單葉薔薇bZIP轉錄因子家族鑒定與表達分析

孫彥琳，于 超，羅 樂，潘會堂，張啟翔

(1花卉種質創(chuàng)新與分子育種北京市重點實驗室，北京 100083；2國家花卉工程技術研究中心，北京 100083；3城鄉(xiāng)生態(tài)環(huán)境北京實驗室，北京 100083；4園林環(huán)境教育部工程研究中心，北京 100083；5林木花卉遺傳育種教育部重點實驗室，北京 100083；6 北京林業(yè)大學 園林學院，北京 100083)

堿性亮氨酸拉鏈(basic leucine zipper,bZIP)轉錄因子家族，是真核生物中最大、種類最多的家族之一。其特征在于具有高度保守的bZIP結構域，其長度為60～80個氨基酸，由兩部分組成：基本的DNA結合區(qū)域和亮氨酸拉鏈[1]。目前，bZIP轉錄因子家族成員已在許多植物基因組中被鑒定，擬南芥(Arabidopsisthaliana)中有78個[1]，水稻(Oryzasativa)中有89個[2]，大豆(Glycinemax)中有131個[3]，玉米(Zeamays)中有170個[4]，蘋果(Malusdomestica)中有114個[5]，山茶中有61個[6]。研究發(fā)現，bZIP轉錄因子能夠調控植物生長發(fā)育，如葉片[7]、花芽[8-9]和種子的發(fā)育[10-11]。此外，bZIP轉錄因子能夠在生物和非生物脅迫響應中發(fā)揮重要作用[12]，包括干旱、寒冷、高溫、鹽脅迫以及調控ABA信號傳導和病原體防御[5]。Liao等[3]發(fā)現,大豆中GmbZIP44、GmbZIP62和GmbZIP78基因是ABA信號的負調節(jié)器，在抗鹽和耐凍性方面發(fā)揮作用。近年來，有學者對蘿卜(Raphanussativus)[13]、柳枝稷(Panicumvirgatum)[14]和紅花(Carthamustinctorius)[15]等植物中bZIP轉錄因子的脅迫響應機制進行了研究。

單葉薔薇(Rosapersica)是薔薇科薔薇屬單葉薔薇亞屬植物，其葉為單葉，花瓣基部有紫紅色斑點(多數薔薇屬植物為奇數羽狀復葉且無花斑)，曾被分成一個單獨的屬——單葉薔薇屬(Hulthemia)[16-17]。經大量實地調研證實，該種與《中國植物志》記載的小檗葉薔薇(R.berberifolia)為同一種；且全球公認的邱園索引(Index Kewensis)通常將小檗葉薔薇作為單葉薔薇的異名處理。單葉薔薇在我國僅分布于新疆[17]，新疆生境條件較為惡劣，當地花卉大多具有抗旱、抗寒、抗風、耐鹽堿、耐瘠薄等特點[18]。馮久瑩等[19]對14種新疆野生薔薇屬植物進行調查，發(fā)現單葉薔薇耐熱性最好?；菘鄣萚18]發(fā)現，單葉薔薇對干旱、寒冷、貧瘠有較強的抗性。此外，惠俊愛等[20]還發(fā)現，單葉薔薇有典型的旱生結構，從解剖學及細胞學角度解析了單葉薔薇的抗旱機制。本研究對單葉薔薇bZIP轉錄因子家族進行全基因組水平鑒定，并對其進行系統(tǒng)進化關系、結構特征、保守基序和順式作用元件等生物信息學分析，為探究bZIP轉錄因子家族在單葉薔薇生長發(fā)育過程中的作用機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 數據來源與bZIP轉錄因子家族鑒定

單葉薔薇的基因組測序數據、基因轉錄序列、CDS序列、蛋白質序列及其注釋GFF文件來源于本課題組前期研究結果(未公開)。從蛋白質家族數據庫Pfam(http://pfam.sanger.ac.uk/)[21]中下載bZIP域(PF00170)的隱馬爾可夫模型(HMM)配置文件，并通過HMMER軟件搜索蛋白序列(E值<1×10-5)，利用NCBI CDD(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/)在線工具確認bZIP域的完整性。利用DNAMAN軟件進行bZIP轉錄因子家族的理化性質分析，包括蛋白質長度、分子質量、等電點。通過在線工具WoLF PSORT (http://psort.hgc.jp/)[22]進行亞細胞定位分析。

1.2 單葉薔薇bZIP轉錄因子家族系統(tǒng)發(fā)育分析

根據Dr?ge-Laser等[1]對擬南芥bZIP轉錄因子家族的鑒定，從擬南芥數據庫網站(https://www.arabidopsis.org)下載78條擬南芥bZIP蛋白序列。通過MUSCLE[23]軟件對單葉薔薇和擬南芥bZIP蛋白進行多序列比對，并用IQ-TREE軟件[24]構建進化樹(VT+F+R7，1 000自展值)，用iTOL在線軟件[25](https://itol.embl.de)進行進化樹展示。

1.3 單葉薔薇bZIP轉錄因子家族保守序列、基因結構和啟動子分析

利用MEME軟件[26]分析單葉薔薇bZIP蛋白保守基序，設置基序長度為6～200個氨基酸殘基，基序最大發(fā)現數目為10個，其他參數為默認值。通過NCBI CD-Search在線工具對預測的保守基序進行功能注釋(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/bwrpsb/bwrpsb.cgi)。通過單葉薔薇基因組注釋文件獲得基因的結構信息，用TBtools軟件[27]對結果進行可視化處理，繪制保守基序分布和基因結構圖。從單葉薔薇注釋文件中提取bZIP轉錄因子家族成員起始密碼子上游2 000 bp序列，將序列提交到PlantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)[28]數據庫分析啟動子的順式作用元件。利用Excel繪制順式作用元件數目統(tǒng)計圖。

1.4 單葉薔薇bZIP轉錄因子家族基因定位與共線性分析

使用BLASTp和MCScanX軟件[29]分析基因家族中的重復事件，通過單葉薔薇基因組GFF文件獲得每個基因的染色體位置信息。利用TBtools軟件[27]對單葉薔薇bZIPs的染色體位置及染色體重復信息進行可視化。

1.5 單葉薔薇bZIP轉錄因子家族表達分析

2020年5月，于新疆維吾爾族自治區(qū)呼圖壁縣采集單葉薔薇根、莖、葉片、果實和花5種器官，對其進行RNA-seq文庫的構建，并利用PacBio測序平臺對構建的cDNA文庫進行測序(由武漢菲沙基因公司負責完成),測序獲得的Raw date尚未公布。以RNA-seq數據為基礎，以lb(RPKM+1)作為表達量值，通過TBtools軟件[27]繪制熱圖，分析單葉薔薇bZIPs在不同器官中的表達譜。另外，根據差異顯著性分析結果，分析單葉薔薇12個bZIPs在5種器官中的特異性表達情況。

2 結果與分析

2.1 單葉薔薇bZIP轉錄因子家族的鑒定與特征分析

單葉薔薇bZIP轉錄因子家族基本信息見表1。

表1 單葉薔薇bZIP轉錄因子家族基本信息Table 1 Basic information of bZIP transcription factor family in R. persica

通過使用HMMER分析以及NCBI CDD數據庫驗證，共鑒定了50個bZIP轉錄因子家族成員(表1)。bZIP蛋白理化特性分析結果表明，蛋白質長度為149～700 個氨基酸，分子質量為17.14～75.47 ku，等電點為4.42～10.72。WoLF PSORT預測結果顯示，除Rbe021699定位在內質網膜上外，其余49個bZIP蛋白皆定位在細胞核。

2.2 單葉薔薇bZIP轉錄因子家族系統(tǒng)發(fā)育分析

為了探索bZIP轉錄因子家族的進化關系和分類，使用來自單葉薔薇和擬南芥的bZIP成員氨基酸序列構建系統(tǒng)發(fā)育樹，結果見圖1。根據之前在擬南芥中的研究，將單葉薔薇bZIP蛋白分為12亞族(圖1)。在Dr?ge-Laser等[1]研究的進化樹中，ATbZIP72單獨組成M亞族，但是在單葉薔薇與擬南芥共同構建的進化樹中，ATbZIP72被分入E亞族中。不同亞族單葉薔薇的基因數目不同，最大的S亞族和A亞族具有9個成員。J亞族不含單葉薔薇bZIP蛋白，推測這些蛋白質在單葉薔薇進化過程中丟失。

2.3 單葉薔薇bZIP轉錄因子家族保守序列、基因結構與啟動子分析

單葉薔薇bZIP轉錄因子家族的基序分布和基因結構分析結果見圖2。在10個保守基序中(圖2-A)，所有的單葉薔薇bZIP蛋白都包含基序1。同一亞族中的bZIP蛋白序列具有相似的保守基序構成，例如，基序5和9只存在于A亞族，基序8只存在于F亞族，基序2和3只存在于D亞族,且基序2屬于DOG1結構域。bZIP轉錄因子具有不同的功能，這些基序可能發(fā)揮特定的功能。

為了探索單葉薔薇bZIP轉錄因子家族的基因結構，分析每個成員的內含子/外顯子結構，結果(圖2-B)表明，同一亞族的成員具有相似的基因結構，而不同亞族間結構差異較大。單葉薔薇bZIPs包含1～15個外顯子，在S亞族的9個成員中，有7個沒有內含子；Ⅰ亞族均含有4個外顯子。同一亞族中bZIP成員的保守基序組成和基因結構相似，支持了進化樹和亞族分類的可靠性。

為了進一步研究單葉薔薇bZIP轉錄因子家族基因在非生物脅迫響應中的潛在機制，對其啟動子進行順式作用元件預測。如圖3所示，分析了5個與非生物脅迫有關的順式作用元件，分別是ABA響應元件(ABRE)、干旱誘導響應元件(MBS)、低溫響應元件(LTR)、防御和應激反應元件(TC-rich repeats)及創(chuàng)傷響應元件(WUN-motif)[18]。除Rbe014240和Rbe021919不含此5個元件外，其余bZIPs的啟動子含有1～15個與非生物脅迫有關的順式作用元件，其中Rbe006639最多(15個)，而Rbe002638、Rbe004377、Rbe020114、Rbe025658僅含有1個。有38個單葉薔薇bZIPs(76%)的啟動子含有ABRE元件，表明單葉薔薇bZIP可能對ABA有較強響應；25個單葉薔薇bZIPs(50%)的啟動子含有LTR元件和MBS響應元件,24個(48%)具有WUN-motif響應元件，17個單葉薔薇bZIPs(34%)的啟動子具有TC-rich repeats響應元件,推測單葉薔薇bZIP轉錄因子家族基因能夠響應不同非生物脅迫。

2.4 單葉薔薇bZIP轉錄因子家族基因的染色體定位和共線性分析

染色體定位結果(圖4)顯示，除Rbe029759未被錨定在染色體上外,其余49個單葉薔薇bZIPs在7條染色體上分布不均，染色體上的bZIPs數目與染色體大小無關，最大的5號染色體包含6個基因，6號染色體包含14個bZIPs。使用BLASTp和MCScanX分析了轉錄因子家族基因中的重復事件，僅發(fā)現一對串聯(lián)重復事件(Rbe002635和Rbe002636)。此外，共鑒定出7個基因對(圖5)，這些基因對屬于片段重復事件，發(fā)生在7條染色體中的6條上，其中有3對屬于S亞族，其他4對分屬A、C、I、E亞族。

2.5 單葉薔薇bZIP轉錄因子家族基因的表達分析

通過單葉薔薇的RNA-seq數據,分析單葉薔薇bZIP轉錄因子家族基因在根、莖、葉、花、果實中的表達譜(圖6)。由圖 6可知，在5個器官中未檢測到Rbe018776的表達，D亞族和E亞族成員整體表達量較低，Rbe010493、Rbe014412、Rbe006220在5個器官中表達量都較高。根據差異顯著性分析的結果(圖7)，某些基因在特定器官中高度表達，Rbe013649在花中特異性表達，Rbe006639和Rbe028637在根中特異性表達，Rbe004215、Rbe028400、Rbe002636、Rbe002635在果實中特異性表達，Rbe011331在葉片中特異性表達。

3 討 論

隨著高通量測序技術的快速發(fā)展，許多物種完成了全基因組測序，為功能基因的篩選奠定了基礎。研究[12,30]表明，bZIP轉錄因子家族基因參與植物生長發(fā)育的多種生物學和生理過程，以及對生物/非生物脅迫的響應。通過對單葉薔薇bZIP轉錄因子家族進行分析，可為研究該家族在單葉薔薇生長發(fā)育中的作用提供依據。

本研究共鑒定出50個單葉薔薇bZIP轉錄因子，與草莓(Fragariavesca,50個)[31]、桃(Prunuspersica，50個)[32]的bZIP轉錄因子家族數量相似，但明顯少于蘋果(Malusdomestica，114)的數量[5]，可能是由于蘋果基因組發(fā)生了全基因組復制事件而導致了bZIP轉錄因子家族的劇烈擴增[33]。將單葉薔薇bZIPs和已知的擬南芥bZIPs共同構建系統(tǒng)進化樹，并按前人研究[1]分為12亞族。在前人構建的擬南芥bZIP轉錄因子家族進化樹中，ATbZIP72單獨組成M亞族，但是在本進化樹中ATbZIP72被分入E亞族中，可能是建樹模型不同所致。

同一亞族中bZIP成員的基因結構和蛋白保守基序組成相似，支持了進化樹和亞族分類的可靠性。在50個單葉薔薇bZIPs中，有9個(18%)成員沒有內含子，與草莓(20%)[31]、蘋果(20%)[34]的比例相似。此外，bZIP轉錄因子具有不同的功能，不同的基序可能發(fā)揮特定的功能。對預測的保守基序進行分析,結果顯示基序2屬于DOG1結構域，與種子的休眠調控有關[35]，其他基序沒有具體的注釋信息，功能有待闡明。

基因的串聯(lián)重復和片段重復對于基因家族基因的產生具有重要的作用。單葉薔薇bZIP轉錄因子家族重復基因對中的2個基因均分布于一個亞族中，且具有相似的外顯子數量和長度，表明片段或串聯(lián)重復擴大了bZIP 轉錄因子家族。片段重復事件在bZIP轉錄因子家族擴張中的貢獻大于串聯(lián)重復事件[36]，在毛白楊[36]、桃[32]的 bZIP轉錄因子家族基因中分別有72.1%和48%為片段重復基因。本研究在單葉薔薇5號染色體上發(fā)現一對串聯(lián)重復基因Rbe002635和Rbe002636，這2個基因均屬于A亞族，基因的結構和基序的組成均極其相似；此外，發(fā)現7對共線性基因對，片段重復基因約占所有單葉薔薇bZIPs的28%，在單葉薔薇中片段重復事件數大于串聯(lián)重復事件，但是與前人的研究相比所占比率較小。

基因的組織表達特征與其功能緊密相關。本研究發(fā)現，單葉薔薇有3個bZIPs(Rbe010493、Rbe014412、Rbe006220)在5種器官中均高表達，推測其在單葉薔薇的生長發(fā)育過程中發(fā)揮廣泛作用。此外，某些基因在組織中特異性表達，這些基因可能參與單葉薔薇相關器官的發(fā)育。Rbe013649在花中特異性表達，且相對表達量較高(2 803.08)，屬于H亞族，在進化樹中與AtbZIP56(HY5)分于同一小支。研究發(fā)現，大部分調控花青素生物合成的基因和轉錄因子受HY5控制[37]。在擬南芥中，HY5不僅能直接調節(jié)CHS、F3H和F3′H等花青素結構基因的表達[38]，還可以與MYB等轉錄因子的啟動子結合，間接調控花青素相關基因的表達[39]。由此推測，Rbe013649可能調控單葉薔薇中花青素的合成。此外，干旱脅迫下，根系的形態(tài)結構是植物生長發(fā)育水平和適應外界環(huán)境能力的直接體現[40]。Rbe006639在根中特異性表達，且啟動子中含有15個與非生物脅迫有關的順式作用元件，可能在單葉薔薇抗旱過程中起重要作用。

4 結 論

從單葉薔薇基因組數據庫中鑒定出50個單葉薔薇bZIPs轉錄因子基因，分為12亞族，其中D亞族特有的基序 2屬于DOG1結構域，與種子的休眠調控有關，該亞族可能具有相關功能。單葉薔薇bZIP轉錄因子家族基因的啟動子含有1～15個與非生物脅迫有關的順式作用元件，表明單葉薔薇bZIP轉錄因子家族可能響應不同的脅迫。檢測到49個bZIP轉錄因子家族基因的表達，其中Rbe013649在花中相對表達量較高(2 803.08)，可能調控單葉薔薇中花青素的合成；Rbe006639在根中特異性表達，且含有最多的與非生物脅迫有關的順式作用元件，可能在單葉薔薇抗旱過程中起重要作用。