高必興， 何 芳， 齊景梁， 茍 琰， 耿 昭， 鐘 戀， 蔣桂華， 蔣運(yùn)斌

(1.成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，四川 成都 610072；2.四川省藥品檢驗(yàn)研究院/國(guó)家藥品監(jiān)督管理局中成藥質(zhì)量評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 611731；3.西南大學(xué)藥學(xué)院中醫(yī)藥學(xué)院，重慶 400715)

全緣兔耳草LagotisintegraW. W. Smith收載于《衛(wèi)生部頒藥品標(biāo)準(zhǔn)藏藥第一冊(cè)》及《云南省藥品標(biāo)準(zhǔn)》，分布于我國(guó)四川西南部、西藏東部及青海西南部，具有清熱解毒、行血調(diào)經(jīng)、活血續(xù)筋。用于瘡瘍、中毒、炭疽、月經(jīng)不調(diào)等[1-2]，苯乙醇苷類、環(huán)烯醚萜苷類為該藥材治療熱性肝病的主要活性成分[3-12]，但現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)及文獻(xiàn)均未收載其所含成分的含量測(cè)定[13]，僅測(cè)定其同屬植物短筒兔耳草中松果菊苷(苯乙醇苷類成分)含量[14]。前期報(bào)道，全緣兔耳草含有大車前苷及鞭打繡球苷B這2種苯乙醇苷類成分，以及10-O-反式-對(duì)甲氧基肉桂?；?梓醇、10-O-[(E)-3,4-二甲氧基肉桂?；鵠-梓醇[15]、梓醇、桃葉珊瑚苷[15-17]這4種環(huán)烯醚萜苷類成分。

全緣兔耳草有3種不同植物形態(tài)，第1類產(chǎn)于石渠、德格等地，花白色，花莖直立，基生葉葉柄稍長(zhǎng)；第2類主產(chǎn)于西藏，花序紫色，基生葉葉柄短，花莖多匍匐；第3類主產(chǎn)于四川理塘、稻城、雅江等地，花黃白色，基生葉葉柄長(zhǎng)，葉近披針形，花莖直立?！缎l(wèi)生部頒藥品標(biāo)準(zhǔn)藏藥第一冊(cè)》收載全緣兔耳草的藥用部位為全草[1]，但在青海、西藏主要使用其地上部分。由于全緣兔耳草主要為野生資源，生長(zhǎng)海拔高，環(huán)境惡劣，導(dǎo)致其分布范圍及產(chǎn)量逐年減小，而藏區(qū)人民采藥時(shí)習(xí)慣將其連根挖出，更導(dǎo)致資源大規(guī)模破壞，無(wú)法再生。因此，本實(shí)驗(yàn)測(cè)定全緣兔耳草3種形態(tài)、藥用部位(全草、地上部位、地下部位)中大車前苷、鞭打繡球苷B、10-O-反式-對(duì)甲氧基肉桂?；?梓醇、10-O-[(E)-3,4-二甲氧基肉桂?；鵠-梓醇、梓醇、桃葉珊瑚苷的含量，以期為其資源可持續(xù)發(fā)展研究提供依據(jù)。

1 材料

LC-20AD高效液相色譜儀(日本島津公司)；安捷倫1260高效液相色譜儀(美國(guó)安捷倫公司)； BP211D電子天平(十萬(wàn)分之一，德國(guó)Sartorious公司)；Milli-Q超純水機(jī)(美國(guó)密理博公司)。鞭打繡球苷B、10-O-反式-對(duì)甲氧基肉桂酰基-梓醇、10-O-[(E)-3,4-二甲氧基肉桂酰基]-梓醇對(duì)照品均為實(shí)驗(yàn)室分離純化；大車前苷(批號(hào)111914-201604)、桃葉珊瑚苷(批號(hào)111761-200601)、梓醇(批號(hào)111808-202112)對(duì)照品均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。8批全緣兔耳草經(jīng)四川省藥品檢驗(yàn)研究院黎躍成主任中藥師研究鑒定為正品，并通過(guò)花的顏色和葉的形態(tài)將其分成3類，見(jiàn)表1。甲醇、乙腈為色譜純；水為純化水。

2 方法

2.1 鞭打繡球苷B、10-O-反式-對(duì)甲氧基肉桂?；?梓醇、10-O-[(E)-3,4-二甲氧基肉桂?；鵠-梓醇含量測(cè)定

2.1.1 色譜條件 沃特世X-bridge C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相乙腈(A)-0.4%甲酸(B)，梯度洗脫(0～20 min，14% A；20～35 min，14%～17%A；35～62 min，17%～20%A)；體積流量1.0 mL/min；柱溫30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)325 nm；進(jìn)樣量10 μL。色譜圖見(jiàn)圖1。

1.大車前苷 2.鞭打繡球苷B 3.10-O-反式-對(duì)甲氧基肉桂?；?梓醇 4.10-O-[(E)-3,4-二甲氧基肉桂酰基]-梓醇1.plantagoside 2.hemiphroside B 3.10-O-trans-p-methoxycinnamoyl-catalpol 4.10-O-[(E)-3,4-dimethoxycinnamoyl]catalpol圖1 各成分HPLC色譜圖(Ⅰ)Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents(Ⅰ)

2.1.2 對(duì)照品溶液制備 精密稱取大車前苷、鞭打繡球苷B、10-O-反式-對(duì)甲氧基肉桂?；?梓醇及10-O-[(E)-3,4-二甲氧基肉桂?；鵠-梓醇對(duì)照品適量，加甲醇制成各成分質(zhì)量濃度約為1 mg/mL的溶液，即得。

2.1.3 供試品溶液制備 取樣品粉末約0.1 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入50 mL甲醇，密塞，稱定質(zhì)量，回流提取30 min，放冷，甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，即得。

2.2 梓醇、桃葉珊瑚苷含量測(cè)定

2.2.1 色譜條件 沃特世Atlantis T3 C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相乙腈-0.2%磷酸(2∶98)；體積流量1.0 mL/min；柱溫25 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm；進(jìn)樣量10 μL。色譜圖見(jiàn)圖2。

2.2.2 對(duì)照品溶液制備 精密稱取梓醇、桃葉珊瑚苷對(duì)照品適量，流動(dòng)相制成各成分質(zhì)量濃度約為0.8 mg/mL的溶液，即得。

1.梓醇 2.桃葉珊瑚苷1.catalpol 2.aucubin圖2 各成分HPLC色譜圖(Ⅱ)Fig.2 HPLC chromatograms of various constituents (Ⅱ)

2.2.3 供試品溶液制備 精密量取“2.1.3”項(xiàng)下供試品溶液20 mL，濃縮至近干，流動(dòng)相溶液溶解并轉(zhuǎn)移至10 mL量瓶中，搖勻，濾過(guò)，即得。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 線性關(guān)系考察 精密量取“2.1.2”及“2.2.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液適量，分別在“2.1.1”及“2.2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定。以對(duì)照品峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)進(jìn)行回歸，結(jié)果見(jiàn)表2，可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3.2 精密度試驗(yàn) 精密吸取對(duì)照品混合溶液10 μL，分別在“2.1.1”及“2.2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得大車前苷、鞭打繡球苷B、10-O-反式-對(duì)甲氧基肉桂酰基-梓醇、10-O-[(E)-3,4-二甲氧基肉桂?；鵠-梓醇、梓醇、桃葉珊瑚苷峰面積RSD分別為0.23%、0.27%、0.12%、0.32%、0.19%、0.13%，表明儀器精密度良好。

2.3.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取藥材粉末6份，按“2.1.3”及“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別在“2.1.1”及“2.2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得大車前苷、鞭打繡球苷B、10-O-反式-對(duì)甲氧基肉桂?；?梓醇、10-O-[(E)-3,4-二甲氧基肉桂?；鵠-梓醇、梓醇、桃葉珊瑚苷峰面積RSD分別為0.24%、0.92%、0.34%、0.57%、0.26%、0.11%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2.3.3”項(xiàng)下供試品溶液，于0、4、8、12、16、24 h分別在“2.1.1”及“2.2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得大車前苷、鞭打繡球苷B、10-O-反式-對(duì)甲氧基肉桂?；?梓醇、10-O-[(E)-3,4-二甲氧基肉桂?；鵠-梓醇、梓醇、桃葉珊瑚苷峰面積RSD分別為0.21%、0.74%、0.65%、0.42%、0.31%、0.24%，表明溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.5 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取大車前苷、鞭打繡球苷B、10-O-反式-對(duì)甲氧基肉桂?；?梓醇、10-O-[(E)-3,4-二甲氧基肉桂?；鵠-梓醇、梓醇、桃葉珊瑚苷對(duì)照品適量，加甲醇制成質(zhì)量濃度分別為1.112 3、0.357 8、0.541 2、0.246 5、0.177 5、0.165 8 mg/mL的溶液。取藥材粉末6份，每份約0.05 g，精密稱定，精密加入上述溶液適量，按“2.1.3”及“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別在“2.1.1”及“2.2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果，大車前苷、鞭打繡球苷B、10-O-反式-對(duì)甲氧基肉桂?；?梓醇、10-O-[(E)-3,4-二甲氧基肉桂?；鵠-梓醇、梓醇、桃葉珊瑚苷平均加樣回收率分別為95.5%、97.7%、99.6%、100.2%、101.9%、100.3%，RSD分別為1.80%、0.83%、1.94%、1.85%、0.95%、0.82%。

2.3.6 樣品含量測(cè)定 精密稱取藥材粉末(過(guò)3號(hào)篩)0.1 g，平行2份，按“2.1.3”及“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別在“2.1.1”及“2.2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算含量，結(jié)果見(jiàn)表3。

2.3.7 聚類分析 采用SPSS 25.0軟件進(jìn)行聚類分析，選擇組內(nèi)聯(lián)接聚類法，以歐式平方距離度量為標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果見(jiàn)圖3。由此可知，當(dāng)歐式平方距離為10時(shí)，第1類全部聚成一類；第二類分別聚類，未與第1類、第3類交叉；第3類也分別聚類，未與第1類、第2類交叉。

2.3.8 正交偏最小二乘法判別分析 采用SIMCA 14.1軟件進(jìn)行正交偏最小二乘法判別分析，結(jié)果見(jiàn)圖4。由此可知，各批藥材地上、地下部分中6種成分分別聚集，具有一定的差異性。

圖4 正交偏最小二乘法判別分析得分圖Fig.4 Score diagram for orthogonal partial least-squares discrimination analysis

3 討論

由于梓醇、桃葉珊瑚苷色譜條件與鞭打繡球苷B、10-O-反式-對(duì)甲氧基肉桂?；?梓醇、10-O-[(E)-3,4-二甲氧基肉桂酰基]-梓醇色譜條件具有明顯差異，故本實(shí)驗(yàn)分別建立其含量測(cè)定方法。聚類分析結(jié)果表明，3種形態(tài)全緣兔耳草不同藥用部位中6種成分分布具有一定差異。表3顯示，第1類藥材中梓醇、桃葉珊瑚苷含量低于另外2類藥材；第3類藥材中鞭打繡球苷B，10-O-反式-對(duì)甲氧基肉桂?；?梓醇、10-O-[(E)-3,4-二甲氧基肉桂酰基]-梓醇)含量低于第1、2類藥材，但大車前苷含量更高；3類藥材中苯乙醇苷類總含量接近，而環(huán)烯醚萜苷類總含量依次為第3類>第2類>第1類，這可能與其生長(zhǎng)環(huán)境(如海拔、溫度等)相關(guān)。

表3 各成分含量測(cè)定結(jié)果(mg/mL，n=2)

正交偏最小二乘法判別分析是一種用于判別分析的多變量統(tǒng)計(jì)分析方法，可用于觀察不同產(chǎn)地樣品之間的組內(nèi)差異，進(jìn)行有監(jiān)督的判別分析[18]，并獲得相應(yīng)模型。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，3種形態(tài)全緣兔耳草的6種成分含量在地上、地下部分中具有差異，但同一藥用部位不同批次藥材的點(diǎn)較為分散；地上部分中苯乙醇苷類總含量均高于地下部分，而環(huán)烯醚萜苷類總含量恰好相反。