趙冕，王貝貝，王冰，李獻(xiàn)銳

(1.河北醫(yī)科大學(xué) 教學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，河北 石家莊 050017；2.河北醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院，河北 石家莊 050017)

近年來，隨著人們生活方式的改變，糖尿病已成為困擾中國居民的常見疾病[1].目前，臨床上針對(duì)糖尿病患者多應(yīng)用格列齊特、二甲雙胍及阿卡波糖等藥物進(jìn)行治療，其中阿卡波糖作為中國糖尿病市場(chǎng)占據(jù)份額最大的口服型降糖藥，是一種α-葡萄糖苷酶抑制劑，通過抑制腸黏膜上的α-葡萄糖苷酶活性，降低多糖及蔗糖分解為單糖的速度，從而減小和延緩小腸對(duì)葡萄糖的吸收，改善糖尿病人血糖異常，使血糖維持在一定水平，并減少并發(fā)癥的發(fā)生[2].因此，建立一種快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確測(cè)定阿卡波糖的新型分析技術(shù)，對(duì)保障患者的身體健康，有一定現(xiàn)實(shí)意義和長(zhǎng)遠(yuǎn)的社會(huì)意義.有關(guān)阿卡波糖的分析方法，國內(nèi)外報(bào)道的文獻(xiàn)有高效液相色譜法[3-4]、電致發(fā)光分析法[5-6]、量子點(diǎn)熒光猝滅法[7-11]、分光光度法[12-15]等.但大多數(shù)方法都是利用α-葡萄糖苷酶催化α-葡萄糖苷鍵的解離，然后測(cè)量水解產(chǎn)物的濃度，實(shí)驗(yàn)過程復(fù)雜，耗時(shí)較長(zhǎng).

流動(dòng)注射-化學(xué)發(fā)光(FI-CL)分析法具有儀器設(shè)備簡(jiǎn)單、操作方便快速、靈敏度高、線性范圍寬等優(yōu)點(diǎn)，適合在線快速檢測(cè)，在醫(yī)藥生物、免疫檢測(cè)和環(huán)境分析等領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用[16].本實(shí)驗(yàn)研究了阿卡波糖對(duì)H2O2-魯米諾體系發(fā)光強(qiáng)度的影響.結(jié)果表明，阿卡波糖可以使發(fā)光信號(hào)增強(qiáng)，結(jié)合流動(dòng)注射技術(shù)，建立了一種簡(jiǎn)單、靈敏的測(cè)定阿卡波糖的新方法，并應(yīng)用于不同品牌片劑中阿卡波糖的測(cè)定分析.

1 儀器與試劑

1.1 儀器

IFFS-A型多功能化學(xué)發(fā)光檢測(cè)器、IFFM-E型流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光分析儀(西安瑞邁分析儀器有限責(zé)任公司);KQ-100D型超聲儀(昆山市超聲儀器有限公司)；電子分析天平(奧豪斯國際貿(mào)易有限公司)；pHS-3CU型酸度計(jì)(上海越平儀器有限公司)；微型高速離心機(jī)(Sigma公司).

1.2 試劑

阿卡波糖、魯米諾(阿拉丁試劑上海有限公司)；質(zhì)量分?jǐn)?shù)30%H2O2(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)；磷酸二氫鈉、磷酸氫二鉀(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)；鹽酸(石家莊市試劑廠)；氫氧化鈉(天津市化學(xué)試劑三廠)；乙二胺四乙酸二鈉(天津博迪化工股份有限公司).卡博平牌阿卡波糖片劑(杭州中美華東制藥有限公司)，規(guī)格50 mg×30片，國藥準(zhǔn)字H20020202；拜唐蘋牌阿卡波糖片劑(拜耳醫(yī)藥保健有限公司)，規(guī)格50 mg×30片，國藥準(zhǔn)字H19990205，均購自石家莊市石藥大藥房.所用試劑均為分析純，所用水為18MΩ·cm超純水.

1.3 溶液配制

魯米諾儲(chǔ)備液(0.01 mol/L)：稱取魯米諾0.177 2 g，用0.10 mol/L的NaOH溶解并定容于100 mL棕色容量瓶中，避光放置1周后使用.使用時(shí)用pH 12.5的NaOH稀釋.

阿卡波糖標(biāo)準(zhǔn)液(0.20 mg/mL)：稱取阿卡波糖50.0 mg，用0.1 mol/L pH 6.70的磷酸鹽緩沖液溶解并定容于250 mL容量瓶中，使用時(shí)用pH 6.70的PBS逐級(jí)稀釋.

0.1 mol/L EDTA溶液：稱取EDTA 3.722 4 g,用水溶解并定容于100 mL容量瓶中.

H2O2溶液(0.01 mol/L)：使用時(shí)用水稀釋.

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 實(shí)驗(yàn)流程

流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光流程如圖1所示.魯米諾堿性溶液與過氧化氫溶液經(jīng)過三通管混合后載入流路，待基線穩(wěn)定后，通過進(jìn)樣閥將阿卡波糖溶液注入到魯米諾與過氧化氫的混合溶液中，發(fā)生化學(xué)發(fā)光反應(yīng).記錄化學(xué)發(fā)光信號(hào)，以峰高定量.

圖1 流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光分析流程示意Fig.1 Schematic diagram of FI-CL system

2.2 樣品處理

阿卡波糖是一種C7N-氨基環(huán)醇類的假性四糖物質(zhì)，含有多個(gè)羥基，極易溶于水.因此，水是阿卡波糖良好的溶出介質(zhì)，將30片樣品于瑪瑙研缽中研成粉末后，置于稱量瓶，于干燥器中保存、備用.稱取阿卡波糖樣品0.140 0 g置于離心管中，加5 mL 水在250 W 超聲波清洗器中超聲 5 min后，離心機(jī)中中速離心 5 min.取上清液移至25 mL 容量瓶中，依次再加5 mL 水進(jìn)行超聲、離心2次，合并上清液，用0.1 mol/L pH6.70的PBS溶液定容.準(zhǔn)確移取2.50 mL于25 mL容量瓶中，用0.1 mol/L pH6.70的PBS溶液定容，搖勻，得樣品測(cè)定溶液.在選定的實(shí)驗(yàn)條件下進(jìn)行測(cè)定，根據(jù)回歸方程求得阿卡波糖的質(zhì)量濃度，按式(1)計(jì)算樣品的質(zhì)量分?jǐn)?shù).

(1)

式中，w為樣品中阿卡波糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)(mg/g)；ρx為由標(biāo)準(zhǔn)曲線求得的樣品測(cè)定液中阿卡波糖的質(zhì)量濃度(mg/mL)；m為稱取樣品的質(zhì)量(g).

3 結(jié)果與討論

3.1 化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)曲線

考察魯米諾-H2O2-阿卡波糖系統(tǒng)的動(dòng)力學(xué)性質(zhì).由圖2可發(fā)現(xiàn)H2O2氧化魯米諾的反應(yīng)為快發(fā)光反應(yīng)(2～3 s).加入0.020 mg/mL阿卡波糖時(shí)，發(fā)光強(qiáng)度由2 075增加到8 112.表明阿卡波糖對(duì)魯米諾-H2O2發(fā)光體系具有明顯的增敏作用.

a.H2O-2.0×10-5 mol/L 魯米諾-5.0×10-3 mol/L H2O2；b.0.020 mg/mL 阿卡波糖-2.0×10-5 mol/L 魯米諾-5.0×10-3 mol/L H2O2.圖2 化學(xué)發(fā)光的動(dòng)力學(xué)曲線Fig.2 Kinetic curve of chemiluminescence

3.2 儀器工作參數(shù)的選擇

在其他實(shí)驗(yàn)條件不變的情況下，分別考察了光電倍增管的負(fù)高壓、進(jìn)樣管長(zhǎng)度和試劑流速對(duì)發(fā)光信號(hào)的影響.實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，當(dāng)光電倍增管負(fù)高壓700 V，進(jìn)樣管長(zhǎng)度為10 cm，選擇泵速40 r/min時(shí)有最佳的信噪比.

3.3 化學(xué)發(fā)光條件的選擇

3.3.1 魯米諾pH值的選擇

發(fā)光強(qiáng)度的大小和穩(wěn)定性會(huì)受pH值的影響.測(cè)試不同酸度條件下的發(fā)光信號(hào)，發(fā)現(xiàn)隨溶液pH增大發(fā)光強(qiáng)度增大；但堿性太大時(shí)，基線升高，信號(hào)不穩(wěn)定(圖3).對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，發(fā)現(xiàn)魯米諾溶液pH值從10.0至12.5，相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，但12.5以后發(fā)光信號(hào)急速減弱 (圖3) .因此選擇魯米諾溶液pH值為12.5.

內(nèi)插圖為不同pH魯米諾-H2O2體系的發(fā)光曲線，pH自下而上依次增大.圖3 魯米諾溶液的pH對(duì)相對(duì)發(fā)光信號(hào)的影響Fig.3 Effect of the pH of lumiol on ΔI

3.3.2 魯米諾濃度的選擇

發(fā)光強(qiáng)度的大小依賴于發(fā)光試劑的濃度，考察了1.0×10-4～0.1 mmol/L內(nèi)的魯米諾對(duì)光強(qiáng)的影響.結(jié)果如圖4所示，魯米諾濃度從1.0×10-4增大至2.0×10-2mmol/L，相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，但2.0×10-2mmol/L以后發(fā)光信號(hào)增大不太明顯.因此選擇2.0×10-2mmol/L魯米諾用于實(shí)驗(yàn)測(cè)試.

內(nèi)插圖為魯米諾體系發(fā)光曲線，魯米諾的濃度自下而上依次增大.圖4 魯米諾濃度和發(fā)光信號(hào)的關(guān)系Fig.4 Effect of luminol concentration on ΔI

3.3.3 H2O2濃度的選擇

H2O2的濃度會(huì)影響發(fā)光信號(hào).考察了H2O2濃度1.0×10-2～0.1 mmol/L對(duì)光強(qiáng)的影響.實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)(圖5)，H2O2濃度從1.0×10-2mmol/L增大至2.0 mmol/L，相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，但2.0 mol/L以后發(fā)光信號(hào)幾乎不再變化.因此選擇過氧化氫的最佳測(cè)試濃度為2.0 mmol/L.

內(nèi)插圖為魯米諾體系發(fā)光曲線，H2O2濃度自下而上依次增大.圖5 H2O2濃度對(duì)發(fā)光信號(hào)的影響Fig.5 Effect of H2O2 concentration on ΔI

3.4 線性范圍、靈敏度和檢出限

在選定的實(shí)驗(yàn)條件下，阿卡波糖在3.0×10-4～2.0×10-2mg/mL內(nèi)，體系的發(fā)光信號(hào)與阿卡波糖的質(zhì)量濃度呈良好的線性關(guān)系(圖6)，回歸方程為：ΔI=343.5ρ-0.146，r=0.998 7，檢出限為2.3×10-4mg/mL.在最優(yōu)條件下對(duì)0.010 mg/mL的阿卡波糖連續(xù)測(cè)定11次,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為2.7%.

內(nèi)插圖為標(biāo)準(zhǔn)曲線;ρ(阿卡波糖)/(mg·mL-1)：a.3.0×10-4;b.1.0×10-3;c.5.0×10-3; d.1.0×10-2;e.1.2×10-2;f.1.5×10-2;g.1.8×10-2; h.2.0×10-2;i.2.5×10-2;j.3.0×10-2;k.5.0×10-2.圖6 不同質(zhì)量濃度阿卡波糖溶液的發(fā)光強(qiáng)度Fig.6 CL intensity in different concentrations

3.5 干擾實(shí)驗(yàn)

圖7 共存離子的干擾Fig.7 Tolerable concentration rations of interfering species

3.6 樣品測(cè)量

將所購買樣品按“1.3”方法處理，在選定的實(shí)驗(yàn)條件下對(duì)樣品進(jìn)行6次平行測(cè)定，并做加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表1.

表1 阿卡波糖片劑中阿卡波糖的含量測(cè)定及回收率(n=6)Tab.1 Determination results of acarbose in sample and recovery experiments(n=6)

4 結(jié)論

基于在堿性條件下，阿卡波糖對(duì)魯米諾-H2O2體系發(fā)光反應(yīng)具有明顯的增敏作用，建立了流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光測(cè)定阿卡波糖的分析方法，并應(yīng)用于阿卡波糖片劑中阿卡波糖的測(cè)定，為阿卡波糖的快速分析提供了新的測(cè)定方法，取得了令人滿意的結(jié)果.