李俊輝，梁柳紅，莫楚楚，趙子涵

（廣東海洋大學(xué) 水產(chǎn)學(xué)院，廣東 湛江）

《國(guó)家中長(zhǎng)期教育改革和發(fā)展規(guī)劃綱要（2010-2020年）》指出：牢固確立人才培養(yǎng)在高校工作中的中心地位，著力培養(yǎng) 品學(xué)兼優(yōu)、本領(lǐng)過硬的高素質(zhì)專門人才和拔尖創(chuàng)新人才。高等教育承擔(dān)著培養(yǎng)高級(jí)專門人才、發(fā)展科學(xué)技術(shù)文化、促進(jìn)現(xiàn)代化建設(shè)的重大任務(wù)。高校越來越重視創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)教育與專業(yè)學(xué)科的融合。結(jié)合科研項(xiàng)目，實(shí)施科教融合，將教學(xué)與科研實(shí)踐有效結(jié)合起來培養(yǎng)本科生的創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)能力是高校完善和提高教育教學(xué)水平的根本途徑之一。本科生導(dǎo)師制是一種源于牛津大學(xué)并流傳至今的人才培養(yǎng)模式，牛津大學(xué)針對(duì)本科生實(shí)施導(dǎo)師制的培養(yǎng)模式，鼓勵(lì)學(xué)生在與導(dǎo)師面對(duì)面的交流討論中不斷激發(fā)科研創(chuàng)新能力。廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)科是廣東省高水平建設(shè)學(xué)科。自從2013年以來，大一新生入學(xué)后開始本科生導(dǎo)師的培養(yǎng)模式，由學(xué)生和導(dǎo)師進(jìn)行雙向選擇，學(xué)生自愿報(bào)名，導(dǎo)師可以選擇有意向報(bào)名學(xué)生。在雙向選擇后，導(dǎo)師為本科生講解實(shí)驗(yàn)，并結(jié)合科研項(xiàng)目設(shè)立實(shí)驗(yàn)，指導(dǎo)本科生參與實(shí)驗(yàn)。本論文中大學(xué)生在導(dǎo)師指導(dǎo)下完成了“大珠母貝類胡蘿卜素代謝相關(guān)基因PmApoL序列與表達(dá)模式分析”課題，這個(gè)完成實(shí)驗(yàn)與論文撰寫過程中，學(xué)生的主動(dòng)探索與導(dǎo)師的悉心指導(dǎo)，提高了本科生創(chuàng)新思維與能力。

一 材料與方法

實(shí)驗(yàn)用貝取自湛江市徐聞縣承梧村海區(qū)，挑選無病害的2齡大珠母貝，剪取閉殼肌（A）、鰓（Gi）、外套膜邊緣區(qū)（Me）、套膜區(qū)（Mp）、中央?yún)^(qū)（Mc）、足（F）和肝胰腺（He），所取組織放入液氮速凍，存于-80℃超低溫冰箱，用于熒光定量分析。

利用試劑盒提取總RNA，通過反轉(zhuǎn)錄試劑盒將提取RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA, 實(shí)驗(yàn)步驟及條件均參照說明書進(jìn)行。

通過分析大珠母貝轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)，篩選與PmApoL基因相似度較高的unigene片段，利用軟件Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)中間片段，5′RACE和3′RACE所需要的基因特異性引物（表1）。

表1 基因克隆及熒光定量的引物序列

利用特異性引物PmApoL-F/PmApoL-R進(jìn)行基因中間片段擴(kuò)增，反應(yīng)體系如下：Premix Taq 5 μL，模板cDNA0.4 μL，滅菌 ddH2O 3.8 μL。將反應(yīng)程序設(shè)定為94℃預(yù)變性5min；94℃變性 30 s，61℃退火30 s，72℃延伸2min，35個(gè)循環(huán)；72℃終延伸10min；4℃保存。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，證實(shí)為目的條帶后連接至pMD18-T載體，并轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞，菌液培養(yǎng)1h后，涂布于含氨芐青霉素固體平板并倒置37℃培養(yǎng)10h，挑取陽性單克隆進(jìn)行菌落PCR檢測(cè)，將目的基因送至上海生物公司測(cè)序。

采用巢式PCR方法對(duì)PmApoL基因3′端和5′端進(jìn)行RACE擴(kuò)增。3′末端的擴(kuò)增體系為10 μL：cDNA模板0.4 μL，PmApoL基因-3′-outer 0.4μL，UPM 0.4 μL，Premix Taq5μL，滅菌ddH2O 3.8μL。將退火溫度改為58℃，其他反應(yīng)程序同上。將第一輪得出的PCR產(chǎn)物用做第二輪PCR反應(yīng)的模板，引物使用PmApoL-3′-inner，UPM換為NUP，其他反映程序不變。5′末端的擴(kuò)增反應(yīng)時(shí)，將引物換成對(duì)應(yīng)的5′-outer和5′-inner，反應(yīng)條不變。其余操作步驟同上。

利用 DNAMAN 軟件的Sequence Assembly程序分別將PmApoL的中間片斷與3′和5′端片段拼接起來，得到PmApoL的基因全長(zhǎng)，共1857 bp。再用其Phylogenetic tree程序?qū)⒋笾槟肛怭mApoL與其他物種PmApoL構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，利用在線工具 ORF Finder（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/orfig.cgi ）對(duì)PmApoL基因進(jìn)行開放閱讀框（ORF）和蛋白序列的預(yù)測(cè)。使用NCBI (http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)在線工具，將所得序列應(yīng)用BLAST程序進(jìn)行序列同源性比對(duì)和相似性分析，利用ClusterW2（http://www.ebi.ac.uk/Tools/phylogeny/clustalw2_phylogeny/）將大珠母貝PmApoL序列與其他物種序列進(jìn)行同源性比對(duì)。使用SMART PRITION（http://smart.emblheidelberg.de/smart/set_mode.cgi?GENOMIC=1）程序獲得PmApoL的結(jié)構(gòu)域，即基因類型。通過使用通過ExPASy（http://web.expasy.org/vg/index/protein）對(duì)氨基酸序列的理化性質(zhì)進(jìn)行分析，運(yùn)用SignalP4.1 (http://www.cbs.dtu.dk/services/Signal/)在線工具進(jìn)行信號(hào)肽預(yù)測(cè)；用Motif Scan（http://myhits.isb-sib.ch/cgi-bin/motif_scan）搜索工具對(duì)PmApoL序列進(jìn)行功能位點(diǎn)檢測(cè)，用TMHMM Server v.2.0預(yù)測(cè)PmApoL的跨膜結(jié)構(gòu)域，用SWISS-MODEL （http://swissmodel.expasy.org/）進(jìn)行PmApoL的三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)[1]。

通過實(shí)時(shí)熒光定量 PCR的方法探究大珠母貝不同組織中的表達(dá)差異進(jìn)行分析，以GAPDH為內(nèi)參。通過2-ΔΔCT計(jì)算法得出PmApoL在大珠母貝鰓、中央膜、閉殼肌、肝胰腺的相對(duì)表達(dá)量。用SPSS 19.0 軟件進(jìn)行顯著性分析。顯著性水平α=0.05。

二 結(jié)果與分析

根據(jù)大珠母貝RNA-Seq數(shù)據(jù)庫(kù)中PmApoL的unigene序列設(shè)計(jì)基因特異性引物，利用RACE技術(shù)克隆了PmApoL基因的3端和5端序列，與中間片段拼接得到cDNA全長(zhǎng)序列。結(jié)果顯示，PmApoL序列全長(zhǎng)913 bp，其中5′UTR序列長(zhǎng)為142 bp；3′UTR序列長(zhǎng)為54 bp；開放閱讀框（ORF）長(zhǎng)690bp，編碼229個(gè)氨基酸。

圖1 PmApoL基因的cDNA 序列及編碼的氨基酸序列

利用ExPASy在線軟件預(yù)測(cè)得PmApoL基因理論分子質(zhì)量為24.38ku；等電點(diǎn)為8.88；負(fù)電荷殘基26個(gè)，正電荷殘基30個(gè)。氨基酸含量分析結(jié)果顯示，脂溶指數(shù)（Aliphatic index）為114.19，不穩(wěn)定指數(shù) 23.87，屬于穩(wěn)定蛋白；總平均親水性（Grand averageofhydropathy,GRAVY）為 0.173，屬于疏水性蛋白。用 TMHMM2.0預(yù)測(cè)PmApoL基因有兩個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，分別在42-64和69-91位氨基酸，該分子屬于膜蛋白。PmApoL的二級(jí)結(jié)構(gòu)中，α螺旋結(jié)構(gòu)占整體的76.86%，延伸鏈占7.86%，β 轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)占4.37%，無規(guī)則折疊占10.92%。利用SMART軟件分析，PmApoL基因有1個(gè)ApoL家族保守結(jié)構(gòu)域（圖2）。

圖2 PmApoL蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)

利用MEGA7軟件構(gòu)建大珠母貝PmApoL基因與其他物種的進(jìn)化樹，發(fā)現(xiàn)與馬氏珠母貝（Pinctada.imbricata）類聚為一個(gè)亞支，親緣關(guān)系較近。大珠母貝和馬氏珠母貝是兩個(gè)近緣物種，PmApoL基因?qū)儆贏polipoprotein。

圖3 鄰接法構(gòu)建的PmApoL家族系統(tǒng)進(jìn)化樹

熒光定量PCR技術(shù)分析PmApoL基因在閉殼肌、外套膜套膜區(qū)、中央?yún)^(qū)、足和肝胰腺組織的表達(dá)模式。結(jié)果顯示，PmApoL基因在各個(gè)組織中均有表達(dá)，在肝胰腺表達(dá)量較高，在閉殼肌和足中表達(dá)量較低（圖4）。

圖4 基因在大珠母貝的不同組織中的表達(dá)量

熒光定量PCR技術(shù)分析PmApoL在大珠母貝6月齡幼貝的閉殼肌、外套膜邊緣區(qū)、套膜區(qū)、中央?yún)^(qū)和肝胰腺組織的表達(dá)模式。結(jié)果顯示，四個(gè)候選基因在各個(gè)組織中均有表達(dá)，其中PmApoL在肝胰腺表達(dá)量較高，在閉殼肌中表達(dá)量較低。

圖5 基因在大珠母貝的不同組織中的表達(dá)量

載脂蛋白（ApoL）屬于高密度脂蛋白家族，參與脂類物質(zhì)的運(yùn)輸和代謝。類胡蘿卜素作為一種脂溶性色素，其在體內(nèi)的運(yùn)輸與代謝過程中依靠脂蛋白。通過分析大珠母貝套膜組織的RNA-Seq數(shù)據(jù)，篩選金色珍珠質(zhì)色素沉淀相關(guān)基因，成功克隆了PmApoL基因的cDNA全長(zhǎng)序列。PmApoL預(yù)測(cè)到1個(gè)載脂蛋白（ApoL）結(jié)構(gòu)域。根據(jù)進(jìn)化樹分析，PmApoL與馬氏珠母貝Pm-ApoL2基因聚在一個(gè)亞支，屬于高密度脂蛋白家族[2]。在大珠母貝成貝與稚貝，PmApoL在肝胰腺組織中表達(dá)量最高，其次是外套膜，閉殼肌中表達(dá)量最低。雷超等人[3]研究發(fā)現(xiàn)Pm-ApoL2在馬氏珠母貝的肝胰腺組織表達(dá)量最高，且與類胡蘿卜素在肝胰腺組織的含量呈顯著的正相關(guān)。膽固醇，類胡蘿卜素等脂類物質(zhì)在機(jī)體內(nèi)運(yùn)輸和代謝過程依靠脂蛋白。家蠶血淋巴細(xì)胞主要通過高密度脂蛋白運(yùn)載類胡蘿卜素，其中90%為葉黃素[4]。無脊椎動(dòng)物中，肝胰腺負(fù)責(zé)消化和吸收大量機(jī)體所需的養(yǎng)分，也是類胡蘿卜素富集和代謝的重要組織[5-6]。PmApoL在肝胰腺組織特異性高表達(dá)，在大珠母貝中，推測(cè)PmApoL在肝胰腺組織對(duì)脂類的吸收和運(yùn)輸過程起重要作用。

三 結(jié)語

實(shí)踐表明，自從實(shí)施本科導(dǎo)師制以來，學(xué)生通過本科生導(dǎo)師制這個(gè)平臺(tái)，學(xué)生提早進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室，在導(dǎo)師指導(dǎo)下完成相關(guān)科研研究；在這個(gè)過程中，本科生與導(dǎo)師建立緊密的聯(lián)系，使得課堂理論知識(shí)與科學(xué)實(shí)踐有機(jī)結(jié)合，提高使學(xué)習(xí)的針對(duì)性和自主學(xué)習(xí)能力。更為重要的是通過實(shí)施本科生導(dǎo)師制與構(gòu)建科教融合的培養(yǎng)模式顯著提高了本科生的創(chuàng)新能力，取得了良好育人效果。