濕地水蔥根際、根內(nèi)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及其驅(qū)動(dòng)因素

柴寶峰，劉珊珊，劉晉仙，吳鐵航

（1.山西大學(xué) 黃土高原研究所 黃土高原生態(tài)恢復(fù)山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山西 太原 030006；2.美國(guó)佐治亞州南部大學(xué) 生物系，佐治亞州 斯泰茨伯勒，30460）

0 引言

與植物相關(guān)的微生物群落對(duì)于宿主營(yíng)養(yǎng)獲取、發(fā)育、免疫活性和抗逆性具有重要作用［1］。在長(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程中，植物通過(guò)自身的基因組塑造了其特異的微生物群落結(jié)構(gòu)，其中與植物功能適應(yīng)性相關(guān)的核心菌群稱為植物微生物組（plant-associated microbiome）［2］。微生物通過(guò)緩解生物和非生物環(huán)境脅迫，有利于植物對(duì)環(huán)境的適應(yīng)性，影響植物群落的生態(tài)功能。根際微生物可以幫助植物獲取營(yíng)養(yǎng)、產(chǎn)生生長(zhǎng)激素和防御病原微生物攻擊［3-4］。植物和微生物間的互惠關(guān)系、植物微生物組的結(jié)構(gòu)和多樣性并非隨機(jī)形成。根系微生物組的構(gòu)建過(guò)程受到宿主和環(huán)境因素的影響［5］。研究表明，植物的根際微生物（rhizosphere microbes）和根內(nèi)微生物（en?dophytic microbes）均來(lái)自于土壤微生物庫(kù)［6-7］。植物在不同的發(fā)育階段以及各種環(huán)境因子的驅(qū)動(dòng)下，通過(guò)根系分泌物組成變化和免疫反應(yīng)等，篩選和控制根際和根內(nèi)微生物群落的組成和多樣性［8］?！案鶇^(qū)理論”認(rèn)為植物根系通過(guò)氧氣傳遞，在根系周圍形成好氧、缺氧和厭氧區(qū)域，塑造了具有硝化和反硝化功能的微生物群落，是濕地氮污染去除的重要機(jī)理［9］。關(guān)于植物根際微生物群落結(jié)構(gòu)和功能已有較多的研究，認(rèn)為根際分泌物、土壤物理和化學(xué)性質(zhì)驅(qū)動(dòng)了根際微生物群落的結(jié)構(gòu)和多樣性［10］，而植物內(nèi)生微生物群落的構(gòu)建機(jī)制較為復(fù)雜，根內(nèi)微生物群落并非由根際土壤微生物隨機(jī)擴(kuò)散形成。Bulgarelli等［11］提出根內(nèi)微生物群落形成的“兩步法”選擇模型，認(rèn)為根際土壤多種因子決定土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的第一步選擇，第二步則依賴于宿主基因型的趨同選擇作用。關(guān)于植物微生物組的構(gòu)建機(jī)制是微生物生態(tài)學(xué)的重要問(wèn)題，尤其是環(huán)境因子和基因組決定的植物屬性對(duì)于植物微生物組構(gòu)建的相對(duì)貢獻(xiàn)，是植物微生物組學(xué)研究的關(guān)注點(diǎn)。

本研究選擇濕地水生植物水蔥（Scirpus vali?dus）為研究對(duì)象，測(cè)定不同污染梯度下水蔥根際和根內(nèi)細(xì)菌群落的結(jié)構(gòu)和多樣性，通過(guò)分析其與環(huán)境因子的關(guān)聯(lián)性，試圖回答以下問(wèn)題：（1）水蔥根際和根內(nèi)微生物組多樣性和結(jié)構(gòu)的差異性；（2）水蔥根際和根內(nèi)微生物組構(gòu)建的驅(qū)動(dòng)因素。研究結(jié)果以期為人工濕地植物選擇，構(gòu)建高效的污染物去除系統(tǒng)提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況與樣地設(shè)置

研究區(qū)位于山西省太原市清徐縣汾河二壩橋附近濕地（112°23?E，37°36?N）。該濕地經(jīng)過(guò)人工改造，全長(zhǎng)3 000 m左右。種植有水蔥、菖蒲（Acorus calamus）、蘆葦（Phragmites australis）、睡蓮（Nymphaea tetragona）等水生植物。水體中以顫藻-席藻群落為主，優(yōu)勢(shì)種為小席藻（Phormi?dium tenue）、窩型席藻（P.fovcolarum）、弱細(xì)顫藻（Oscillatoria tenui）、兩棲顫藻（O.anphibian）。在濕地污水入口處（EC）、濕地中部（MD）和出口（ET）處設(shè)置3個(gè)樣地，采用5點(diǎn)取樣法，選取長(zhǎng)勢(shì)相似的水蔥進(jìn)行根際土采集。

1.2 樣品的采集和處理

用鐵鍬將水蔥根系及底泥鏟起，整體放入無(wú)菌塑料袋中，置于車載冰箱運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室。先抖落水蔥根系周圍的松土，用無(wú)菌刷子刷取附在根表面1 cm左右的土壤。收集的根際土分為兩部分：一部分在實(shí)驗(yàn)室自然風(fēng)干，測(cè)定土壤理化性質(zhì)；另一部分土樣用于Illumina高通量測(cè)序。去除根際土后，對(duì)根表進(jìn)行滅菌。首先用無(wú)菌水洗滌，使根表不再粘附土壤；接著用70%的乙醇浸泡2 min，用 2.5% NaClO（含0.1%吐溫80）浸泡5 min，用70%無(wú)水乙醇浸泡30 s，最后用無(wú)菌水洗滌3次，放入10 mL離心管中備用。

1.3 土壤理化性質(zhì)測(cè)定

土壤樣品經(jīng)自然風(fēng)干，過(guò)100目篩選后，測(cè)定土壤的酸堿度、總氮、總碳、總硫、銨根離子、硝酸根離子。土壤pH的測(cè)定使用pH計(jì)（HAN?NA HI3221），稱取水蔥根際土10 g，土樣與水樣比例為1∶2.5，放入50 mL離心管中搖勻。搖床震蕩30 min，取出后靜置，取上清液測(cè)量。用元素分析儀（Elementar Vario MACRO，德國(guó)）測(cè)定根際土總氮（TN）、總碳（TC）、總硫（TS）。銨態(tài)氮（NH4+?N）、硝態(tài)氮（NO3-?N）采用間斷化學(xué)分析儀（CleverChem 380，德國(guó)）測(cè)定。

1.4 DNA提取及Miseq高通量測(cè)序

稱取0.5 g土壤樣品，使用E.Z.N.A.?土壤DNA試劑盒（Omega Bio-tek，USA），按照試劑盒使用說(shuō)明書(shū)步驟提取和純化土壤微生物DNA。每個(gè)采樣點(diǎn)3個(gè)重復(fù)，共9個(gè)DNA樣品，送上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行高通量測(cè)序。采用338F（ACTCCTACGGGAG?GCAGCAG） 和 806R（GGACTACHVGGGT?WTCTAAT）引物對(duì)細(xì)菌16S rRNA基因的V3～V4高可變區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系總體積為 20 μL，包括 5 μmol·L-1正反引物 0.8 μL，5×FastPfu Buffer 4 μL，2.5 mmol·L-1dNTPs 2 μL，F(xiàn)astPfu Polymerase 0.4 μL，0.2 μL 的 BSA，10 ng DNA模板。通過(guò)Illumina Miseq測(cè)序平臺(tái)對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序。

1.5 生物信息學(xué)分析

原始序列經(jīng)過(guò)質(zhì)控后，剔除嵌合序列，使用UPARSE以97%的相似性作為閾值劃分分類操作單元（operational taxonomic units，OTUs）。細(xì)菌測(cè)序數(shù)據(jù)與Greengenes數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，設(shè)置比對(duì)閾值為70%。去除樣品中豐度小于0.001%的OTU。所獲得的序列按最小樣本序列數(shù)抽平，用于下游分析。細(xì)菌16S rRNA基因的原始測(cè)序序列保存在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中。

1.6 數(shù)據(jù)分析

運(yùn) 用 Mothur（Version v.1.30）軟 件 分 析OTU水平的細(xì)菌群落的Sobs指數(shù)、Shannon多樣性指數(shù)、Simpson指數(shù)、ChaoI指數(shù)、ACE指數(shù)。采用方差膨脹因子（VIF）分析，先行篩選共線性較小的環(huán)境因子。運(yùn)用PCoA（principal component analysis）分析不同污染梯度細(xì)菌群落組成的差異性。使用db-RDA（distance based re?dundancy analysis）在門水平分析環(huán)境因子、對(duì)細(xì)菌群落的影響。使用Gephi 0.9.2分析不同污染梯度下水蔥根際、根內(nèi)細(xì)菌的共現(xiàn)性網(wǎng)絡(luò)。使用SPSS對(duì)水蔥根際土壤的理化性質(zhì)pH、TN、TC、TS、NH4+-N、NO3--N進(jìn)行單因素方差分析，檢驗(yàn)不同污染梯度下理化性質(zhì)的差異性，統(tǒng)計(jì)分析的置信區(qū)間為95%。

2 結(jié)果

2.1 土壤環(huán)境因子分析

3個(gè)樣地（EC、MD、ET）的土壤理化性質(zhì)具有不同程度的差異（表1）。從濕地入口（EC）到出口處（ET），pH 顯著降低（P<0.05），由8.52降為7.52；氮污染程度顯著減弱（P<0.05），NO3--N濃度由0.033 mg/kg降為0.022 mg/kg，TN濃度由0.041 mg/kg降為0.029 mg/kg，而NH4+-N下降趨勢(shì)不顯著（P>0.05）；TC含量由1.68%下降為1.09%，TS含量由0.15%下降為0.11%。說(shuō)明該濕地可有效去除水體中的氮污染和有機(jī)污染物，對(duì)水質(zhì)具有顯著的改善作用。而土壤理化性質(zhì)的變化，對(duì)植物和微生物群落可能產(chǎn)生相應(yīng)的影響。

表1 不同取樣點(diǎn)水蔥根際土壤理化性質(zhì)Table 1 Physicochemical properties of rhizosphere soil of Scallion at different sampling points

2.2 水蔥根際、根內(nèi)細(xì)菌群落多樣性

對(duì)濕地3個(gè)樣地內(nèi)生長(zhǎng)的水蔥根際和根內(nèi)細(xì)菌群落多樣性進(jìn)行分析。結(jié)果如表2所示，從濕地的入口到出口處，根際細(xì)菌的Sobs指數(shù)顯著下降（P<0.05），由 1 303.33降為 868.56，說(shuō)明根際細(xì)菌群落內(nèi)物種分布的均勻度顯著增加（P<0.05），同時(shí)Shannon-Weiner指數(shù)也顯著降低（P<0.05），由5.49降為3.34.說(shuō)明根際細(xì)菌群落的豐富度下降。Simpson指數(shù)在中部最低（0.008）、ACE指數(shù)和Chao指數(shù)在中部最高，分別為2 193.78和2 148.91。但水蔥根內(nèi)細(xì)菌群落的多樣性在3個(gè)樣點(diǎn)間差異不顯著，說(shuō)明根內(nèi)細(xì)菌群落的多樣性受土壤理化因子的影響不明顯。根際和根內(nèi)細(xì)菌群落多樣性指數(shù)的差異不顯著（P>0.05），根內(nèi)的Shannon-Weiner指數(shù)（5.423）略高于根際（4.985）。

表2 不同污染梯度下根際和根內(nèi)細(xì)菌群落α多樣性Table 2 α diversity of rhizosphere and endophytic bacterial communities with pollution gradients

2.3 濕地水蔥根際、根內(nèi)細(xì)菌組成

高通量測(cè)序的OTU注釋結(jié)果如圖1所示，研究樣地水蔥根際和根內(nèi)細(xì)菌群落共有52個(gè)門、150個(gè)綱、341個(gè)目、565個(gè)科、1 053個(gè)屬。水蔥根際、根內(nèi)細(xì)菌在門的種類組成上具有一定的相似性。豐度大于1%的細(xì)菌優(yōu)勢(shì)門在根際有 11個(gè)（圖 1（a）），分別為厚壁菌門（Fir?micutes）、變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteriota）、脫 硫 桿 菌 門（Desulfobacte?rota）、綠彎菌門（Chloroflexi）、擬桿菌門（Bacte?roidota）、酸桿菌門（Acidobacteriota）、芽單胞菌門（Gemmatimonadota）、疣微菌門（Verrucomicro?biota）、黏細(xì)菌門（Myxococcota）、纖維桿菌門（Fibrobacterota）。不同取樣點(diǎn)根際細(xì)菌門的豐度差異顯著，變形菌門、放線菌門、脫硫桿菌門的豐度在入口處最高，分別為29.58%、40.71%、6.01%，出口處最低，分別為16.39%、7.58%、2.39%；而豐度最大的厚壁菌門則呈現(xiàn)相反的趨勢(shì)，入口處和出口處的豐度分別為9.68%和66.05%。可見(jiàn)，環(huán)境因子對(duì)于根際細(xì)菌群落的組成、結(jié)構(gòu)具有較大的影響。水蔥根內(nèi)豐度大于1%的細(xì)菌優(yōu)勢(shì)門有14個(gè)（圖1（b）），依次為變形菌門、放線菌門、厚壁菌門、脫硫桿菌門、擬桿菌門、綠彎菌門、硝化螺旋菌門（Nitrospirota）、MBNT15、酸桿菌門、疣微菌門、黏細(xì)菌門、Sva0485、芽單胞菌門、梭桿菌門（Fusobacteriota）等。不同取樣點(diǎn)根內(nèi)細(xì)菌門的豐度差異不顯著，說(shuō)明環(huán)境因子對(duì)根內(nèi)細(xì)菌的組成結(jié)構(gòu)影響不顯著。除了在豐度上的差異外，在門水平水蔥根際和根內(nèi)細(xì)菌群落組成有4個(gè)門不同，差異性達(dá)30.77%。

圖1 不同污染梯度根際（a）、根內(nèi)（b）細(xì)菌門水平的組成Fig.1 Composition of rhizosphere（a）and endophytic（b）bacterial phylum at different sampling points

水蔥根際細(xì)菌群落在屬水平的組成豐度大于1%的細(xì)菌屬有12個(gè)（圖2（a）），從大到小分別為微小桿菌屬（Exiguobacterium）、假節(jié)桿菌屬（Pseudarthrobacter）、類諾卡氏屬（Nocardioi?des）、芽 孢 桿 菌 屬（Bacillus）、毛 球 菌 屬（Trichococcus）、芽孢八疊球菌（Paenisporosarci?na）、鞘 氨 醇 單 胞 菌 屬（Sphingomonas）、Norank_Steroidobacteraceae、Unclssified_Desulfo?capsaceae、游球菌（Planococcus）、節(jié)桿菌屬（Ar?throbacter）、Unclassified_Intrasporangiaceae。 水蔥根內(nèi)細(xì)菌群落在屬水平上豐度大于1%的細(xì)菌屬有13個(gè)（圖2（b）），從大到小依次為微小桿菌屬、紅球菌屬（Rhodococcus）、硫桿菌屬（Thiobacillus）、芽孢桿菌屬、Norank_Steroido?bacteraceae、Norank_f_norank_o_norank_c_norank_P_MB、NT15norank_f_norank_o_SJA-15、El?lin6067、norank_f_norank_o_norank_c_4-29-1、norank_f_SC-I-84、norank_f_Rhizobiales_incer?tae_sedis、norank_f_norank_o_norank_c_Sva0485、Hypnocyclicus。水蔥根際和根內(nèi)細(xì)菌群落的組成在屬水平的差異顯著，有3個(gè)共有屬，差異性達(dá)76.92%。

圖2 不同污染梯度根際（a）、根內(nèi)（b）細(xì)菌屬水平下的組成Fig.2 Composition of rhizosphere（a）and endophytic（b）bacterial genus at different sampling points

在OTU水平分析3個(gè)樣地水蔥根際和根內(nèi)細(xì)菌的共有菌和特異菌，韋恩圖分析（圖3）可見(jiàn)，12 478個(gè)OTU中，607個(gè)OTU共存于根際和根內(nèi)，根際特有的OTU數(shù)量為385，而根內(nèi)特有的OTU達(dá)759個(gè)。水蔥根際OTU在中間樣點(diǎn)的個(gè)數(shù)最多為793個(gè)，而根內(nèi)OTU在出口處最多，達(dá)904個(gè)。

圖3 韋恩圖分析三個(gè)樣地根際（RS）、根內(nèi)（ES）OTU的分布Fig.3 Venn diagram analysis of distribution of rhizosphere（RS）and endophytic（ES）OTU at three sampling points

2.4 水蔥根際和根內(nèi)細(xì)菌群落差異性分析

在OTU水平對(duì)水蔥根際和根內(nèi)細(xì)菌群落的差異性進(jìn)行PCoA分析。結(jié)果表明不同取樣點(diǎn)水蔥根際細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)有極顯著差異（P<0.01）（圖 4（a））。PCoA 分析第一軸和第二軸的解釋率分別為66.13%和13.92%，總解釋率達(dá)80.05%。水蔥根際細(xì)菌群落呈現(xiàn)離散型分組，表明不同取樣點(diǎn)土壤理化性質(zhì)對(duì)水蔥根際細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)有顯著影響。不同取樣點(diǎn)水蔥根內(nèi)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)有一定差異，但差異不顯著（圖 4（b））（P=0.132），第一軸和第二軸的解釋率分別為28.79%和25.71%，總解釋率為54.50%。說(shuō)明不同取樣點(diǎn)土壤環(huán)境因子對(duì)水蔥根內(nèi)細(xì)菌群落的影響較小。水蔥根際、根內(nèi)細(xì)菌群落的差異極顯著（P<0.01），且根內(nèi)群落更為聚集（圖4（c）），PCoA第一軸和第二軸解釋率分別為27.20%和23.00%，總解釋率達(dá)50.20%。說(shuō)明水蔥根內(nèi)細(xì)菌群落組成相似性高，受環(huán)境影響較小，而根際土壤細(xì)菌群落受環(huán)境影響較大。

圖4 沿污染梯度根際（a）、根內(nèi)（b）以及根際和根內(nèi)間（c）細(xì)菌群落的β多樣性Fig.4 β diversity of rhizosphere（a）and rhizosphere（b）bacterial communities，and between them（c）at different sampling points

2.5 水蔥根際、根內(nèi)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與環(huán)境因子的關(guān)系

利用db-RDA方法進(jìn)一步分析水蔥根際和根內(nèi)細(xì)菌群落組成結(jié)構(gòu)與環(huán)境因子的關(guān)系。根際細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)在門水平主要受pH、NO3--N、NH4+-N和TN的影響，其中第一軸和第二軸的解釋率分別為43.85%和8.08%，總解釋率達(dá)51.93%（圖5（a））。變形菌和放線菌與NH4+-N、pH、NO3--N有顯著的相關(guān)性（P<0.05），說(shuō)明水蔥根際細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)受環(huán)境因子的影響較大。水蔥根內(nèi)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)在門水平主要受pH和NH4+-N的影響（圖5（b）），第一軸和第二軸的解釋率分別為23.18%和16.81%，總解釋率為39.99%，低于環(huán)境因子對(duì)根際細(xì)菌的解釋率，其中pH與根內(nèi)放線菌和MBNT15菌的相關(guān)性最大。

圖5 不同環(huán)境因子對(duì)根際（a）和根內(nèi)（b）細(xì)菌的影響Fig.5 Effects of different environmental factors on rhizosphere（a）and endophytic（b）bacterial communities

2.6 水蔥根際、根內(nèi)細(xì)菌群落的分子生態(tài)網(wǎng)絡(luò)

利用共現(xiàn)性分子生態(tài)網(wǎng)絡(luò)（molecular eco?logical network，MEN）分析水蔥根際和根內(nèi)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)復(fù)雜性和穩(wěn)定性特征（圖6）。網(wǎng)絡(luò)的拓?fù)鋵W(xué)屬性參數(shù)如表3所示。根際細(xì)菌群落的節(jié)點(diǎn)數(shù)（158個(gè)）、邊數(shù)（2 620）和連接度（16.58）都遠(yuǎn)大于根內(nèi)細(xì)菌群落，說(shuō)明根際細(xì)菌群落的復(fù)雜性較高。網(wǎng)絡(luò)密度參數(shù)表現(xiàn)出類似的特征，根內(nèi)細(xì)菌群落的模塊化程度（0.657）高于根際細(xì)菌群落（0.396），說(shuō)明根內(nèi)細(xì)菌群落的生態(tài)位分化更為明顯。根內(nèi)細(xì)菌群落節(jié)點(diǎn)間平均路徑距離（5.864）顯著大于根際細(xì)菌群落（3.032），說(shuō)明節(jié)點(diǎn)間物質(zhì)、能量和信息的傳遞距離在根內(nèi)更長(zhǎng)，速率更慢。不同污染梯度下水蔥根際、根內(nèi)有不同水平的連接性，根據(jù)BC（betweeness centrality）值可判別網(wǎng)絡(luò)圖中的關(guān)鍵物種。根據(jù)BC值的大小篩選出根際的關(guān)鍵屬有5個(gè)分別為unclassified_f__Geobacteraceae、Longivirga、鏈霉菌屬（Strepto?myces）、unclassified_o__Gaiellales、norank_f__Rubritaleaceae（BC>1 000）。根內(nèi)的關(guān)鍵屬有7個(gè)分別為unclassified_p__Proteobacteria、冷桿菌屬（Cryobacterium）、norank_f_Methyloligellaceae、Subgroup_10、 norank_f__Geobacteraceae、 Paeni?sporosarcina、Confluentibacter（BC>1 800）。

表3 水蔥根際和根內(nèi)細(xì)菌群落分子生態(tài)網(wǎng)絡(luò)圖的拓?fù)鋵W(xué)屬性Table 3 Topological properties of molecular ecological net‐work of rhizosphere and endophytic bacterial communities from Scalonion

圖6 根際（a）和根內(nèi)（b）細(xì)菌群落屬水平分子生態(tài)網(wǎng)絡(luò)圖Fig.6 Molecular ecological network diagram of rhizosphere（a）and endophytic（b）bacterial community at genus level

3 討論

3.1 根際和根內(nèi)微生物群落特征

水蔥根際和內(nèi)生細(xì)菌群落在門水平上的主要類群相對(duì)豐度沿環(huán)境梯度呈現(xiàn)一定的格局。厚壁菌門、變形菌門和放線菌門的分布，與宋延靜等［12］對(duì)黃河三角洲濕地蘆葦根際固氮微生物的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的研究結(jié)果相似，說(shuō)明這些細(xì)菌門在氮素去除過(guò)程中有重要的作用。隨氮污染濃度的下降，變形菌門和放線菌門均呈遞減的趨勢(shì)，說(shuō)明二者的豐度與氮的濃度密切相關(guān)。放線菌在污水及有機(jī)固體廢物的生物處理中有重要作用［13］。隨著氮濃度降低，厚壁菌門呈現(xiàn)增加的趨勢(shì)，可能是厚壁菌在高污染生境中（污水入口）進(jìn)入休眠狀態(tài)形成芽孢和孢子［14］，出口處污染物濃度降低，其豐度增加。Hardoim（2015）等［15］總結(jié)了迄今為止鑒定的原核內(nèi)生細(xì)菌，共有21個(gè)門，其中4個(gè)門占內(nèi)生細(xì)菌序列總數(shù)的96%，分別為變形菌（54%），放線菌（20%），厚壁菌（16%），擬桿菌門（6%），這與本研究對(duì)濕地水蔥根內(nèi)細(xì)菌群落組成的結(jié)果相類似。不同宿主物種內(nèi)生細(xì)菌群落關(guān)鍵組分的相似性分析表明，水蔥根內(nèi)微生物定殖不是一個(gè)被動(dòng)過(guò)程，植物有能力選擇某些微生物群落，或者某些微生物更擅長(zhǎng)填充根系定植生態(tài)位。與水稻［16］和楊樹(shù)［17］的研究類似，從根際土壤到根內(nèi)，酸桿菌的相對(duì)豐度降低，而變形菌的相對(duì)豐度在根內(nèi)層增加，表明在濕地中水蔥根內(nèi)細(xì)菌門變化可能與陸地植物相似，酸桿菌可能缺乏在內(nèi)生環(huán)境中增殖所必需的特性。微小桿菌屬在根內(nèi)外較豐富，其具有廣泛的植物有益特性，促進(jìn)植物生長(zhǎng)，包括磷酸鹽溶解、固氮、細(xì)胞分裂素以及植物激素吲哚-3乙酸（IAA）和赤霉素的合成［18］。由于研究樣地為處理低污染水排放的濕地，所以污染物的存在對(duì)植物根內(nèi)外相關(guān)細(xì)菌產(chǎn)生選擇性，導(dǎo)致能夠利用這些污染物作為替代能源的分類群的豐度較大。如水蔥根際假節(jié)桿菌屬與脅迫條件有關(guān)，它能夠使用多種基質(zhì)作為碳源和能源，且通常對(duì)有毒化合物具有耐受性［19］；鞘氨醇菌屬［20］和類諾卡氏菌屬［21］具有較好的利用石油烴能力，并能適應(yīng)高濃度的石油烴污染環(huán)境。根內(nèi)的紅球菌屬對(duì)有機(jī)污染化合物二苯并噻吩（DBT）具有較強(qiáng)的脫硫能力，其最終產(chǎn)物為羥基聯(lián)苯，從而減少對(duì)環(huán)境的污染［22］；硫桿菌屬具有除硝態(tài)氮和硫化物利用的雙重特性［23］。不同污染梯度下，根際細(xì)菌多樣性和豐度變化比根內(nèi)顯著，根際微生物群落更容易受到土壤環(huán)境的影響，植物內(nèi)生環(huán)境相對(duì)穩(wěn)定。Hardoim（2015）等［15］研究認(rèn)為根際細(xì)菌多樣性大于根內(nèi)細(xì)菌多樣性，但本研究結(jié)果與此不同，可能是取樣時(shí)間的不同所致。比如植物衰老期根內(nèi)機(jī)會(huì)性病原體增多，降低了植物適應(yīng)性，并在特定條件下宿主植物暴露于生物或非生物脅迫，導(dǎo)致植物、微生物和環(huán)境之間的多營(yíng)養(yǎng)相互作用關(guān)系被破壞，最終表現(xiàn)為內(nèi)生微生物群落多樣性多于根際土壤。例如在被細(xì)菌病原體歐文氏胡蘿卜亞種（Erwinia carotovorasubsp.carotovora）感染的植物中，馬鈴薯根莖中細(xì)菌內(nèi)生菌的多樣性增加［24］。土壤細(xì)菌群落的這些廣泛變化暗示土壤微生物組根據(jù)植物的需要發(fā)生變化，通常根系微生物組可以在植物生長(zhǎng)的一定階段表現(xiàn)特定的功能［25］。

PCoA分析表明，水蔥根際和根內(nèi)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)出現(xiàn)了明顯的分化，且根際和根內(nèi)細(xì)菌出現(xiàn)了不同的指示性O(shè)TU。這主要是由于根際細(xì)菌定殖主要是由大量碳的沉積（例如根分泌物、根冠粘液等）驅(qū)動(dòng)［26］。但植物相關(guān)細(xì)菌必須具有高度的競(jìng)爭(zhēng)力才能成功定居根區(qū)［27］。與根際和根面定殖不同，內(nèi)生能力（即成功定殖宿主植物的能力）可能需要特定的性狀，例如，趨化性相關(guān)基因的表達(dá)、鞭毛的形成、細(xì)胞壁降解酶的產(chǎn)生等［15］，以及根際土傳細(xì)菌和宿主植物先天免疫系統(tǒng)之間復(fù)雜的相互作用。楊樹(shù)［28］、鴨跖草［29］和水稻［16］，根際和根內(nèi)生微生物群之間的這種結(jié)構(gòu)分化也有報(bào)道。根內(nèi)特有的OTU260隸屬于弧菌屬［30］，其成員能夠通過(guò)釋放抗微生物化合物來(lái)抑制真菌植物病原體，有益于植物的健康生長(zhǎng)。

根際網(wǎng)絡(luò)的復(fù)雜性很可能是由于根和周圍土壤的局部環(huán)境的持續(xù)變化所引起，如養(yǎng)分有效性、酸堿度、水分、氧氣含量和CO2水平的變化［31］。與根際相比，根內(nèi)的細(xì)菌群落的物種、多樣性和網(wǎng)絡(luò)復(fù)雜性較低，表明有限數(shù)量的物種被植物組織物理分離，或微生物與宿主植物的相互作用的強(qiáng)度，遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于微生物-微生物間的相互作用［23］。無(wú)論在根際還是根內(nèi)，節(jié)點(diǎn)之間94%以上為正相關(guān)，表明在水體環(huán)境中根際和根內(nèi)細(xì)菌群落物種間的共生、共棲關(guān)系更為緊密。在特定環(huán)境因素下，具有相似適應(yīng)能力的細(xì)菌群落通?？晒泊媲揖哂邢嗨频沫h(huán)境偏好，享有共同或者相似的生態(tài)位。無(wú)論在根際還是根內(nèi)，變形菌具有最多的連接線，表明它們可能是網(wǎng)絡(luò)相互作用關(guān)系的樞紐。這些類群是微生物組結(jié)構(gòu)和功能的驅(qū)動(dòng)因素，可能對(duì)植物健康和生態(tài)系統(tǒng)功能至關(guān)重要。BC值越大代表微生物在群落結(jié)構(gòu)和功能中發(fā)揮的作用越重要。鏈霉菌屬具有增強(qiáng)植物抗逆性，在協(xié)助植物固氮和促進(jìn)植物吸收營(yíng)養(yǎng)方面發(fā)揮著重要作用［32］。Paenisporosarcina是具有多種代謝功能的細(xì)菌，有多種活性，如營(yíng)養(yǎng)循環(huán)、有機(jī)化合物降解等［33］。

3.2 土壤理化因子對(duì)根際、根內(nèi)微生物的影響

土壤因子對(duì)根系微生物群落的形成起著重要作用，根際微生物棲息的微生境中的土壤因子，可以局部影響微生物的生存狀態(tài)［34］。pH值、C、N、溫度等非生物因素會(huì)影響微生物群落的分布，因此土壤性質(zhì)會(huì)直接影響根際細(xì)菌群落，或通過(guò)影響植物根系的生理學(xué)特征而間接影響根際微生物群落［35］。大多數(shù)研究認(rèn)為，土壤pH值是決定不同土壤細(xì)菌多樣性和門組成的主要因素。本研究中門水平的根際、根內(nèi)細(xì)菌群落都受到pH的顯著影響。Li等［29］對(duì)根部細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的多因素分析結(jié)果顯示，pH值對(duì)根內(nèi)細(xì)菌影響較小，可能是植物體內(nèi)的酸堿度相對(duì)穩(wěn)定。Lafay 和 Burdon［36］卻認(rèn)為，雖然影響較小，但土壤酸堿度對(duì)細(xì)菌群落的影響可以延伸到植物內(nèi)部。本研究根際土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與土壤總氮也有顯著相關(guān)性。凃月等［37］認(rèn)為，TC、TN對(duì)濕地植物根際細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)揮更為重要的作用，與本研究結(jié)果類似。水蔥根際細(xì)菌放線菌門與NO3--N顯著相關(guān)，其對(duì)NO3--N的去除發(fā)揮著重要的作用［38］；變形菌門與NO3--N和NO4+-N成正相關(guān)，是生態(tài)系統(tǒng)的重要的微生物類群，與硝酸鹽和亞硝酸鹽的氨化有關(guān)系［39］。總之，本研究中環(huán)境因子對(duì)細(xì)菌群落格局和多樣性的總解釋率達(dá)51.93%，說(shuō)明了微生物群落與環(huán)境之間的緊密聯(lián)系。

4 結(jié)論

在污染濕地中，水蔥根際、根內(nèi)細(xì)菌在門和屬水平上各自具有不同的優(yōu)勢(shì)類群，門水平上物種組成具有一定的相似性，但屬水平物種組成差異較大。環(huán)境因子對(duì)根際細(xì)菌多樣性的影響較大，而對(duì)根內(nèi)細(xì)菌多樣性影響較小。pH、NO3-、NH4+、TN對(duì)根際細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的形成起主要作用，根內(nèi)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)受pH和NH4+的影響。根際和根內(nèi)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性具有顯著差異，根際細(xì)菌群落的復(fù)雜性較高，根內(nèi)細(xì)菌群落的物種、多樣性和網(wǎng)絡(luò)復(fù)雜性較低，根內(nèi)細(xì)菌群落的生態(tài)位分化更為明顯。