吻蝮蛇毒MCD。以蛇毒MCD 為實(shí)驗(yàn)劑量，檢測(cè)兩種提取物的抑制作用。結(jié)果顯示，魚腥草地上部分提取物對(duì)尖吻蝮蛇毒的促凝作用表現(xiàn)出劑量效應(yīng)抑制作用，當(dāng)蛇毒和魚腥草地上部分質(zhì)量比為1∶300時(shí)，顯著延長(zhǎng)了血漿的凝結(jié)時(shí)間（＞300 s）。相比之下，在質(zhì)量比為1∶100，1∶200和1∶300時(shí)，根部提取物的抑制作用均低于地上部分提取物。

圖4 魚腥草地上部分及根部提取物對(duì)尖吻蝮蛇毒促凝活性的中和作用Fig.4 Neutralization of extracts from aerial part and root of H. cordata on procoagulant activity from D. acutus venom

魚腥草提取物對(duì)尖吻蝮蛇毒誘導(dǎo)纖維蛋白原水解活性的抑制作用如圖5所示。在SDS-PAGE 凝膠中，牛纖維蛋白原點(diǎn)樣孔樣品呈現(xiàn)出完整的3條蛋白質(zhì)條帶，分別為Aα、Bβ 和γ 鏈；當(dāng)尖吻蝮蛇毒與牛纖維蛋白原在37 ℃孵育30 min 后，Aα 和Bβ 鏈發(fā)生了降解，而γ 鏈保持完整。在質(zhì)量比為1∶5～1∶50 的檢測(cè)范圍內(nèi)，魚腥草地上部分提取物完全抑制了蛇毒誘導(dǎo)的Bβ鏈降解，部分抑制了Aα鏈的降解。相比之下，當(dāng)蛇毒和根部提取物質(zhì)量比達(dá)到1∶20 或1∶50 的比例時(shí)，根部提取物才能完全抑制了Bβ鏈降解，部分抑制Aα鏈降解。

圖5 魚腥草地上部分及根部提取物對(duì)尖吻蝮蛇毒纖維蛋白原水解酶的抑制作用Fig.5 Inhibitory effect of extracts from aerial part and root of H. cordata on fibrinogenolytic activity from D. acutus venom

2.2 魚腥草提取物對(duì)尖吻蝮蛇毒體內(nèi)毒性的中和作用

魚腥草提取物中和尖吻蝮蛇毒誘導(dǎo)小鼠皮下出血結(jié)果如圖6所示。不同劑量尖吻蝮蛇毒皮下注射小鼠，測(cè)得20 μg 蛇毒可誘導(dǎo)小鼠皮下出現(xiàn)直徑為10 mm 的溶血圈，即為尖吻蝮蛇毒MHD。以MHD 為實(shí)驗(yàn)劑量，檢測(cè)兩種提取物的抑制作用。結(jié)果顯示，魚腥草提取物能有效中和尖吻蝮蛇毒誘導(dǎo)的出血活性，且呈劑量效應(yīng)關(guān)系。當(dāng)蛇毒和魚腥草地上部分提取物質(zhì)量比為1∶200時(shí)，能夠完全中和尖吻蝮蛇毒誘導(dǎo)的出血活性；在相同質(zhì)量比條件下，魚腥草根部提取物能夠中和尖吻蝮蛇毒93%的出血活性。

圖6 魚腥草地上部分及根部提取物對(duì)尖吻蝮蛇毒出血活性的中和作用Fig.6 Neutralization of extracts from aerial part and root of H. cordata on hemorrhagic activity from D. acutus venom

魚腥草提取物中和尖吻蝮蛇毒誘導(dǎo)小鼠腳趾水腫結(jié)果如圖7所示。當(dāng)小鼠腳趾注射3 μg尖吻蝮蛇毒，120 min 后，能夠誘導(dǎo)小鼠腳趾發(fā)生顯著腫脹，腫脹度達(dá)45%。當(dāng)魚腥草提取物和尖吻蝮蛇毒提前孵育30 min，蛇毒誘導(dǎo)的水腫活性能夠被兩種提取物有效抑制，且呈劑量效應(yīng)關(guān)系。當(dāng)蛇毒和魚腥草地上部分提取物質(zhì)量比為1∶200時(shí)，蛇毒誘導(dǎo)的水腫活性降低至6%；而在相同質(zhì)量比條件下，根部提取物能夠使蛇毒誘導(dǎo)的水腫活性降低至19%。

圖7 魚腥草地上部分及根部提取物對(duì)尖吻蝮蛇毒水腫活性的中和作用Fig.7 Neutralization of extracts from aerial part and root from H. cordata on edema activity from D. acutus venom

魚腥草提取物中和尖吻蝮蛇毒誘導(dǎo)小鼠組織壞死結(jié)果如圖8 所示。魚腥草提取物和蛇毒孵育后，能夠中和蛇毒誘導(dǎo)的CK 活性，且呈劑量效應(yīng)關(guān)系。以注射尖吻蝮蛇毒誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生的CK 活性定義為100%，注射生理鹽水小鼠作為正常對(duì)照組。當(dāng)蛇毒和魚腥草地上部分提取物質(zhì)量比為1∶200 時(shí)，蛇毒誘導(dǎo)的CK 活性能夠被完全中和；而在相同質(zhì)量比條件下，根部提取物能夠使尖吻蝮蛇毒誘導(dǎo)的CK活性降低35%。

圖8 魚腥草地上部分及根部提取物對(duì)尖吻蝮蛇毒肌肉毒性的中和作用Fig.8 Neutralization of extracts from aerial part and root of H. cordata on myotoxic activity from D. acutus venom

魚腥草提取物中和尖吻蝮蛇毒誘導(dǎo)小鼠致死作用結(jié)果如表1所示。小鼠腹腔注射不同劑量尖吻蝮蛇毒，測(cè)得LD50為2.88 mg/kg，以2 LD50作為致死劑量。當(dāng)單獨(dú)注射尖吻蝮蛇毒時(shí)，小鼠在24 h內(nèi)全部死亡。當(dāng)蛇毒和魚腥草地上部分提取物質(zhì)量比為1∶25，24 h 內(nèi)小鼠存活率為100%；而在相同質(zhì)量比條件下，24 h內(nèi)小鼠存活率僅為50%。此外，當(dāng)蛇毒和魚腥草地上部分或根部提取物質(zhì)量比為1∶50和1∶100時(shí)，24 h內(nèi)所有小鼠均存活。

表1 魚腥草地上部分和根部提取物對(duì)尖吻蝮蛇毒誘導(dǎo)致死毒性的保護(hù)作用（n=100）1）Table 1 Protective effects of extracts from aerial part and root of H. cordata on lethal toxicity induced by D. acutus venom（n=100）

2.3 魚腥草提取物植物化學(xué)分析

魚腥草提取物植物化學(xué)分析結(jié)果如表2 所示。地上部分和根部均存在生物堿、蒽醌和蛋白質(zhì)，而地上部分還存在黃酮、多酚、單寧、三萜、甾醇和皂苷類物質(zhì)。

表2 魚腥草地上部分和根部提取物的初步植物化學(xué)組成鑒定1）Table 2 Preliminary phytochemical screening of extracts from aerial part and root of H. cordata

3 討 論

魚腥草作為一種常見的中草藥，具有清熱解毒、利尿消腫、清癰排膿等功效，已被用于治療多種疾病，包括咳嗽、白帶、腎病綜合征、單純性皰疹、痤瘡和流感等［17，39-40］。根據(jù)民間蛇傷救治案例以及《常用中草藥手冊(cè)》《救急易方》等資料記載，魚腥草可用于治療毒蛇咬傷。本研究中，我們首次對(duì)魚腥草地上部分和根部提取物抑制蛇毒作用進(jìn)行了比較研究。結(jié)果表明，魚腥草地上部分比根部在抑制尖吻蝮蛇毒主要酶類活性和體內(nèi)毒性方面更為有效。

金屬蛋白酶和絲氨酸蛋白酶是尖吻蝮蛇毒中兩個(gè)關(guān)鍵的蛋白酶，能引起蛇傷動(dòng)物凝血系統(tǒng)發(fā)生變化［41］。蛇毒金屬蛋白酶隸屬于metzincin家族，具有HEXXHXXGXXH 的Zn2+結(jié)合基序，通常表現(xiàn)出纖維蛋白（原）水解和基底膜或細(xì)胞外基質(zhì)降解活性，導(dǎo)致嚴(yán)重的出血，血液凝集和局部組織損傷［42-43］。大多數(shù)絲氨酸蛋白酶表現(xiàn)出凝血酶活性并水解纖維蛋白原產(chǎn)生異常的纖維蛋白凝塊，該凝塊無(wú)法被XIII因子進(jìn)一步交聯(lián)，從而導(dǎo)致血液不能正常凝結(jié)［44-45］。因此，抑制這些酶的活性在蛇傷治療中起重要作用。研究結(jié)果表明，魚腥草地上部分提取物可以顯著地抑制尖吻蝮蛇毒對(duì)酪蛋白和纖維蛋白原的水解活性（圖1、圖5）。同時(shí)，高濃度的地上部分提取物顯著地抑制了蛇毒誘導(dǎo)的牛血漿凝結(jié)活性（圖4），抑制效果與生理鹽水對(duì)照組相同（凝結(jié)時(shí)間＞300 s）。這些結(jié)果表明，魚腥草地上部分提取物對(duì)金屬蛋白酶和絲氨酸蛋白酶表現(xiàn)出顯著的抑制作用。

蛇毒透明質(zhì)酸酶，俗稱的擴(kuò)散因子，在蛇咬傷部位降解透明質(zhì)酸等細(xì)胞外基質(zhì)的糖胺聚糖，促進(jìn)蛇毒成分的擴(kuò)散和吸附，從而導(dǎo)致局部組織損傷，造成永久性缺陷和/或殘疾［46］。研究結(jié)果表明，即使在較低濃度下（蛇毒與地上部分提取物質(zhì)量比為1∶20），魚腥草地上部分提取物也能顯著抑制尖吻蝮蛇毒透明質(zhì)酸酶活性（圖3），提示這可能是魚腥草治療尖吻蝮毒蛇咬傷的一種作用機(jī)制。

尖吻蝮毒蛇咬傷后，除造成嚴(yán)重出血癥狀外，還會(huì)在毒液注射部位產(chǎn)生其他局部效應(yīng)，包括水腫和組織壞死。水腫產(chǎn)生的原因主要?dú)w因于多種磷脂酶A2和蛇毒金屬蛋白酶的協(xié)同作用，并由此釋放和/或合成的內(nèi)源性炎癥介質(zhì)所介導(dǎo)［47-49］。組織壞死被認(rèn)為與磷脂酶A2對(duì)肌肉細(xì)胞質(zhì)膜的直接破壞作用或間接作用有關(guān)，其中涉及蛇毒金屬蛋白酶出血毒素對(duì)微脈管系統(tǒng)和肌肉內(nèi)動(dòng)脈的缺血性改變［49］。在本研究中，魚腥草地上部分提取物能顯著抑制尖吻蝮蛇毒在體內(nèi)引起的出血、水腫和組織壞死（圖6～圖8），表明其對(duì)蛇毒磷脂酶A2和金屬蛋白酶具有抑制作用。結(jié)合體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果，地上部分提取物能顯著抑制了尖吻蝮蛇毒磷脂酶A2和蛋白水解酶活性（圖1～圖2）。這些發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步證實(shí)魚腥草地上部分提取物對(duì)尖吻蝮蛇毒引起的局部損傷具有顯著的保護(hù)作用，可作為抗蛇毒血清的輔助療法。

蛇傷發(fā)生后，毒液成分通過(guò)相互間的協(xié)同作用引起嚴(yán)重的全身系統(tǒng)性損害，導(dǎo)致受害者死亡。在探尋蛇傷解毒劑時(shí)，評(píng)估致死保護(hù)性是一個(gè)重要指標(biāo)。本研究中，用2 LD50尖吻蝮蛇毒作為挑戰(zhàn)劑量對(duì)小鼠進(jìn)行腹腔注射。結(jié)果顯示，當(dāng)蛇毒與魚腥草地上部分提取物質(zhì)量比為1∶25 時(shí)，24 h 內(nèi)所有小鼠存活并健康；當(dāng)以相同比例的蛇毒和根部提取物處理小鼠，24 h 內(nèi)小鼠的存活率為50%。這些結(jié)果表明魚腥草提取物可以用于尖吻蝮蛇傷救治，而且地上部分提取物治療效果優(yōu)于根部提取物。

大量研究表明，藥用植物次生代謝產(chǎn)物可用于治療毒蛇咬傷，能夠發(fā)展成為傳統(tǒng)抗蛇毒血清的補(bǔ)充療法［50-53］。其中，黃酮和生物堿可減輕多種蛇毒引起的炎癥和出血，類黃酮和類生物堿化合物對(duì)蛇毒透明質(zhì)酸酶具有很強(qiáng)的抑制作用［51］。同時(shí)，來(lái)源于多種植物中的多酚對(duì)蛇毒中的磷脂酶A2、蛋白水解酶、透明質(zhì)酸酶和L-氨基酸氧化酶具有抑制作用［54］。萜類化合物和酚類化合物可抑制多種蛇毒中的磷脂酶A2［52］。單寧與金屬離子和蛋白質(zhì)相互作用形成復(fù)合物，從而抑制蛇毒金屬蛋白酶，絲氨酸蛋白酶和磷脂酶A2的活性［55］。此外，從多種植物中分離出的谷甾醇和豆甾醇，對(duì)多種蛇毒具有抑制作用［56-57］。我們的分析結(jié)果表明，魚腥草地上部分含有各種植物成分，例如黃酮、生物堿、多酚、單寧、三萜、甾醇、皂苷、蒽醌和蛋白質(zhì)。相比之下，根部?jī)H包含3 種成分，如生物堿、蒽醌和蛋白質(zhì)。因此，有理由相信，魚腥草地上部分有效的抗蛇毒潛力歸因于其多樣化的植物化學(xué)成分。

4 結(jié) 論

本研究首次證實(shí)了魚腥草提取物（地上部分和根部）對(duì)尖吻蝮蛇毒具有顯著的抑制作用，并證實(shí)地上部分提取物的療效比根部提取物更有效。魚腥草地上部分可作為一種潛在的自然資源用于治療蛇傷藥物的開發(fā)。本研究為魚腥草用于毒蛇咬傷治療提供了科學(xué)依據(jù)，但是，魚腥草中抗蛇毒活性成分的篩選、鑒定和作用機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。