硅藻定量檢驗(yàn)和種屬鑒定的實(shí)驗(yàn)研究

楊麗

摘要：硅藻檢驗(yàn)在診斷溺死方面是一種相對(duì)可靠的方法。本文簡述了硅藻檢驗(yàn)在死因診斷中的應(yīng)用，通過對(duì)其檢驗(yàn)方法進(jìn)行優(yōu)缺點(diǎn)的探討，對(duì)檢驗(yàn)中的問題以及發(fā)展的方向進(jìn)行了分析，以期對(duì)鑒定溺死提供借鑒。

關(guān)鍵詞：硅藻;溺死;檢驗(yàn);種屬

藻檢驗(yàn)可以為尸體死因以及死亡的方式提供有力的依據(jù)，是當(dāng)前診斷溺死的一個(gè)重要的檢驗(yàn)方法，在對(duì)污染進(jìn)行了嚴(yán)格控制的前提下，硅藻檢驗(yàn)可以作為診斷溺死的金標(biāo)準(zhǔn)[1-2]。

1硅藻的生物學(xué)特征

硅藻屬于單細(xì)胞藻類，在自然界的水域中廣泛存在。硅藻種類繁多，各種藻類在水體中的分布會(huì)隨著環(huán)境的不同呈現(xiàn)出種群上的差異，同時(shí)還會(huì)受到溫度、季節(jié)以及光照等因素的影響。硅藻細(xì)胞的直徑一般為1-600μm之間，體積差異非常明顯。硅藻相對(duì)于其他藻類，有其自身的特殊性：首先是硅藻體外有一層硅質(zhì)殼，是由果膠和硅質(zhì)組成，由細(xì)胞壁硅質(zhì)化生成;其次是不同種類的硅藻有不同的標(biāo)志性特點(diǎn)，可以依據(jù)硅藻形態(tài)及紋飾上的區(qū)別來對(duì)其進(jìn)行區(qū)分[3-4]。

2硅藻的檢驗(yàn)方法

目前在硅藻檢驗(yàn)時(shí)，其方法可以大致分成三個(gè)類型，即化學(xué)元素法、消化法和DNA檢測法。

2.1化學(xué)元素法

這種方法采用紫外線的方式，激發(fā)硅藻體內(nèi)的葉綠素a產(chǎn)生出一定量的熒光，由此計(jì)算出浮游生物的總體含量。這種檢測方法成本低，對(duì)環(huán)境等的污染比較小，且操作非常簡單。

2.2無機(jī)消化法

在早期對(duì)硅藻進(jìn)行檢測有一系列方法，例如有離心法、浸漬法、焚燒法等，而1937年由Kasparek創(chuàng)建的濃硝酸法則成為了無機(jī)消化法的基礎(chǔ)。在此基礎(chǔ)上，又出現(xiàn)了許多新的檢測方法，例如，采用微波加熱和可以控制壓力的消解罐可以組成微波消解儀，研發(fā)人員由此研發(fā)了微波消解掃描電鏡聯(lián)用法，這種方法能夠讓有機(jī)物能夠更好地被消解，對(duì)于硅藻檢出率有了較大的提高，得到了廣泛地使用。但是這種檢驗(yàn)的成本是比較高的，檢驗(yàn)的周期較長，對(duì)于技術(shù)人員的專業(yè)技能要求較高，難以在基層進(jìn)行推廣和應(yīng)用。王玉仲等[5]對(duì)此方法進(jìn)行了優(yōu)化，將濾膜透明化，即可在普通的顯微鏡下來觀察硅藻，讓檢測成本大幅下降。

2.3有機(jī)消化法

有機(jī)消化法在檢測的過程中對(duì)于硅藻的破壞較小，可以保留硅藻的核酸物質(zhì)，后期可以對(duì)硅藻進(jìn)行各項(xiàng)分子生物學(xué)方面的檢測，但是其消化環(huán)節(jié)還需要進(jìn)行進(jìn)一步的優(yōu)化。有機(jī)消化的方式有兩種：一是適用于檢測淡水中硅藻的Soluene-350法，同時(shí)添加超聲波加熱的環(huán)節(jié)能夠?qū)⒃囼?yàn)時(shí)間縮短;二是利用酶來進(jìn)行消化的方法，其方法在檢測過程中采用了SDS和蛋白酶K來對(duì)組織進(jìn)行酶消化，能夠檢測出樣品當(dāng)中的硅藻和一些浮游生物，同時(shí)不會(huì)對(duì)硅藻進(jìn)行較大程度的破壞。

2.4分子生物學(xué)檢驗(yàn)方法

何方鋼等[6]研究表明，對(duì)硅藻的16SrDNA進(jìn)行檢測，能夠?yàn)榘讣心缢赖牡攸c(diǎn)提供重要的依據(jù);zhao等[7]利用對(duì)硅藻18SrDNA的部分區(qū)域進(jìn)行測序，進(jìn)而對(duì)硅藻進(jìn)行分類，為工作人員判斷溺水者的溺水位置提供依據(jù);采用PCR-DHPLC法來對(duì)硅藻進(jìn)行檢測，能夠確定硅藻的種類，與消化檢測法相比，其檢出率更高，同時(shí)對(duì)于樣品量的需求更低。

rbcL基因是控制葉綠體進(jìn)行光合作用的關(guān)鍵基因，因此檢測rbcL基因在推斷溺死地點(diǎn)的工作中也有較好的開發(fā)前景。Kathleen[8]等針對(duì)rbcLjiyin 開發(fā)了相關(guān)引物，檢測出了許多找見的硅藻。

3檢測中存在的問題及展望

3.1硅藻種屬的判斷

將消化檢測法和對(duì)硅藻進(jìn)行形態(tài)學(xué)上的觀測進(jìn)行結(jié)合，就能夠?qū)柙宓木唧w種類進(jìn)行判斷。但是消化法在檢測過程中會(huì)對(duì)后續(xù)的形體觀察造成一定程度的影響。例如在進(jìn)行無機(jī)消化的過程中，會(huì)對(duì)硅藻的具體形態(tài)造成破壞，而有機(jī)消化則可能會(huì)對(duì)樣品的消化不完全，導(dǎo)致一些硅藻被掩藏而遺漏這部分硅藻。

3.2硅藻的定量檢測

在具體的檢測過程中，尸體的各個(gè)器官中硅藻含量的檢測對(duì)于溺死的定性來說非常關(guān)鍵，但是目前實(shí)行的檢測在實(shí)際工作中存在一些困難。例如在消化法中，由于無機(jī)消化的過程造成了硅藻的破壞，一些破碎的硅藻難以被統(tǒng)計(jì)，同時(shí)若采用肉眼觀察的方法，則可能會(huì)產(chǎn)生人為誤差，對(duì)于硅藻數(shù)量的統(tǒng)計(jì)會(huì)與真實(shí)值產(chǎn)生一定的差異。而在有機(jī)消化的過程中對(duì)樣品的消化不完全，因此在進(jìn)行數(shù)量統(tǒng)計(jì)時(shí)可能會(huì)造成遺漏。如何在保證硅藻形態(tài)完整性的情況下建立起掃描統(tǒng)計(jì)將成為后續(xù)發(fā)展的方向。

3.3硅藻的DNA檢測方法

分子生物學(xué)檢測在未來有著良好的發(fā)展前景：首先目前對(duì)于硅藻的檢測大部分是檢測共性DNA，下一步可以開發(fā)種屬特異性的檢測方法;其次由于溺死的尸體中DNA可能會(huì)降解，因此改良硅藻DNA提取和純化的發(fā)展，提高DNA的檢出率也是將來的發(fā)展方向。

4小結(jié)

硅藻檢驗(yàn)在應(yīng)用中有非常大的意義，目前這種方法檢測的成本較高，對(duì)于專業(yè)技術(shù)人員的要求高，檢驗(yàn)時(shí)間較長，且存在檢驗(yàn)的方法不成熟，造成環(huán)境污染等問題，但是這種方法已經(jīng)成為相關(guān)部門的一種重要檢測方法，能夠?yàn)榘讣膫赊k提供證據(jù)和線索，因此后續(xù)需要對(duì)這種檢測技術(shù)進(jìn)行優(yōu)化和完善。

參考文獻(xiàn)：

[1]. 小泉格， 王開發(fā)與郭蓄民， 硅藻. 1984： 地質(zhì)出版社.

[2]. 王玉仲，趙建，李鵬，等. 三種硅藻檢驗(yàn)方法比較[J]. 南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2015，35（3）：427-431.

[3] 何方剛，黃代新，劉良，等 .PCR-DGGE 法檢測浮游生物16S rDNA 在溺死鑒定中的應(yīng)用[J]. 中國法醫(yī)學(xué)雜志， 2008（4）：234-237.

課題項(xiàng)目：2020年度校級(jí)中青年科研基金項(xiàng)目，安徽省內(nèi)長江流域硅藻分布及其變化規(guī)律的研究（課題編號(hào)WK202004）F25EF4B3-26D4-4962-84E2-F4964BD4C901