王婧吉，瞿 艷，王 娟，杜坤銳，陳 赟，朱國(guó)旗

(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，安徽 合肥 230061；2.安徽省中醫(yī)藥科學(xué)院針灸臨床研究所，安徽 合肥 230061；3.安徽中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，安徽 合肥 230012；4.安徽中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，安徽 合肥 230012)

血管性癡呆(vascular dementia，VD)是第二大常見(jiàn)性癡呆[1]，僅次于阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)。據(jù)統(tǒng)計(jì)，北美與歐洲15%～20%癡呆患者是腦血管病變引起的，而亞洲該類癡呆患者占比30%[2]。VD是由腦血管病變引起，繼發(fā)神經(jīng)細(xì)胞功能與突觸功能的異常[3]。因此，晚期VD患者在腦功能、腦病理變化等方面與AD有較多的相似性[4]，均與海馬神經(jīng)細(xì)胞丟失和海馬突觸可塑性異常密切相關(guān)[5]。海馬突觸結(jié)構(gòu)由突觸前膜、間隙和突觸后膜組成。突觸后膜上分布有α-氨基-3-羥基-5-甲基-4-異惡唑丙酸受體(α-amino-3-hydroxy 5-methyl-4-isoxazole-propionic acid receptor，AMPAR)、N-甲基-D-天冬氨酸受體(N-methyl-D-aspartic acid receptor，NMDAR)以及突觸后致密蛋白95(postsynaptic density 95，PSD95)等蛋白，在維系突觸后膜結(jié)構(gòu)和發(fā)揮功能過(guò)程中具有重要的作用[6]。因此，從突觸角度探討VD的發(fā)生機(jī)制及尋求干預(yù)措施具有重要意義。

“百會(huì)”“神庭”穴作為督脈腧穴，具有升陽(yáng)補(bǔ)氣、填髓安神之功效，是針灸臨床中防治認(rèn)知功能障礙等神經(jīng)系統(tǒng)疾病常用選穴。多項(xiàng)研究[7-9]表明，電針“百會(huì)”“神庭”可顯著改善認(rèn)知功能障礙患者的臨床癥狀，其作用機(jī)制可能與促進(jìn)血管新生、改善系統(tǒng)性炎癥、調(diào)控學(xué)習(xí)記憶相關(guān)神經(jīng)肽物質(zhì)等相關(guān)。然而，電針“百會(huì)”“神庭”是否能夠影響VD大鼠海馬突觸結(jié)構(gòu)及具體的機(jī)制仍有待進(jìn)一步探索。本研究選用改良型雙側(cè)頸動(dòng)脈結(jié)扎模型[10]，進(jìn)一步從突觸結(jié)構(gòu)與突觸蛋白表達(dá)水平角度探討電針“百會(huì)”“神庭”對(duì)VD大鼠學(xué)習(xí)與記憶的作用及其機(jī)制，為電針治療VD提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 動(dòng)物與分組 SPF級(jí)健康雄性SD大鼠35只(3月齡)，體質(zhì)量(200±20)g，由安徽省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(皖)2011-0002。動(dòng)物飼養(yǎng)在室溫20～25 ℃、相對(duì)濕度40%～75%的環(huán)境中。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，采用隨機(jī)數(shù)字表法將其分為假手術(shù)組、模型組、電針?lè)茄ㄎ唤M、電針穴位組和奧拉西坦組，每組7只。實(shí)驗(yàn)手術(shù)中未出現(xiàn)大鼠死亡情況。行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，動(dòng)物經(jīng)過(guò)量戊巴比妥鈉注射安樂(lè)死，4只動(dòng)物用于Western blot檢測(cè)，3只動(dòng)物用于透射電子顯微鏡觀察實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中對(duì)動(dòng)物各項(xiàng)處理方法均按照《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見(jiàn)》及動(dòng)物倫理相關(guān)規(guī)定執(zhí)行。

1.2 主要試劑及儀器 奧拉西坦(批號(hào) 20030301)：中國(guó)湖南健朗藥業(yè)有限責(zé)任公司；β-actin抗體(批號(hào) 3700、1∶1 000)、GluA1抗體(批號(hào) 13185、1∶1 000)、GluN2B抗體(批號(hào) 14544、1∶1 000)、p-GluN2B(批號(hào) 4209、1∶1 000)：美國(guó)Cell Signaling Technology公司；SDZ-Ⅱ型電子針療儀：蘇州華佗醫(yī)療器械有限公司；一次性不銹鋼針灸針(0.25 mm×25 mm)：蘇州華佗醫(yī)療器械有限公司；電泳儀：美國(guó)Bio-Rad公司；165-8000型電泳槽：美國(guó)Bio-Rad公司；UC-7切片機(jī)：德國(guó)LEICA；7700型透射電子顯微鏡：日本HITACHI。

2 方法

2.1 改良型雙側(cè)頸動(dòng)脈結(jié)扎模型及干預(yù) 模型組、電針?lè)茄ㄎ唤M、電針穴位組和奧拉西坦組大鼠采用改良型雙側(cè)頸動(dòng)脈結(jié)扎模型[10]：2%戊巴比妥鈉(2.3 mL/kg)腹腔注射麻醉后，將其仰臥固定于手術(shù)板上。頸部皮膚剃毛后用75%乙醇棉球進(jìn)行常規(guī)無(wú)菌操作。沿頸部正中線切2 cm的切口，鈍性分離皮下組織，于肌肉間隙找到左頸總動(dòng)脈，分離迷走神經(jīng)，用4-0手術(shù)線永久結(jié)扎后縫合皮下組織及皮膚。放回鼠籠休息并注意保溫，待完全蘇醒后轉(zhuǎn)移到鼠房飼養(yǎng)。1周后進(jìn)行右側(cè)頸總動(dòng)脈分離結(jié)扎，方法同前。假手術(shù)組大鼠也采用相同的手術(shù)操作，但不結(jié)扎雙側(cè)頸總動(dòng)脈。

術(shù)后第2天，電針穴位組大鼠在2%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后將其俯臥位固定在操作臺(tái)上，根據(jù)《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》[11]選取“百會(huì)”“神庭”，其中“百會(huì)”位于頂骨正中，“神庭”位于前正中線上，在額頂骨縫交界線前方處。穴位常規(guī)無(wú)菌操作后，選用一次性針灸針進(jìn)行針刺治療，“百會(huì)”穴向后斜刺2 mm，“神庭”穴向上斜刺2 mm，針刺后選用SDZ-Ⅱ型電子針療儀，疏密波，強(qiáng)度0.5 mA，頻率1 Hz/20 Hz。每次電針干預(yù)30 min，每日1次，共治療14 d。電針?lè)茄ㄎ唤M在取兩個(gè)固定非穴點(diǎn)(穴位旁開(kāi)0.2寸)，電針干預(yù)30 min。假手術(shù)組和模型組大鼠分別給予相同時(shí)間、相同水平的抓握刺激，不進(jìn)行電針干預(yù)。奧拉西坦組大鼠予以?shī)W拉西坦鹽水溶液50 mg/kg腹腔注射，每日1次，共治療14 d。

2.2 檢測(cè)指標(biāo)及方法

2.2.1 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn) Morris水迷宮評(píng)估空間學(xué)習(xí)和記憶功能，水迷宮由一個(gè)直徑為1.6 m的黑色圓形水池組成，水溫控制在(25±2)℃。隱藏在水下的平臺(tái)(直徑為12 cm，高20 cm)位于第四象限的中心。使用連接到固定在水迷宮中心上方的視頻跟蹤系統(tǒng)獲取數(shù)據(jù)。定位巡航實(shí)驗(yàn)為期4 d。每只大鼠從任意象限面向池壁被放入水中，讓其在60 s內(nèi)找到隱藏的平臺(tái)。如果大鼠在60 s內(nèi)未能找到平臺(tái)，則由實(shí)驗(yàn)者引導(dǎo)至平臺(tái)并記錄逃離潛伏期為60 s?？臻g探索實(shí)驗(yàn)在定位巡航結(jié)束后的第5天，用于測(cè)試大鼠穿越平臺(tái)的次數(shù)以及目標(biāo)象限停留的時(shí)間。行為學(xué)試驗(yàn)結(jié)束后，動(dòng)物經(jīng)過(guò)量戊巴比妥鈉麻醉安樂(lè)死，并取海馬組織。

2.2.2 Western blot檢測(cè)海馬突觸相關(guān)蛋白水平 大鼠海馬組織加細(xì)胞裂解液，4 ℃冰上研磨，4 ℃、12 000 r/min離心15 min，取上清。1∶1加入蛋白上樣緩沖液，100 ℃水浴加熱10 min，以充分變性蛋白，經(jīng)SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，漂洗5 min，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h。分別加入PSD-95(1∶1 000)、GluA1(AMPA receptor subunit GluR1)(1∶1 000)、GluN2B(NMDA Receptor 2B)(1∶1 000)和磷酸化GluN2B(1∶500)抗體，緩慢搖動(dòng)4 ℃孵育過(guò)夜。加入洗滌液TBST(10 min×3)。加入二抗(1∶10 000)，室溫孵育2 h。加入洗滌液TBST，10 min×3次。采用化學(xué)發(fā)光試劑顯影成像。使用Image J軟件對(duì)圖像進(jìn)行分析，計(jì)算條帶的光密度值。

2.2.3 透射電子顯微鏡觀察海馬CA1區(qū)突觸數(shù)量 取新鮮海馬CA1區(qū)組織(1 mm×1 mm×1 mm)，置2.5%戊二醛液中固定6 h，將標(biāo)本用0.1 mmol/L磷酸緩沖液洗3次后，鋨酸固定2 h，用上述緩沖液洗3次后，逐級(jí)梯度乙醇、丙酮脫水，環(huán)氧丙烷過(guò)渡；然后用環(huán)氧樹(shù)脂包埋，60 ℃烤箱聚合48 h，超薄切片機(jī)切片，厚度70 nm；醋酸鈾，硝酸鉛液染色，用透射電子顯微鏡觀察拍照。

3 結(jié)果

3.1 電針對(duì)改良型雙側(cè)頸動(dòng)脈結(jié)扎模型大鼠學(xué)習(xí)和記憶功能的影響 水迷宮實(shí)驗(yàn)分為學(xué)習(xí)和測(cè)試兩個(gè)時(shí)期。各組大鼠在1～4 d學(xué)習(xí)期，逃避潛伏時(shí)間顯著縮短，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠第4天逃避潛伏時(shí)間顯著延長(zhǎng)(P<0.05)；與模型組比較，電針穴位組和奧拉西坦組第4天逃避潛伏時(shí)間顯著縮短(P<0.05)。與假手術(shù)組比較，測(cè)試期模型組大鼠跨越平臺(tái)次數(shù)減少，目標(biāo)象限停留時(shí)間顯著縮短(P<0.05)。與模型組比較，電針穴位組和奧拉西坦組大鼠跨越平臺(tái)次數(shù)增加，目標(biāo)象限停留時(shí)間顯著延長(zhǎng)(P<0.05)。電針?lè)茄ㄎ唤M大鼠學(xué)習(xí)期逃避潛伏期與測(cè)試期跨越平臺(tái)次數(shù)和目標(biāo)象限停留時(shí)間與模型組比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)圖1。

3.2 電針對(duì)改良型雙側(cè)頸動(dòng)脈結(jié)扎模型大鼠腦質(zhì)量的影響 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦質(zhì)量顯著增加(P<0.05)；與模型組比較，電針穴位組和奧拉西坦組大鼠腦質(zhì)量顯著降低(P<0.05)，而電針?lè)茄ㄎ唤M大鼠腦質(zhì)量無(wú)顯著變化(P>0.05)；與奧拉西坦組比較，電針穴位組大鼠腦質(zhì)量顯著降低(P<0.05)。見(jiàn)圖2。

注:A.假手術(shù)組;B.模型組;C.電針?lè)茄ńM;D.電針穴位組;E.奧拉西坦組;與假手術(shù)組比較,?P<0.05;與模型組比較,#P<0.05

3.3 電針對(duì)改良型雙側(cè)頸動(dòng)脈結(jié)扎模型大鼠大腦海馬CA1區(qū)突觸數(shù)量的影響 假手術(shù)組大鼠海馬CA1區(qū)突觸數(shù)量豐富，而模型組大鼠和電針?lè)茄ㄎ唤M大鼠海馬CA1區(qū)突觸數(shù)量明顯下降；而電針穴位組大鼠海馬CA1區(qū)突觸密度增加。見(jiàn)圖3。

注：A.假手術(shù)組；B.模型組；C.電針?lè)茄ńM；D.電針穴位組

3.4 電針對(duì)改良型雙側(cè)頸動(dòng)脈結(jié)扎模型大鼠大腦海馬突觸蛋白PSD95、GluA1和GluN2B表達(dá)水平的影響 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠海馬PSD95、GluA1、GluN2B和p-GluN2B蛋白表達(dá)水平顯著下降(P<0.05)。與模型組比較，電針穴位組PSD95、GluA1、GluN2B和p-GluN2B蛋白表達(dá)水平顯著上升(P<0.05)，電針?lè)茄ㄎ唤MPSD95、GluA1、GluN2B和p-GluN2B蛋白表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)圖4。

4 討論

VD屬于中醫(yī)“呆證”范疇，其病位在腦，病機(jī)為髓海不足、清竅閉阻、神機(jī)失用?！鞍贂?huì)”屬督脈，位于巔頂，是督脈、手少陽(yáng)三焦經(jīng)、足太陽(yáng)膀胱經(jīng)、足少陽(yáng)膽經(jīng)和足厥陰肝經(jīng)的交會(huì)穴，能通達(dá)陰陽(yáng)脈絡(luò)，連貫周身經(jīng)穴，可振復(fù)陽(yáng)氣、疏通經(jīng)絡(luò)、調(diào)一身之陰陽(yáng)之氣，故“百會(huì)”為治療精神情志類疾病的要穴?！吧裢ァ币矊儆诙矫}，為神志所在，其功在神，為督脈、陽(yáng)明經(jīng)、足太陽(yáng)交匯之穴。《針灸甲乙經(jīng)》：“神者，天部之氣也；庭者，庭院也?！爆F(xiàn)代臨床研究也表明，“百會(huì)”“神庭”穴是調(diào)節(jié)大腦功能的要穴，具有較為明顯的安神定志、調(diào)節(jié)情志、醒腦開(kāi)竅的功效，可有效改善認(rèn)知功能，是極具研究?jī)r(jià)值的穴組[8-9]。本研究選擇“百會(huì)”“神庭”二穴，并施以電針，評(píng)價(jià)電針對(duì)VD大鼠學(xué)習(xí)和記憶功能的影響。

注：A.假手術(shù)組；B.模型組；C.電針?lè)茄ńM；D.電針穴位組；與假手術(shù)組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

改良型雙側(cè)頸動(dòng)脈結(jié)扎模型是一種經(jīng)典的制作VD模型的方法，該模型廣泛應(yīng)用于VD發(fā)病機(jī)制的研究和篩選相關(guān)的治療方法[12]。故本研究選擇改良型雙側(cè)頸動(dòng)脈結(jié)扎大鼠模型評(píng)價(jià)電針“百會(huì)”“神庭”對(duì)VD大鼠學(xué)習(xí)和記憶的作用及探究其機(jī)制。本研究發(fā)現(xiàn)，改良型雙側(cè)頸動(dòng)脈結(jié)扎能延長(zhǎng)大鼠訓(xùn)練期平臺(tái)逃避潛伏期，并縮短大鼠測(cè)試期平臺(tái)象限穿越次數(shù)和平臺(tái)象限停留時(shí)間。該結(jié)果提示，改良型雙側(cè)頸動(dòng)脈結(jié)扎能造成大鼠空間學(xué)習(xí)和記憶功能的下降。本研究選擇奧拉西坦作為陽(yáng)性對(duì)照藥[13]，結(jié)果表明，奧拉西坦能改善模型復(fù)制造成的學(xué)習(xí)和記憶能力的損傷，進(jìn)一步證明該研究模型的成功。模型組大鼠經(jīng)電針“百會(huì)”“神庭”治療后，空間學(xué)習(xí)和記憶功能都得到顯著改善，而電針?lè)茄ńM大鼠學(xué)習(xí)和記憶功能未能得到改善。值得注意的是，本研究選擇改良型雙側(cè)頸動(dòng)脈結(jié)扎大鼠模型，雙側(cè)頸動(dòng)脈的結(jié)扎間隔1周的時(shí)間，成功地避免了傳統(tǒng)雙側(cè)頸動(dòng)脈結(jié)扎復(fù)制模型引起動(dòng)物的高死亡率[10]。因此，該模型是一種較好的VD模型。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，雙側(cè)頸動(dòng)脈結(jié)扎后，大鼠腦組織出現(xiàn)水腫等現(xiàn)象，且大腦的質(zhì)量顯著增加，這和以往研究結(jié)果[14]相一致。電針“百會(huì)”“神庭”能阻止雙側(cè)頸動(dòng)脈結(jié)扎造成的大鼠腦質(zhì)量的增加，而電針?lè)茄ńM則不具備這種功效。此外，與奧拉西坦組比較，電針“百會(huì)”“神庭”也展示了更優(yōu)的效果，該結(jié)果也提示電針和奧拉西坦發(fā)揮改善VD學(xué)習(xí)和記憶功能的機(jī)制不完全相同。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，奧拉西坦主要促進(jìn)磷酰膽堿和磷酰乙醇胺合成，提高大腦中ATP與ADP的比值，使大腦中蛋白質(zhì)和核酸的合成增加，從而改善AD和記憶障礙患者的記憶和學(xué)習(xí)功能[15]。而電針可通過(guò)多種機(jī)制改善學(xué)習(xí)和記憶功能，如抗炎、抗氧化和阻止細(xì)胞凋亡等[16]。

海馬是大腦內(nèi)重要的腦區(qū)，與學(xué)習(xí)記憶功能密切相關(guān)[17-18]，雙側(cè)頸動(dòng)脈結(jié)扎能導(dǎo)致海馬結(jié)構(gòu)的萎縮及功能的減弱。神經(jīng)細(xì)胞間的信息傳遞主要通過(guò)突觸來(lái)完成，而突觸的損傷意味著神經(jīng)細(xì)胞間信息傳遞的異常。突觸損傷發(fā)生在VD發(fā)病的晚期，且與認(rèn)知功能障礙密切相關(guān)[5]。對(duì)VD發(fā)病中突觸可塑性的研究有利于進(jìn)一步闡明其發(fā)病機(jī)制。本研究重點(diǎn)觀察海馬CA1突觸的結(jié)構(gòu)以及突觸相關(guān)蛋白的表達(dá)水平，來(lái)探究電針“百會(huì)”“神庭”對(duì)海馬突觸結(jié)構(gòu)的影響。透射電子顯微鏡結(jié)果顯示，模型組大鼠海馬CA1區(qū)突觸結(jié)構(gòu)的數(shù)量顯著減少，電針“百會(huì)”“神庭”能逆轉(zhuǎn)改良型雙側(cè)頸動(dòng)脈結(jié)扎模型造成的突觸損傷，而電針?lè)茄ú痪邆淠孓D(zhuǎn)雙側(cè)頸動(dòng)脈結(jié)扎造成的突觸損傷的功效。該結(jié)果表明，電針“百會(huì)”“神庭”對(duì)雙側(cè)頸動(dòng)脈結(jié)扎造成的突觸結(jié)構(gòu)損傷確有改善效應(yīng)，同時(shí)也說(shuō)明穴位的特異性作用。

為進(jìn)一步研究電針“百會(huì)”“神庭”對(duì)改良型雙側(cè)頸動(dòng)脈結(jié)扎模型大鼠海馬突觸損傷修復(fù)的機(jī)制，本研究選擇性檢測(cè)了突觸后膜蛋白PSD-95及突觸受體蛋白的表達(dá)水平。突觸后致密物是位于中樞神經(jīng)系統(tǒng)突觸后膜的特殊結(jié)構(gòu)，是突觸后信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和整合的關(guān)鍵物質(zhì)。根據(jù)分子質(zhì)量不同，可將其分為PSD-95和PSD-93。海馬CA1區(qū)突觸后膜廣泛分布PSD-95。因此，通過(guò)檢測(cè)PSD-95的表達(dá)水平可進(jìn)一步確證突觸結(jié)構(gòu)的變化。Western blot檢測(cè)結(jié)果表明，模型組大鼠海馬PSD-95表達(dá)水平顯著下降，電針“百會(huì)”“神庭”能顯著提升PSD-95表達(dá)水平，而電針?lè)茄ㄎ晃茨芴嵘摰鞍椎谋磉_(dá)水平，該結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證電針“百會(huì)”“神庭”對(duì)改良型雙側(cè)頸動(dòng)脈結(jié)扎模型造成的突觸損傷具有改善作用。

突觸后膜主要的膜受體包括AMPAR和NMDAR，而GluA1是AMPAR的主要亞型，負(fù)責(zé)海馬突觸的基礎(chǔ)傳遞[19]。NMDAR由NR1、N2A和N2B亞基構(gòu)成，參與突觸可塑性的調(diào)控。本研究中，筆者檢測(cè)了GluA1的表達(dá)水平，結(jié)果顯示模型組大鼠海馬GluA1的表達(dá)水平顯著下降，而電針能改善改良型雙側(cè)頸動(dòng)脈結(jié)扎造成的GluA1下降。此外，筆者檢測(cè)了各組大鼠海馬GluN2B和磷酸化GluN2B的表達(dá)水平變化。磷酸化GluN2B是一種活化的GluN2B，參與NMDAR對(duì)Ca2+的調(diào)控[20]。因此，磷酸化GluN2B是NMDAR活性的亞基。模型組大鼠海馬GluN2B和磷酸化GluN2B的表達(dá)水平均下降，而電針“百會(huì)”“神庭”促進(jìn)GluN2B的表達(dá)及GluN2B的磷酸化。該結(jié)果也提示改良型雙側(cè)頸動(dòng)脈結(jié)扎模型動(dòng)物海馬突觸可塑性的損傷及電針“百會(huì)”“神庭”對(duì)其的逆轉(zhuǎn)作用。

總之，電針“百會(huì)”“神庭”可能通過(guò)調(diào)節(jié)突觸結(jié)構(gòu)改善VD大鼠學(xué)習(xí)記憶功能，其分子機(jī)制可能與增加突觸蛋白PSD95、GluA1和GluN2B的表達(dá)水平有關(guān)。海馬長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)(long-term potentiation，LTP)是學(xué)習(xí)記憶重要的模型，而LTP的誘導(dǎo)和維持與AMPAR和NMDAR的功能密切相關(guān)[21]，本研究未能用電生理的方法來(lái)評(píng)價(jià)改良型雙側(cè)頸動(dòng)脈結(jié)扎模型和電針對(duì)LTP誘導(dǎo)的影響，后期課題組將進(jìn)一步展開(kāi)該方面的研究。此外，Arc等蛋白參與LTP的維持，后期研究應(yīng)該更多聚焦NMDAR的下游信號(hào)通路的變化，進(jìn)一步闡明電針“百會(huì)”“神庭”的作用機(jī)制。