二倍體馬鈴薯中SCFSLF復(fù)合體的組分分析

高蒙 李富婷 魏湛林 張賽行 白如仟 尚軼 馬玲

（1.云南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，昆明 650500；2.云南師范大學(xué)能源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，昆明 650500）

植物繁殖方式的差異，對維持植物遺傳多樣性有著不同的影響。自交不親和（self-incompatibility，SI）是一種廣泛存在的遺傳機(jī)制，可以有效地阻止自交促進(jìn)雜交，對于維持物種基因型多樣性有著重要作用［1］。自交不親和表現(xiàn)為在受精過程中，雌蕊排斥自身或近緣植物花粉，但接受非自身花粉。植物自交不親和是由雌雄蕊之間的相互作用控制的，根據(jù)雌雄識別部位的世代類型不同，植物自交不親和性可分為配子體型自交不親和（gametophytic self-incompatibility，GSI）和孢子體型自交不親和（sporophytic self-incompatibility，SSI）［2］。 在 GSI植物中，雌雄蕊的識別部位是花粉管，花粉管作為配子體世代，故而得名。而SSI雌雄蕊在柱頭識別，柱頭是孢子體器官，因此被命名為孢子體型自交不親和。GSI 和SSI均由一個具有高度多態(tài)性的基因座控制，被稱為S-基因座（S-locus）［3］。S-基因座中至少包含兩類獨立的基因：一類編碼雌蕊特異性基因，另一類編碼雄蕊特異性基因［4］。在GSI的受精過程中，只有攜帶與雌蕊完全不同的S基因型的花粉才能萌發(fā)［5］，如果單倍體花粉的S單倍型與二倍體雌蕊中的兩個S單倍型之一相匹配，花粉也將被排斥導(dǎo)致受精失敗［3］。車前科（Plantaginaceae）、茄科（Solanaceae）和薔薇科（Rosaceae）等物種的自交不親和均屬于配子體型自交不親和。罌粟科的虞美人（Papaver rhoeas）也屬于配子體型自交不親和，但其分子機(jī)制是不同的［6］。

在GSI植物中，S基因座上的雌蕊特異性因子編碼了一類核糖核酸酶，被稱之為S核酸酶（S-RNase），而雄蕊特異性因子編碼了一類F-box蛋白，被稱為SLF（S-Locus F-box）或SFB（S-haplotype-specific F-box）［7］。授粉后，當(dāng)花粉管延伸至花柱中，花柱中的S-RNase進(jìn)入到花粉管［8-9］。S-RNase具有細(xì)胞毒性作用，能夠降解花粉管中的rRNA，并影響花粉管的細(xì)胞骨架［10］，最終造成花粉管細(xì)胞死亡，導(dǎo)致受精失?。?1-12］。而SLFs能夠識別并降解非自身的S-RNase，解除其細(xì)胞毒性作用，從而使得雜交可以親和［13］。SLF是一類F-box蛋白，包含有一個 F-box基序，能形成SCFSLF復(fù)合體，行使E3泛素連接酶的作用，通過26S蛋白酶體來實現(xiàn)對S-RNase的降解［13］。

SCF復(fù)合體是多亞基E3泛素連接酶中的一類，保守的SCF復(fù)合體由F-box、Skp1、Cullin1及Rbx1組成（圖1）。其中Cullin1分子量較大，作為支架蛋白，其N端和C端分別與Skp1和Rbx1結(jié)合［14-15］，Skp1通常作為連接F-box和Cullin1的接頭亞基，植物中存在多種Skp類蛋白Skp1-Like［16］，Rbx1則介導(dǎo)E2與E3的連接，其結(jié)構(gòu)較為保守。F-box蛋白家族數(shù)量龐大，但均具有一個由50 個氨基酸左右形成的結(jié)構(gòu)域，因這個結(jié)構(gòu)域最早在周期素 F 中發(fā)現(xiàn)，故而被命名為F-box結(jié)構(gòu)域，在SCF復(fù)合體中決定了底物識別的特異性［17］。已有研究表明，在GSI植物的花粉管中，SLFs蛋白可能通過其F-box結(jié)構(gòu)域與Skp1類蛋白結(jié)合，再經(jīng)由Skp1蛋白連接在Cullin1上組成了SCFSLF復(fù)合體，而另外的結(jié)構(gòu)域則能夠與特定類型的S-RNase蛋白相互作用，進(jìn)而介導(dǎo)了被識別的S-RNase的泛素化降解［18-19］。在茄科作物中，S基因座內(nèi)包含有不同數(shù)量的SLF基因，例如在矮牽牛（Petunia inflata）中包含有16-18種SLF基因，與Skp1類蛋白PiSSK1、花粉特異性的Cullin1（PiCUL1-P）和保守的Rbx1（PiRbx1）等亞基共同組成 SCF復(fù)合體［20-21］。SLF蛋白能夠有效識別并降解非自身的S-RNase蛋白，卻不能降解自身的S-RNase［22-23］，因此茄科作物普遍存在自交不親和而雜交親和的現(xiàn)象。

圖1 典型 SCF復(fù)合體模式圖Fig.1 Typical structural pattern of SCF complex

二倍體馬鈴薯是典型的GSI植物，存在嚴(yán)重的自交不親和以及較為普遍的雜交不親和現(xiàn)象。隨著二倍體馬鈴薯育種計劃的推廣，針對其自交不親和以及雜交不親和的研究就顯得尤為重要，為了研究二倍體馬鈴薯自交不親和及部分雜交不親和的調(diào)控機(jī)制，首先需要對二倍體馬鈴薯花粉管中的SCFSLF復(fù)合體進(jìn)行組分分析。為了鑒定馬鈴薯中的SCFSLF復(fù)合體，采用了同源比對獲得了候選基因的信息，進(jìn)一步驗證了各組分蛋白間的互作，初步獲得了馬鈴薯花粉管中SCFSLF復(fù)合體的組分信息，為二倍體馬鈴薯雜交育種工作提供關(guān)鍵信息。

1 材料與方法

1.1 材料

植物材料為種植于云南昆明的二倍體馬鈴薯E172。獲取植物材料花粉、雄蕊、雌蕊、花瓣、葉子、萼片、塊莖于液氮速凍后，保存在-80℃超低溫冰箱。

1.2 方法

1.2.1 同源比對 為了確定馬鈴薯中的SCFSLF復(fù)合體的組成成分，采用同源比對的方法，在Phytozome網(wǎng)站上的馬鈴薯DM v6.1的基因組數(shù)據(jù)中利用同屬于茄科的矮牽牛（Petunia inflata）中的Skp1的類蛋白 PiSSK1（JF429902.1）、PiCUL1-P（KF551593.1）、PiRBX1（DQ250021.1）序列進(jìn)行 Blast分析［4］。

1.2.2 生物信息學(xué)及進(jìn)化分析 首先從 NCBI數(shù)據(jù)庫網(wǎng)站（https://www.ncbi.nlm.nih.gov）下載了膨大矮牽牛（Petunia inflata）、雜交矮牽牛（Petunia hybrida）、金魚草（Antirrhinum hispamicum）、梨（Pyrus bretschneideri）、蘋果（Malus domestica）、百合（Lilium longiflorum）、橘（Citrus reticulata Blanco）、李（Prunus tenella）這8個物種中已克隆到的SCFSLF復(fù)合體成分對應(yīng)蛋白序列［5，13，19，24-30］。然后利用 ClustalW軟件進(jìn)行蛋白序列的比對，之后用ESPript 3.0和MEGA軟件進(jìn)行蛋白序列作圖及進(jìn)化樹構(gòu)建。

1.2.3 總RNA 的提取和第一鏈 cDNA合成 參照天根生化科技有限公司的植物總 RNA 提取試劑盒說明書提取馬鈴薯花粉、雄蕊、雌蕊、花瓣、葉子、萼片和塊莖各部位的總 RNA。再利用TaKaRa公司的PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser 試劑盒對樣品RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，合成相應(yīng)的cDNA片段。

1.2.4 qRT-PCR 表達(dá)差異分析 利用同源比對所得同源基因序列設(shè)計特異性熒光定量引物見表1，以馬鈴薯的EF1α基因為內(nèi)參基因。反轉(zhuǎn)錄后各部位的cDNA 稀釋 5倍后作為模板，反應(yīng)體系為 20 μL，在STEPONE PL實時熒光定量qPCR儀上進(jìn)行熒光定量。

表1 馬鈴薯SSK1與Cullin1熒光定量引物Table 1 Fluorescent quantitative primers for SSK1 and Cullin1 in potato（S.tuberosum）

1.2.5 酵母雙雜交蛋白互作實驗 用同源重組的方法（南京諾唯贊無縫克隆試劑盒）構(gòu)建SLF-pGBKT7載體和SSK1- pGADT7，并通過PCR菌檢篩選出陽性菌液送測序，序列比對正確的菌液用天根質(zhì)粒小提試劑盒提取重組質(zhì)粒。經(jīng)毒性檢測和自激活驗證后將SLF-BD和SSK1-AD質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化進(jìn)菌株感受態(tài)中，轉(zhuǎn)化后的酵母菌液涂布于缺陷型培養(yǎng)基上二缺（SD/-Trp/-Leu）和三缺（SD/-Trp/-Leu/-His）后倒置于30℃恒溫箱中培養(yǎng)3-5 d后觀察結(jié)果，對三缺培養(yǎng)基中的菌斑鑒定后，于四缺（SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade）培養(yǎng)基中進(jìn)行點板驗證。正如文中圖示酵母結(jié)果獨立地重復(fù)實驗至少 3 次，結(jié)果一致。酵母菌株為 Y2H Gold，獵物載體為pGADT7，誘餌載體為 pGBKT7，陽性對照為 pGBKT7-53和 pGADT7-T，陰性對照為pGBKT7-Lam和 pGADT7-T。

1.2.6 煙草瞬時表達(dá)實驗 首先將Soltu.DM.11G004330（SSK1）的基因編碼區(qū)域去除終止密碼子后克隆到pCAMBIA1301-nLUC中（nLUC-4330），同時構(gòu)建SLF的pCAMBIA1301-cLUC-SLF載體（cLUC-SLF）。然后將每個重組質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌GV3101菌株中，轉(zhuǎn)化后的菌株在28℃含卡那霉素（50 mg/L）和利福平（50 mg/L）的LB培養(yǎng)基中生長。培養(yǎng)至菌液OD600為0.8，然后3 000 r/min離心5 min，再懸浮于1 mol/L MgCl2、0.1 mol/L乙酰丁香酮和 0.5 mol/L MES的滲透緩沖液中，使得最終OD600值為0.6。緩沖液孵化菌株2-4 h后可進(jìn)行共注射，用無針注射器注射cLUC-SLF和nLUC-4330的菌株混液，并使之滲透到完全展開的4周齡的煙草葉片中。滲透后，植株在黑暗下生長8 h，36-72 h后觀察熒光結(jié)果。利用Tanon凝膠成像系統(tǒng)觀察煙草中蛋白互作的結(jié)果，需要在葉片注射的位置上涂抹螢火蟲熒光素酶底物，在黑暗處理5 min后，觀察捕獲的化學(xué)發(fā)光信號。

2 結(jié)果

2.1 SCFSLF復(fù)合體組分的同源比對

如表2所示，二倍體馬鈴薯DM中，PiRBX1在DM中的同源基因只有1個，是位于6號染色體上的Soltu.DM.06G022320，且Rbx1相對保守，在SCF復(fù)合體的研究中主要集中在Skp1和Cullin1上。而PiCUL1-P和PiSSK1的同源基因分別有10個和6個。PiSSK1的同源基因有4個分布在11號染色體上，1號和10號染色體上也各有1個。PiCUL1-P的同源基因在1號和9號染色體上分別有4個，6號染色體上2個。

表2 二倍體馬鈴薯DM中SCFSLF復(fù)合體組分的同源比對Table 2 Homologous comparison of SCFSLF complex components in diploid potato DM

2.2 同源基因的系統(tǒng)進(jìn)化、蛋白序列與表達(dá)量分析

本研究對同源蛋白與植物中已克隆的SCFSLF復(fù)合體對應(yīng)成分的蛋白組分進(jìn)行了序列分析，如圖2-A所示，植物中已克隆的SSK1蛋白位于一個大分支內(nèi)，在這個分支內(nèi)，薔薇科的SSK1蛋白與茄科中的SSK1蛋白分別形成了兩個獨立小分支，而馬鈴薯中的Soltu.DM.11G004500和Soltu.DM.11G004300位于薔薇科的SSK1小分支內(nèi)，Soltu.DM.11G004330（縮寫為11G004330）位于茄科的小分支。如圖2-B所示，薔薇科分支與茄科分支的F-box binding site基本類似，但是兩個分支在cullin binding site出現(xiàn)了明顯差異，這可能也暗示了cullin蛋白在兩個分支內(nèi)也會出現(xiàn)差異。值得注意的是位于茄科分支的11G004330蛋白，這個蛋白極有可能參與了馬鈴薯中SCFSLF復(fù)合體的形成。為驗證11G004330蛋白是否參與馬鈴薯中SCFSLF復(fù)合體的形成，我們檢測了11G004330在馬鈴薯不同部位內(nèi)的表達(dá)水平。如圖2-C所示，11G004330基因在花粉中特異性表達(dá)，這也符合在矮牽牛中發(fā)現(xiàn)的SCFSLF復(fù)合體中SSK1組分只在花粉中特異性表達(dá)的事實。因此馬鈴薯中Soltu.DM.11G004330基因可能就是SCFSLF復(fù)合體中的SSK1組分。

圖2 SSK1蛋白序列與表達(dá)量分析Fig.2 SSK1 protein sequence and expression analysis

類似地，我們對SCFSLF復(fù)合體中的Cullin1組分進(jìn)行了進(jìn)化樹、蛋白序列、表達(dá)量的分析。如圖3-A所示，Cullin1蛋白在最小分支處，確實出現(xiàn)了茄科和薔薇科的分離，而Soltu.DM.06G001040與矮牽牛中的Cullin1蛋白同處一個小分支，定量結(jié)果（圖3-B）顯示06G001040在馬鈴薯花粉中特異性表達(dá)。此外，對馬鈴薯中的Cullin1蛋白進(jìn)行多序列比對后發(fā)現(xiàn)該基因具有高度保守性（圖4），因此馬鈴薯中Soltu.DM.06G001040基因可能就是SCFSLF復(fù)合體中的Cullin1組分。

圖3 Cullin1蛋白進(jìn)化與表達(dá)量分析Fig.3 Cullin1 protein evolution and expression analysis

圖4 馬鈴薯Cullin1蛋白的多序列比對Fig.4 Multiple sequence alignment of Cullin1 protein in potato

2.3 馬鈴薯SSK1蛋白與SLF蛋白有互作關(guān)系

根據(jù)現(xiàn)有研究，在矮牽牛與金魚草中，SSK1（SLF-interacting Skp1-like1）蛋白是SCFSLF復(fù)合體與SLFs蛋白發(fā)生反應(yīng)的接頭，為驗證與PiSSK1、PhSSK1和AhSSK1同處于一個分支上的Soltu.DM.11G004330是否確實是馬鈴薯中的SSK1蛋白，并在馬鈴薯SCFSLF復(fù)合體是否發(fā)揮類似作用，我們利用酵母雙雜交和熒光素酶互補(bǔ)實驗驗證了SLF蛋白與Soltu.DM.11G004330蛋白之間是否存在直接互作。如圖5所示，我們選取了馬鈴薯中的一種SLF蛋白用于酵母雙雜實驗。酵母雙雜交結(jié)果和熒光素酶互補(bǔ)實驗都證實了Soltu.DM.11G004330與SLF存在直接互作。這說明我們前期的分析結(jié)果是可靠的，Soltu.DM.11G004330蛋白確實可能是SCFSLF復(fù)合體中的接頭亞基，與SLF蛋白直接互作。

圖5 Soltu.DM.11G004330蛋白與SLF蛋白的互作分析Fig.5 Interaction analysis of Soltu.DM.11G004330 and SLF

3 討論

茄科、車前科和薔薇科中，花粉管中的SCFSLF復(fù)合體是雌雄識別的分子基礎(chǔ)，借助于SLF這一亞基，SCFSLF能夠有效識別并降解非自身的S-RNase蛋白，但不能識別自身的S-RNase，從而形成了自交不親和而雜交親和的繁殖方式［22-23］。但是二倍體馬鈴薯中存在較為普遍的雜交不親和現(xiàn)象，已有研究結(jié)果表明S-RNase在茄科植物的雜交不親和中也起著一定作用，但具體作用未知，SCFSLF在二倍體馬鈴薯雜交不親和中是否起作用也是未知的。為了深入研究二倍體馬鈴薯中因雌雄識別所造成的親和與否的分子機(jī)制，首先需要準(zhǔn)確鑒定二倍體馬鈴薯中的SCFSLF復(fù)合體的組成成分，在此基礎(chǔ)上才能進(jìn)一步研究SCFSLF復(fù)合體在雌雄識別中的具體作用機(jī)制，為育種實踐中打破自交不親和及雜交不親和提供理論指導(dǎo)。

在GSI植物中，例如矮牽牛、百日草、蘋果、梨、砂糖橘及扁竹桃等，SCFSLF的組分信息已有報道，為了快速獲得二倍體馬鈴薯中的SCFSLF的組成成分，我們首先采用了同源比對的方式，初步確定了各亞基在馬鈴薯中的同源基因信息。雖然同源比對是尋找具有相似功能的靶標(biāo)基因的一種有效方法，能夠迅速確定候選基因的范圍，但是同源比對通常會獲得大量的同源基因信息，一般情況下很難僅通過同源比對就獲得準(zhǔn)確的候選基因，還需要進(jìn)一步驗證。因此本研究在同源比對的基礎(chǔ)上，又結(jié)合了蛋白序列保守性及進(jìn)化樹分析，初步確定了候選基因，并借助于qRT-PCR確定了候選基因的表達(dá)方式，利用酵母雙雜交和熒光素酶互補(bǔ)實驗初步驗證了亞基間的互作。我們發(fā)現(xiàn)在二倍體馬鈴薯中，SCFSLF中的SSK1，Cullin1和SLF均只在花粉中表達(dá)，這同前人的發(fā)現(xiàn)一致，這也暗示植物體中的SCFSLF可能是有性生殖后才開始形成的，且只在雌雄識別中起作用，SCFSLF的進(jìn)化對于植物的繁殖過程有著重要意義。本研究只是初步確定了二倍體馬鈴薯中的SCFSLF的組分，至于這些亞基所組成的復(fù)合體是否真的行使雌雄識別功能還需要進(jìn)一步驗證，但本研究為進(jìn)一步揭示SCFSLF復(fù)合體在二倍體馬鈴薯中的功能研究奠定了基礎(chǔ)。下一步我們將開展該復(fù)合體在雌雄識別中的作用研究，為最終解決二倍體馬鈴薯育種中面臨的自交不親和以及雜交不親和提供分子基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本研究從進(jìn)化、蛋白序列和表達(dá)量方面對馬鈴薯SCFSLF復(fù)合體組分進(jìn)行研究分析，馬鈴薯花粉管中的SCFSLF復(fù)合體可能是由Soltu.DM.06G001040，Soltu.DM.11G004330，Soltu.DM.06G022320以及 SLF蛋白組成的。其中Soltu.DM.06G001040行使Cullin1蛋白的功能，Soltu.DM.11G004330作為SSK1，起著連接Cullin1和SLF蛋白的作用，而Soltu.DM.06G022320是其中的RBX1組分。