張婷婷，向小琴，鐘江姍，桂雪梅，范賢明

西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，四川瀘州，646000

急性肺損傷(acute lung injury，ALI)有著高發(fā)病率和高死亡率的特點(diǎn)，其特征是彌漫性肺浸潤、毛細(xì)血管通透性增加、氣體交換受損和肺部炎癥，導(dǎo)致一種以低氧為主的急性呼吸衰竭綜合征[1]。目前針對(duì)ALI 的治療除了一般支持療法外，還有一些抗炎藥、抗氧化劑、抗凝劑、表面活性劑和神經(jīng)肌肉阻滯劑等，這些并不能顯著提高ALI 患者的生存率和生活質(zhì)量[2]。ALI 的病理生理基礎(chǔ)多種多樣，包括免疫細(xì)胞過度激活、“細(xì)胞因子風(fēng)暴”、氧化應(yīng)激、炎癥、缺氧、電解質(zhì)紊亂等[3]，其中氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)至關(guān)重要。脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)可與細(xì)胞表面的Toll樣受體4(toll-like receptor 4，TLR4)結(jié)合，經(jīng)過一系列的反應(yīng)，最終激活以NF-κB 為主的核內(nèi)因子，進(jìn)而產(chǎn)生級(jí)聯(lián)放大效應(yīng)，形成復(fù)雜的系統(tǒng)炎癥反應(yīng)[4]，與此同時(shí)氧化應(yīng)激信號(hào)可以通過激活Nrf2 而調(diào)節(jié)LPS 所誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)[5]。最近的研究表明，腸道微生物組可能在腸道以外其他疾病的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用[6]。這與腸道微生物群產(chǎn)生的短鏈脂肪酸(short chain fatty acids，SCFAs)有關(guān)，這些脂肪酸可以在遠(yuǎn)處器官引起免疫調(diào)節(jié)變化[7]。其中，丙酸鹽具有抗炎和抗氧化的作用[8]，丙酸鹽可以顯著調(diào)節(jié)體外和體內(nèi)肺免疫反應(yīng)，腸道微生物組丙酸鹽產(chǎn)生增加與肺部炎癥減少有關(guān)[9]，此外研究還發(fā)現(xiàn)丙酸鈉(sodium propionate，SP)對(duì)LPS 誘導(dǎo)的肺損傷具有抗炎作用[10]。然而，目前尚不清楚丙酸鹽如何在內(nèi)毒素相關(guān)的肺部疾病中發(fā)揮作用。因此，本研究的目的是探討丙酸鹽減輕LPS 誘導(dǎo)的ALI 大鼠肺損傷具體機(jī)制，為ALI 的治療提供新的思路。

材料與方法

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 20 只健康8 周齡雄性SD 大鼠，體質(zhì)量(200±20) g，購自西南醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SYSK(川)2018-065。大鼠飼養(yǎng)于SPF 級(jí)環(huán)境，室溫(25±5)℃、濕度40%～60%，大鼠在實(shí)驗(yàn)期間自由飲水和攝食。

2 實(shí)驗(yàn)試劑 脂多糖和丙酸鈉(Sigma 公司)；腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)，白細(xì)胞介素6(interleukin-6，IL-6)，IL-10 ELISA 試劑盒(ELK Biotechnology 公司)；丙二醛(malondialdehyde，MDA)，超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)ELISA 試劑盒(南京建成生物工程研究所)；BAC 蛋白定量試劑盒(ASPEN 公司)；RIPA 總蛋白裂解液(ASPEN 公司)；核轉(zhuǎn)錄因 子NF-κBp65、核轉(zhuǎn)錄因子p-NF-κBp65、Keap1、NF-E2 相關(guān)因子2(Nrf2)兔源單克隆抗體及羊抗兔二抗(ASPEN 公司)；ECL 化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒(ASPEN 公司)。

3 動(dòng)物分組及模型建立 適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，將SD 大鼠隨機(jī)分模型組、低劑量SP 組、高劑量SP 組、對(duì)照組，每組5 只大鼠。低劑量SP 組和高劑量SP組分別給予300mg/kg、500mg/kg的SP 灌胃，相同條件下，模型組和對(duì)照組給予等量的0.9%氯化鈉注射液灌胃，1 次/d，持續(xù)7 d。最后一次灌胃30min 后予以10%水合氯醛(0.3 mL/100 g)腹腔注射麻醉大鼠，在大鼠充分麻醉后，模型組和SP 組通過氣管內(nèi)滴注LPS(5 mg/kg)的方法制備ALI 模型；相同條件下，對(duì)照組氣管內(nèi)滴注等體積0.9%氯化鈉注射液。造模完成后6 h 處死大鼠，收集腹主動(dòng)脈血、肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)、肺組織。

4 大鼠動(dòng)脈血氧分壓(PaO2)、肺濕/干質(zhì)量比(W/D)測定 抽取大鼠腹主動(dòng)脈血，用血?dú)夥治鰞x檢測PaO2。取右肺組織，用PBS 沖洗干凈，用濾紙吸干表面水分，稱取肺濕重(W)；隨后將該肺組織放置于70℃烤箱內(nèi)72 h 直至完全脫水，再次稱取肺質(zhì)量，為肺干重(D)，計(jì)算相應(yīng)的肺組織濕/干重比值(W/D)。

5 大鼠肺組織病理學(xué)觀察 剪取大鼠左肺上葉組織小塊，用PBS 沖洗干凈，用甲醛固定，石蠟包埋，切成5 μm 厚片，HE 染色。在光學(xué)顯微鏡(200×)下隨機(jī)選取5 個(gè)視野， 按照肺泡水腫、肺泡內(nèi)充血、炎癥細(xì)胞浸潤、肺間質(zhì)水腫程度評(píng)分，無改變或輕微改變?yōu)? 分，輕度改變?yōu)? 分，中度改變?yōu)? 分，重度改變?yōu)? 分，極重度改變?yōu)? 分，以平均值作為每個(gè)樣本的肺損傷病理學(xué)評(píng)分[11]。

6 大鼠血清和BALF 的收集及細(xì)胞因子的測定抽取大鼠腹主動(dòng)脈血5 mL；打開胸腔，分離出大鼠頸部氣管，結(jié)扎氣管及右主支氣管，抽取無菌冰氯化鈉溶液2 mL 緩慢注入肺內(nèi)，反復(fù)抽注5 次，收集BALF。將取得的血液及BALF 樣本分別在4℃下以3 000 r/min 離心10 min 后收集上清液。按照對(duì)應(yīng)的ELISA 檢測試劑盒說明書測定血清和BALF 中TNF-α、IL-6、IL-10 的濃度。

7 大鼠肺組織中MDA、SOD 水平測定 取適量肺組織，制備成組織勻漿。參照相應(yīng)試劑盒說明書，用黃嘌呤氧化酶法測肺組織SOD 活力，用硫代巴比妥酸法測肺組織MDA 含量。

8 Western blot 法檢測肺組織NF-κB p65、p-NFκB p65、Keap1、Nrf2 蛋白的表達(dá) 取適量肺組織，加入總蛋白裂解液，提取出總蛋白，用BCA 法測定所提蛋白的濃度，將各組蛋白濃度調(diào)整一致，然后加入5×蛋白上樣緩沖液，95℃～100℃沸水浴5 min。制膠，每孔上樣后進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜。5%脫脂奶粉封閉PVDF 膜1 h 后加入一抗4℃過夜。PBST 洗膜3 次后，加入二抗，室溫孵育30 min，用TBST 在室溫下?lián)u床上洗4 次。加入適量的ECL 發(fā)光液曝光分析。

9 統(tǒng)計(jì)分析方法 應(yīng)用SPSS26.0 統(tǒng)計(jì)分析軟件，計(jì)量數(shù)據(jù)以±s表示，組間差異采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1 各組大鼠動(dòng)脈血PaO2比較 與對(duì)照組相比，模型組大鼠動(dòng)脈血PaO2明顯降低(P＜0.05)，不同劑量的SP 可顯著提高大鼠動(dòng)脈血PaO2值(P＜0.05)，且高劑量SP 組動(dòng)脈血PaO2提高更明顯(P＜0.05，表1)。

2 各組大鼠肺W/D 值比較 與對(duì)照組相比，模型組大鼠肺組織W/D 值明顯升高(P＜0.05)，不同劑量的SP 可顯著降低大鼠肺組織W/D 值(P＜0.05)，且高劑量SP 組W/D 值降低更明顯(P＜0.05，表1)。

3 各組大鼠肺組織病理學(xué)及評(píng)分 HE 染色結(jié)果顯示，對(duì)照組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)清晰完善，肺泡和肺間質(zhì)無水腫，肺泡腔無明顯充血、出血及炎癥細(xì)胞浸潤；與對(duì)照組相比，模型組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)紊亂，肺泡水腫明顯，肺泡腔出血，伴有炎癥細(xì)胞廣泛浸潤，肺泡間隔明顯增厚；而SP 組肺組織結(jié)構(gòu)較LPS 組更清晰，且肺泡腔內(nèi)紅細(xì)胞、炎癥細(xì)胞減少，滲出減輕，肺泡間隔增厚減輕，高劑量SP 組較低劑量SP 組病理改善更明顯(圖1)。與對(duì)照組相比，模型組大鼠肺損傷病理學(xué)評(píng)分值明顯升高(P＜0.05)，SP 組可顯著降低大鼠肺損傷病理學(xué)評(píng)分值(P＜0.05)，且高劑量SP 組病理學(xué)評(píng)分值較低劑量SP 組降低更明顯(P＜0.05，表1)。

表1 各組大鼠PaO2、W/D、肺損傷病理學(xué)評(píng)分變化(n=5)Tab.1 PaO2,W/D and lung pathological score of mice (n=5)

圖1 SP 在LPS 誘導(dǎo)的急性肺損傷大鼠中對(duì)肺組織HE 染色的影響 (HE，200×) A:Control group;B:Model group;C:SP (300 mg/kg)group;D:SP (500 mg/kg) groupFig.1 Effect of SP on HE staining of lung tissue in LPS-induced acute lung injury rats (HE,200×) A:control group;B:model group;C:SP (300 mg/kg) group;D:SP (500 mg/kg) group

4 各組大鼠肺組織氧化指標(biāo)比較 與對(duì)照組相比，模型組大鼠肺組織中氧化指標(biāo)MAD 含量升高(P＜0.05)，抗氧化指標(biāo)SOD 活性降低(P＜0.05)，低、高劑量的SP 使大鼠肺組織的MAD 含量降低(P＜0.05)，SOD 活性增加(P＜0.05)；與低劑量SP 組對(duì)比，高劑量SP 組大鼠肺組織MAD含量降低，SOD 活性增加更明顯(P＜0.05，圖2)。

圖2 SP 對(duì)肺組織MDA 含量和SOD 活性的影響[aP＜0.05,vs control group;bP＜0.05,vs LPS group;cP＜0.05, vs SP(300 mg/kg)]Fig.2 Effects of SP on MDA content and SOD activity in lung tissue(± s,n=5) (aP＜0.05,vs control group;bP＜0.05,vs LPS group;cP＜0.05, vs SP [300 mg/kg])

5 各組大鼠血清和肺泡灌洗液炎癥因子含量比較與對(duì)照組相比，模型組大鼠血清和肺泡灌洗液中的促炎因子IL-6、TNF-α 均顯著升高(P＜0.05)，同時(shí)抗炎因子IL-10 呈應(yīng)激性增加(P＜0.05)；經(jīng)SP 干預(yù)后，大鼠血清和肺泡灌洗液中的IL-6、TNF-α 顯著降低(P＜0.05)，IL-10 顯著升高(P＜0.05)；與低劑量SP 組相比，高劑量SP 組大鼠血清和肺泡灌洗液中的IL-6、TNF-α 降低，IL-10 升高更明顯(P＜0.05，圖3)。

圖3 SP 對(duì)急性肺損傷大鼠血清和BALF 中IL-6、TNF-α、IL-10 濃度的影響[aP＜0.05,vs Control group;bP＜0.05,vs LPS group;cP＜0.05,vs SP (300 mg/kg)]Fig.3 Effects of SP on IL-6,TNF-α,IL-10 content in serum and BALF of mice with acute lung injury (n=5) (aP＜0.05,vs control group;bP＜0.05,vs LPS group;cP＜0.05, vs SP [300 mg/kg])

6 各組大鼠肺組織中NF-κB、p65、p-NF-κB p65、Keap1、Nrf2 蛋白的表達(dá)比較 與對(duì)照組相比，模型組大鼠肺組織p-NF-κB p65 和Keap1 蛋白表達(dá)水平升高(P＜0.05)，而Nrf2 蛋白表達(dá)水平降低(P＜0.05)；低、高劑量的SP 可使p-NF-κB p65 和Keap1 蛋白表達(dá)水平降低(P＜0.05)，使Nrf2 蛋白表達(dá)水平升高(P＜0.05)，且高劑量SP 組肺組織p-NF-κB p65 和Keap1 蛋白表達(dá)水平降低，Nrf2 蛋白表達(dá)水平升高更明顯(P＜0.05，圖4、圖5)。

圖4 SP 對(duì)急性肺損傷大鼠NF-κB p65、p-NF-κB p65 蛋白表達(dá)的影響[aP＜0.05,vs Control group;bP＜0.05,vs LPS group;cP＜0.05, vs SP (300 mg/kg)]Fig.4 Effect of SP on the expression of NF-κB p65,p-NF-κB p65 proteins in LPS-induced mice (n=3) (aP＜0.05,vs control group;bP＜0.05,vs LPS group;cP＜0.05, vs SP [300 mg/kg])

圖5 SP 對(duì)急性肺損傷大鼠肺組織Keap1、Nrf2 蛋白表達(dá)的影響[aP＜0.05,vs Control group;bP＜0.05,vs LPS group;cP＜0.05, vs SP (300 mg/kg)]Fig.5 Effect of SP on the expression of Keap1,Nrf2 proteins in LPS-induced mice (n=3) (aP＜0.05,vs control group;bP＜0.05,vs LPS group;cP＜0.05, vs SP [300 mg/kg])

討論

ALI 是一種嚴(yán)重的肺實(shí)質(zhì)疾病，表現(xiàn)為進(jìn)行性的呼吸困難，逐漸進(jìn)展為呼吸窘迫綜合征，導(dǎo)致嚴(yán)重的臨床并發(fā)癥及高死亡率[12]。引起ALI 的病因復(fù)雜，包括感染因素和非感染因素，臨床以感染因素為主。LPS 是革蘭陰性菌細(xì)胞外膜的主要成分，可刺激肺部炎性細(xì)胞募集與激活，導(dǎo)致系統(tǒng)性的炎癥反應(yīng)和免疫激活，產(chǎn)生組織損傷[13]。LPS 誘導(dǎo)的ALI 模型與人類ALI 病理過程的相似[14-15]。本實(shí)驗(yàn)采用氣管內(nèi)滴注LPS 方式建立ALI 模型，模型組大鼠肺組織病理變化表現(xiàn)為肺泡出血、肺泡組織破壞、肺泡間隔增厚、炎細(xì)胞浸潤，可見模型建立成功，并且通過低氧血癥、肺組織W/D 升高、炎性因子產(chǎn)生增加等進(jìn)一步證實(shí)。此外，在不同劑量的SP 干預(yù)ALI 大鼠后，SP 組大鼠肺組織病理損傷明顯減輕、W/D 降低、低氧和嚴(yán)重的炎癥狀態(tài)明顯改善，顯示出SP 對(duì)LPS 誘導(dǎo)的ALI 大鼠的保護(hù)作用，并呈一定的劑量依賴性。

SCFAs 主要由在小腸中不被消化和吸收的碳水化合物的糖酵解產(chǎn)生，主要產(chǎn)物為醋酸鹽、丙酸鹽和丁酸鹽。丙酸鹽在調(diào)節(jié)氣道和肺部炎癥方面起著關(guān)鍵作用[16]。ALI 的本質(zhì)是炎癥反應(yīng)，其中，NF-κB 信號(hào)通路具有重要作用[17]。研究發(fā)現(xiàn)，LPS 可以激活NF-κB 信號(hào)通路，促進(jìn)TNF-α、IL-6 等炎癥因子的產(chǎn)生和釋放[18]。NF-κB 蛋白通常以同源或異源復(fù)合物的形式存在，在靜息狀態(tài)下，細(xì)胞質(zhì)中的p50/p65 與其抑制物IκB 結(jié)合，處于非活性的狀態(tài)，而當(dāng)細(xì)胞受到外源性信號(hào)刺激后，IκBα 被磷酸化，發(fā)生降解，釋放出p50/p65，進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，誘導(dǎo)靶基因的表達(dá)[19]。在本研究中，LPS增加了p65磷酸化和p65NF-κB核易位，這些均被SP 所抑制，同時(shí)我們發(fā)現(xiàn)暴露于LPS 的大鼠血清和肺泡灌洗液中促炎因子TNF-α、IL-6 的表達(dá)增加，抗炎因子IL-10 呈應(yīng)激性增加，然而SP 給藥降低了這些促炎因子的水平，提高了抗炎因子的水平。由此推測，SP 可能通過抑制NF-κB 信號(hào)通路而發(fā)揮抑制炎癥的作用。

氧化應(yīng)激是ALI 發(fā)展的重要因素，目前已有多項(xiàng)研究證明具有抗氧化應(yīng)激作用的藥物對(duì)ALI 具有保護(hù)作用[20-22]。Nrf2 在維持抗炎和抗氧化中起關(guān)鍵作用，一旦被激活，Nrf2 可以從Keap-1中釋放，然后轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核，與抗氧化反應(yīng)元件(antioxidant reaction element，ARE)結(jié)合，調(diào)節(jié)下游靶基因NQ01、HO-1 和 GCLC 等的表達(dá)轉(zhuǎn)錄，從而發(fā)揮抗炎、抗氧化作用[23]。研究顯示，Nrf2可以抑制NF-κB，從而發(fā)揮抗炎作用[24]。本研究中，SP 給藥后，Keap1 表達(dá)降低，而Nrf2 的表達(dá)升高，提示Nrf2/Keap1 信號(hào)通路明顯被激活，并且肺組織中氧化指標(biāo)MDA 濃度降低、抗氧化指標(biāo)SOD 濃度升高也證明了這一結(jié)果。由此推測，SP 可能通過抑制Nrf2/Keap1 信號(hào)通路從而發(fā)揮抗氧化和抗炎作用。

綜上所述，本研究表明SP 可以減輕LPS 誘導(dǎo)的ALI，并且這種保護(hù)作用呈一定的劑量依賴性。SP 可以減少炎癥和氧化應(yīng)激損傷，其機(jī)制可能是調(diào)節(jié)Keap1/Nrf2 信號(hào)通路，抑制NF-κB，減輕肺的炎癥和氧化應(yīng)激，從而改善ALI。但后續(xù)還需進(jìn)一步驗(yàn)證、完善SP 改善ALI 的最佳劑量和其他可能參與的通路，為SP 治療ALI 提供更全面的理論依據(jù)。