C57BL/6小鼠和C57BL/6 FMR1基因敲除小鼠行為學(xué)及針刺長(zhǎng)強(qiáng)穴治療后的對(duì)比研究

★ 林瑋 劉德強(qiáng) 楊燕燕 周建華 俞春英 鐘秋明 羅小泉 王訓(xùn)立（.福建中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心 福州 350；.江西中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技中心 南昌 330004）

基因敲除小鼠作為人類疾病的動(dòng)物模型，在發(fā)育、代謝、神經(jīng)系統(tǒng)、衰老和癌癥等研究中起到了不可替代的作用［1］，可用來(lái)揭示疾病的機(jī)理和尋找新的治療靶點(diǎn)。

腦卒中是造成人類殘疾和死亡的主要疾病之一。腦卒中幸存者中有超過(guò)70%的病人患有不同程度的功能性障礙［2］。而平衡功能障礙是腦卒中患者常見(jiàn)的功能性障礙之一，平衡功能障礙與自理能力呈負(fù)相關(guān)，平衡功能缺失對(duì)患者的生活自理能力造成嚴(yán)重影響，因此，改善患者的生活能力，實(shí)施康復(fù)治療十分必要。腦癱指嬰兒出生前到出生1個(gè)月內(nèi)出現(xiàn)的中樞神經(jīng)障礙綜合征，該疾病以大腦為主要病變位置，嚴(yán)重影響肢體功能，出現(xiàn)語(yǔ)言、聽(tīng)覺(jué)、視覺(jué)、精神等障礙，同時(shí)有行為異常、癲癇及智力缺陷等［3］。脆性X智力低下綜合征是由FMR1（fragile X mental retardation gene 1，F(xiàn)MR1 gene）基因中CGG重復(fù)序列的大規(guī)模甲基化擴(kuò)增導(dǎo)致 FMRP（fragile X mental retardation protein，F(xiàn)MRP）表達(dá)缺失引起的，主要表現(xiàn)為智力低下、行為異常、運(yùn)動(dòng)功能和記憶力缺失［4］，腦卒中后遺癥和腦癱幼兒患者的表現(xiàn)與FMR1基因敲除小鼠的表現(xiàn)癥狀基本相符。

本實(shí)驗(yàn)主要通過(guò)對(duì)FMR1基因敲除小鼠和其源生小鼠的行為學(xué)比對(duì)，并通過(guò)針刺長(zhǎng)強(qiáng)穴治療后進(jìn)行行為學(xué)對(duì)比，為腦癱和腦卒中后遺癥等疾病造成的運(yùn)動(dòng)能力損傷、智力低下、記憶力缺失和認(rèn)知障礙等的動(dòng)物模型研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

本實(shí)驗(yàn)的C57BL/6 FMR1基因敲除小鼠于2010年由位于美國(guó)休斯頓的貝勒醫(yī)學(xué)院引進(jìn)，之后由福建中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心委托江蘇集萃藥康生物科技有限公司進(jìn)行胚胎冷凍保存，并于2020年1月進(jìn)行胚胎復(fù)蘇后得到3只雌性雜合體小鼠，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證為SCXK（蘇）2018-0008。C57BL/6為C57BL/6J.KO的源生小鼠，因此于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司購(gòu)入3只雄性C57BL/6小鼠與其進(jìn)行繁殖，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證為SCXK（滬）2017-0005。行為學(xué)實(shí)驗(yàn)主要分成C57BL/6 FMR1基因敲除組（KO）和C57BL/6野生組（WT），每組小鼠20只，雌雄各半。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

避暗實(shí)驗(yàn)使用的是成都泰盟科技有限公司YLS-17B避暗穿梭測(cè)試儀。跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)使用的是成都泰盟科技有限公司的DT-200小鼠跳臺(tái)測(cè)試箱。曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)使用的是上海欣軟XR-XM117型曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)視頻分析系統(tǒng)。

1.3 方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的基因鑒定

1.3.1.1 引物設(shè)計(jì)根據(jù)FMR1基因的特性設(shè)計(jì)第一對(duì)引物M2和N2，用于檢測(cè)C57BL/6 FMR1基因敲除小鼠中包含新霉素插入片段的等位基因片段，檢測(cè)發(fā)生突變?cè)斐扇笔У腇MR1基因PCR擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為800 bp；以野生型C57BL/6小鼠基因組DNA序列為模板設(shè)計(jì)引物S1和S2，用于檢測(cè)野生型C57BL/6小鼠的FMR1等位基因的片段擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為 468 bp［5］。見(jiàn)表 1。

表1 引物序列合成

1.3.1.2 DNA提取使用0.292 g EDTA和50 mL dd H2O配置EDTA溶液；使用1 g NaOH和10 mL dd H2O配置NaOH溶液；再使用配置好的10 μL EDTA溶液加10 μL NaOH溶液再加980 μL dd H2O配置成1 mL的裂解液。剪取待進(jìn)行基因鑒定的小鼠的尾巴5 mm左右，放入已添加100 μL裂解液的離心管中，置于98 ℃的金屬浴中，每隔30 min渦旋1次，1 h左右鼠尾會(huì)完全溶解，再使用低溫離心機(jī)離心5 min（4 ℃，4 000 rpm）后，取150 μL上清液即為DNA。

1.3.1.3 PCR擴(kuò)增PCR反應(yīng)總體積為50 μL，分別加入 20 μL Mix、20 μL DEPC 水、引物各 2 μL 和DNA 1 μL。PCR擴(kuò)增條件為：?jiǎn)?dòng)后，預(yù)熱10 min，在94 ℃下預(yù)變性5 min，之后按照以下溫度和時(shí)間循環(huán) 34 次：94 ℃ 30 s，50 ℃ 60 s，72 ℃ 60 s。末次循環(huán)結(jié)束后于72 ℃延伸10 min，并于4 ℃保存。

1.3.1.4 1.5%瓊脂糖凝膠電泳制作濃度為1.5%瓊脂糖凝膠50 mL，加入5 μL的4S Red Plus核酸染色劑后，分別加入6 μL需要進(jìn)行基因鑒定的小鼠的DNA，以100 V電泳1 h后于凝膠成像儀中觀察并拍照。

1.3.2 對(duì)比研究

1.3.2.1 避暗實(shí)驗(yàn)避暗穿梭測(cè)試儀由主機(jī)和穿梭箱兩個(gè)部分組成。穿梭箱由四個(gè)190 mm×190 mm×120 mm的長(zhǎng)方體組成，呈品字型排列，分成兩組，每組都有明暗兩個(gè)房間，明室配有光源，暗室底部通以24 V交流電，明暗兩室之間有一直徑為3 cm的空洞。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，先讓小鼠在避暗穿梭測(cè)試儀中適應(yīng)5 min，避暗實(shí)驗(yàn)的時(shí)間為5 min，當(dāng)實(shí)驗(yàn)開(kāi)始時(shí)，將小鼠背朝洞口放入明室中，并開(kāi)始計(jì)時(shí)，當(dāng)實(shí)驗(yàn)小鼠第1次穿過(guò)洞口遭受電擊時(shí)，將此時(shí)的時(shí)間記作該小鼠的避暗潛伏期，并記錄每只小鼠在5 min內(nèi)被電擊的次數(shù)，即為小鼠的錯(cuò)誤次數(shù)。每只小鼠避暗實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，都需清除糞便，并用75%酒精擦拭一遍，再進(jìn)行下一只小鼠的實(shí)驗(yàn)。

1.3.2.2 跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)是檢測(cè)動(dòng)物被動(dòng)性條件反射能力的一種實(shí)驗(yàn)，主要測(cè)試動(dòng)物對(duì)空間位置辨知的學(xué)習(xí)記憶能力。實(shí)驗(yàn)每次5 min，將小鼠逐只放在相應(yīng)測(cè)試室的平臺(tái)上，按動(dòng)開(kāi)始鍵后，系統(tǒng)會(huì)自動(dòng)對(duì)小鼠開(kāi)始計(jì)時(shí)，當(dāng)小鼠從平臺(tái)跳下時(shí)，則該箱的小鼠潛伏期計(jì)時(shí)自動(dòng)停止，此時(shí)計(jì)時(shí)數(shù)值則為該小鼠的潛伏期。當(dāng)該小鼠受到電擊后又跳回平臺(tái)上時(shí)，則電擊次數(shù)加1次，直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。每只小鼠實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，清除糞便，并用75%酒精擦洗一遍，再進(jìn)行下一只小鼠的實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后統(tǒng)計(jì)跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)的潛伏期和錯(cuò)誤次數(shù)。

1.3.2.3 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)在一個(gè)邊長(zhǎng)為50 cm、高40 cm的正方體中，將其分成9個(gè)相等的小正方形，每只小鼠接受一次測(cè)試，將小鼠面朝墻隨機(jī)放入4個(gè)拐角方格，并讓其自由探索環(huán)境5 min。每只小鼠實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，清除糞便，并用75%酒精擦拭一遍，再進(jìn)行下一只小鼠的實(shí)驗(yàn)。通過(guò)軟件計(jì)算小鼠的平均速度和中央?yún)^(qū)域停留的時(shí)間。

1.4 針刺治療

將20只C57BL/6 FMR1基因敲除小鼠隨機(jī)分成長(zhǎng)強(qiáng)穴組和非經(jīng)非穴組。長(zhǎng)強(qiáng)穴位于小鼠肛門(mén)與尾根之間的凹陷處，對(duì)應(yīng)于人體的長(zhǎng)強(qiáng)穴；非經(jīng)非穴位于小鼠肛門(mén)與尾根之間凹陷處旁開(kāi)1 cm左右的位置。針刺治療時(shí)使用0.5寸毫針直刺，得氣后，使用提插捻轉(zhuǎn)手法，持續(xù)1 min，連續(xù)干預(yù)6 d后重復(fù)進(jìn)行避暗實(shí)驗(yàn)、跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)和曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)用（）表示，并采用t檢驗(yàn)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行比較分析。以P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P＜0.01為有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 基因鑒定

小鼠經(jīng)基因鑒定，當(dāng)只在800 bp位置出現(xiàn)條帶時(shí)，為純合的C57BL/6 FMR1基因敲除小鼠；當(dāng)只在468 bp的位置出現(xiàn)條帶時(shí)，為野生的C57BL/6小鼠；而當(dāng)在兩個(gè)位置都出現(xiàn)條帶的時(shí)候，為雜合的C57BL/6小鼠。

2.2 避暗實(shí)驗(yàn)

在連續(xù)3 d的避暗實(shí)驗(yàn)中，兩組小鼠的潛伏期均呈上升的趨勢(shì)、電擊次數(shù)均呈下降趨勢(shì)，而在第3天的避暗實(shí)驗(yàn)中，WT組小鼠的潛伏期大于KO組（P＜0.05），WT組小鼠的電擊次數(shù)低于KO組（P＜0.01）。見(jiàn)表 2。

表2 避暗實(shí)驗(yàn)的潛伏期和電擊次數(shù)（，n=20）

表2 避暗實(shí)驗(yàn)的潛伏期和電擊次數(shù)（，n=20）

注：與WT組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

組別第1天 第2天 第3天潛伏期/s 電擊次數(shù)/次 潛伏期/s 電擊次數(shù)/次 潛伏期/s 電擊次數(shù)/次KO 39.00±6.86 8.00±1.49 96.80±15.27 6.80±1.23 148.00±20.78* 6.60±1.81**WT 44.60±11.22 7.00±0.81 103.60±15.27 5.40±1.07 187.60±78.48 4.20±1.23

2.3 跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)

在跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)中，KO組小鼠的潛伏期及錯(cuò)誤次數(shù)均高于WT組（P＜0.05）。見(jiàn)表3。

表3 跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)的潛伏期和錯(cuò)誤次數(shù)（，n=20）

表3 跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)的潛伏期和錯(cuò)誤次數(shù)（，n=20）

注：與WT組比較，*P＜0.05。

組別 潛伏期/s 錯(cuò)誤次數(shù)/次KO 177.60±117.37* 1.60±1.17*WT 76.20±90.81 0.40±0.97

2.4 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)

在曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)中，WT組小鼠的平均速度明顯高于KO組小鼠（P＜0.01）；WT組小鼠在中央?yún)^(qū)域停留的時(shí)間高于KO組小鼠（P＜0.05）。見(jiàn)表4。

表4 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)中的平均速度和中央?yún)^(qū)域停留時(shí)間（ ，n=20）

表4 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)中的平均速度和中央?yún)^(qū)域停留時(shí)間（ ，n=20）

注：與WT組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

組別 平均速度/（mm·s-1） 中央?yún)^(qū)域停留時(shí)間/s KO 53.04±17.09** 33.24±19.98*WT 80.51±16.46 50.67±32.15

2.5 針刺干預(yù)

在以上行為學(xué)實(shí)驗(yàn)后，將C57BL/6 FMR1基因敲除小鼠分成長(zhǎng)強(qiáng)穴組和非經(jīng)非穴組，行針刺干預(yù)6 d，再次進(jìn)行行為學(xué)實(shí)驗(yàn)。

2.5.1 避暗實(shí)驗(yàn)在避暗實(shí)驗(yàn)中，長(zhǎng)強(qiáng)穴組小鼠的潛伏期高于非經(jīng)非穴組、電擊次數(shù)低于非經(jīng)非穴組，且均存在顯著性差異（P＜0.05）。見(jiàn)表5。

表5 針刺干預(yù)后的避暗潛伏期和電擊次數(shù)（，n=10）

表5 針刺干預(yù)后的避暗潛伏期和電擊次數(shù)（，n=10）

注：與非經(jīng)非穴組比較，*P＜0.05。

組別 潛伏期/s 電擊次數(shù)/次長(zhǎng)強(qiáng)穴組 167.50±19.84* 5.60±1.35*非經(jīng)非穴組 147.30±19.55 6.20±1.81

2.5.2 跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)在跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)中，長(zhǎng)強(qiáng)穴組小鼠的潛伏期和錯(cuò)誤次數(shù)均低于非經(jīng)非穴組，且潛伏期存在顯著性差異（P＜0.05）。見(jiàn)表6。

表6 針刺干預(yù)后的潛伏期和錯(cuò)誤次數(shù)（，n=10）

表6 針刺干預(yù)后的潛伏期和錯(cuò)誤次數(shù)（，n=10）

注：與非經(jīng)非穴組比較，*P＜0.05。

組別 潛伏期/s 錯(cuò)誤次數(shù)/次長(zhǎng)強(qiáng)穴組 140.40±94.53* 1.40±0.97非經(jīng)非穴組 177.70±117.21 1.50±1.27

2.5.3 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)在曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)中，長(zhǎng)強(qiáng)穴組小鼠的平均速度和中央?yún)^(qū)域停留時(shí)間均高于非經(jīng)非穴組，且平均速度存在顯著性差異（P＜0.05）。見(jiàn)表7。

表7 針刺干預(yù)后的平均速度和中央?yún)^(qū)域停留時(shí)間（ ，n=10）

表7 針刺干預(yù)后的平均速度和中央?yún)^(qū)域停留時(shí)間（ ，n=10）

注：與非經(jīng)非穴組比較，*P＜0.05。

組別 平均速度/（mm·s-1） 中央?yún)^(qū)域停留時(shí)間/s長(zhǎng)強(qiáng)穴組 57.90±17.64* 37.22±23.23非經(jīng)非穴組 53.38±16.85 34.22±19.32

3 結(jié)論

C57BL/6 FMR1基因敲除小鼠即以正常近交系C57BL/6小鼠為背景，利用基因敲除技術(shù)將X染色體上的FMR1基因定點(diǎn)滅活制備而成的動(dòng)物模型，主要表現(xiàn)為智力低下、行為異常、運(yùn)動(dòng)能力的缺失和記憶力缺失，是理想的腦卒中后遺癥和腦癱等疾病的動(dòng)物模型［6-7］。

避暗實(shí)驗(yàn)是利用小鼠天生具有的趨暗避明的習(xí)性而設(shè)計(jì)，主要是通過(guò)統(tǒng)計(jì)小鼠潛伏期和電擊次數(shù)來(lái)判斷小鼠的學(xué)習(xí)和記憶能力［8］。在本實(shí)驗(yàn)中，兩組小鼠的潛伏期和錯(cuò)誤次數(shù)在第3天的避暗實(shí)驗(yàn)中均存在顯著性差異（P＜0.05），說(shuō)明FMR1基因?qū)τ洃浟椭橇Υ嬖诘挠绊?，WT組小鼠的學(xué)習(xí)和記憶能力明顯高于KO組小鼠。在跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)中WT組小鼠的潛伏期和錯(cuò)誤次數(shù)均低于KO組（P＜0.05），說(shuō)明KO組小鼠對(duì)空間位置辨知的學(xué)習(xí)記憶能力明顯低于WT組。曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)是研究小鼠自發(fā)運(yùn)動(dòng)和探索行為的經(jīng)典行為學(xué)實(shí)驗(yàn)。在曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)中，WT組小鼠的平均速度大于KO組小鼠，且存在顯著性差異（P＜0.01），說(shuō)明KO組小鼠的運(yùn)動(dòng)能力受到了影響；在中央?yún)^(qū)域的探索時(shí)間對(duì)比中，WT組也高于KO組小鼠（P＜0.05），說(shuō)明KO組小鼠的趨避性下降、對(duì)環(huán)境的認(rèn)知能力減弱。通過(guò)針刺長(zhǎng)強(qiáng)穴治療后，在避暗實(shí)驗(yàn)中，長(zhǎng)強(qiáng)穴組小鼠的潛伏期高于非經(jīng)非穴組、電擊次數(shù)低于非經(jīng)非穴組，且都存在顯著性差異（P＜0.05）；在跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)中，長(zhǎng)強(qiáng)穴組的潛伏期有顯著降低（P＜0.05）；在曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)中，長(zhǎng)強(qiáng)穴組小鼠的平均速度有顯著升高（P＜0.05）。C57BL/6小鼠作為 C57BL/6 FMR1基因敲除小鼠的源生小鼠，在行為學(xué)實(shí)驗(yàn)中，KO組小鼠主要受到FMR1基因敲除影響，其學(xué)習(xí)記憶能力和運(yùn)動(dòng)能力明顯低于WT組小鼠。

臨床研究表明，在經(jīng)過(guò)治療和干預(yù)后，大約有75%急性腦卒中患者遺留有不同程度殘疾，這不僅給患者的家庭以及社會(huì)造成巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，同時(shí)對(duì)患者的機(jī)體和心理健康也造成嚴(yán)重的影響［9-10］。而急性腦卒中在經(jīng)過(guò)有效的治療后也容易遺留后遺癥，如肢體障礙或言語(yǔ)障礙等，自理能力也明顯被削弱［11］。C57BL/6 FMR1基因敲除小鼠的主要表現(xiàn)癥狀與急性腦卒中和腦癱等疾病的后遺癥相似，在針刺長(zhǎng)強(qiáng)穴治療后，通過(guò)避暗實(shí)驗(yàn)、跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)和曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)等行為學(xué)實(shí)驗(yàn)的對(duì)比實(shí)驗(yàn)表明：C57BL/6 FMR1基因敲除小鼠是理想的腦癱、腦卒中后遺癥等疾病康復(fù)的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，并且針刺治療對(duì)其有顯著的改善效果。