王蕊,何玉秀

(1.河南師范大學(xué) 體育學(xué)院,河南 新鄉(xiāng) 453007;2.河北師范大學(xué) 體育學(xué)院,石家莊 050024)

肥胖是一個(gè)重要的公共衛(wèi)生問題，與人們飲食類型的改變和缺乏體育鍛煉有關(guān)[1].2006至2015年4次《中國(guó)健康與營(yíng)養(yǎng)調(diào)查》結(jié)果顯示，成人總體上超重率男性高于女性，肥胖率則是女性高于男性[2].女性作為母親的社會(huì)角色，其健康狀況關(guān)系到家庭和諧幸福及社會(huì)整體的健康水平[3].從中國(guó)居民健康代際傳遞作用的程度看，女性也高于男性[4].母體高脂膳食可通過改變代謝表型影響子代[5]，也可通過子宮內(nèi)炎癥影響子代肝臟脂肪代謝[6]，增加子代脂肪肝病的患病風(fēng)險(xiǎn)，因此解決女性健康問題有利于提高我國(guó)的全民健康水平.

能量過剩會(huì)使過量脂肪異位沉積于肝臟等非脂肪組織，從而導(dǎo)致肝臟脂肪變性.脂肪肝通常被認(rèn)為是一種良性病變，但可發(fā)展為脂肪性肝炎.這是肝硬化等嚴(yán)重肝臟疾病的先兆[7].肝臟內(nèi)除肝細(xì)胞外還含有大量的巨噬細(xì)胞，據(jù)估計(jì)健康的嚙齒小鼠體內(nèi)每100個(gè)肝細(xì)胞中就有20～40個(gè)巨噬細(xì)胞[8]，因此，巨噬細(xì)胞在肝臟炎癥轉(zhuǎn)變的過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[9].

體育鍛煉能有效改善肝臟脂肪變性，從而預(yù)防和改善脂肪肝的發(fā)展[10-11]，但家庭照料會(huì)明顯影響女性參與運(yùn)動(dòng)的行為[12].高強(qiáng)度間歇訓(xùn)練(high intensity interval training，HIIT)指在“短時(shí)間高強(qiáng)度訓(xùn)練之間穿插低強(qiáng)度訓(xùn)練或休息”，能提高機(jī)體心血管適能、增加胰島素敏感性和降體脂[13-15]，且在節(jié)省時(shí)間和某些效果方面優(yōu)于傳統(tǒng)的中等強(qiáng)度持續(xù)訓(xùn)練(moderate intensity continuous training，MICT)[16-18].因此，本文觀測(cè)小鼠肝臟組織形態(tài)學(xué)和炎癥狀態(tài)的變化，比較HIIT和MICT兩種運(yùn)動(dòng)方式對(duì)肝臟巨噬細(xì)胞影響的差異，為脂肪肝患者運(yùn)動(dòng)處方的制訂提供可參考的依據(jù).

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與分組

采用3周齡雌性C57BL/6J小鼠，體質(zhì)量(9.62±1.04)g，購自北京維通利華公司.自然光照，自由飲水，飼養(yǎng)溫度(26±2)℃，濕度45%～55%.根據(jù)飲食方式隨機(jī)分為高脂膳食組(90只)和普通膳食組(CON，10只)，膳食飼料脂肪供能比，普通飼料約14%，高脂飼料約38%.

15周后，從高脂膳食組篩選出體質(zhì)量超過CON組均值10%的小鼠30只，隨機(jī)分為高脂對(duì)照組(HFD),中等強(qiáng)度持續(xù)訓(xùn)練組(MICT)和高強(qiáng)度間歇訓(xùn)練組(HIIT)，每組10只，繼續(xù)高脂喂養(yǎng).但MICT和HIIT組小鼠進(jìn)行運(yùn)動(dòng)干預(yù)，5次/周，共12周.

1.2 運(yùn)動(dòng)干預(yù)方案

運(yùn)動(dòng)干預(yù)前，每只小鼠均進(jìn)行3 d適應(yīng)性運(yùn)動(dòng).隨后每2周進(jìn)行一次跑臺(tái)速度測(cè)試，確定跑速后推測(cè)最大攝氧量(VO2peak)[19].初始速度為7 m/min，上坡25°，每2 min為一級(jí)，以每級(jí)2 m的速度遞增，直到小鼠在驅(qū)趕下不能完成測(cè)試為止.以測(cè)試速度的前一級(jí)速度作為HIIT組高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)速度(約90%～100%VO2peak)，以此速度對(duì)應(yīng)的60%VO2peak計(jì)算中等強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)速度，詳見表1.HFD：無運(yùn)動(dòng)干預(yù)，安靜對(duì)照，自由活動(dòng).MICT：運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度約60%VO2peak，每次持續(xù)45 min，5次/周.HIIT：1 min高強(qiáng)(90%～100%VO2peak)+2 min低強(qiáng)度(60%VO2peak),每次運(yùn)動(dòng)距離與MICT相同，5次/周.

表1 小鼠12周內(nèi)HIIT和MICT組小鼠運(yùn)動(dòng)速度

1.3 樣本采集及測(cè)試指標(biāo)

MICT和HIIT組小鼠最后一次運(yùn)動(dòng)48 h后，與HFD和CON組一起取材.取材前禁食12 h，稱體質(zhì)量、麻醉、測(cè)體長(zhǎng)，內(nèi)眥取血.用DEPC處理水注入左心室進(jìn)行灌流，待肝臟變蒼白后，取肝臟尾狀葉做形態(tài)學(xué)檢測(cè)，其他部位液氮冷凍后-80 ℃保存待用.

1)形態(tài)學(xué)觀察：肝臟尾狀葉部分用石蠟包埋做HE染色，部分冰凍切片做油紅O染色.

2)生化指標(biāo)測(cè)定：稱取適量肝組織勻漿后，按照試劑盒說明書(南京建成)進(jìn)行甘油三酯(triglyceride，TG),總膽固醇(total cholesterol，TC),谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase，ALT),谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase，AST)活力檢測(cè)，采用BCA蛋白質(zhì)量濃度測(cè)試小鼠肝臟蛋白質(zhì)量濃度.

3)實(shí)時(shí)熒光定量PCR和蛋白表達(dá):在NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行目的基因全序列查找目的基因序列或基因ID，通過Primer Bank查找相應(yīng)引物序列，引物信息如下表2.Trizol提取肝組織總RNA,按照TaKaRa-RNA定量和反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行操作，在LightCycler?96實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上，按程序進(jìn)行擴(kuò)增和熒光定量檢測(cè).數(shù)據(jù)處理以β-actin為內(nèi)參,采用2-ΔΔCT方法分析目的基因的相對(duì)表達(dá)量.

表2 基因引物序列

取肝組織約50 mg，液氮研磨，放入預(yù)先加好RIPA裂解液和蛋白酶抑制劑的EP管中，4 ℃冰箱靜置120 min，4 ℃低溫離心機(jī)12 000 r/min 10 min取上清.用BCA試劑盒測(cè)定樣品蛋白濃度，并根據(jù)每樣1.5 g/L稀釋分裝，加上樣緩沖液制成樣品，放沸水煮5 min后-20 ℃保存.SDS-PAGE凝膠電泳(先80 V,40 min，再120 V,1 h)，采用PVDF轉(zhuǎn)膜(300 mA，1.5 h)，封閉(5%脫脂奶粉液，1 h)，一抗孵育(搖床20 min后4 ℃冰箱過夜).次日，洗膜，二抗孵育(室溫2 h)，再次洗膜，顯影(ECL化學(xué)發(fā)光工作液)，成像(FUSION FX系統(tǒng))，用Image-J軟件進(jìn)行分析，計(jì)算目的蛋白相對(duì)表達(dá)量.

實(shí)驗(yàn)用到的一抗抗體為TNF-α(tumor necrosis factor-α)(Abcam ab6671，25～35 ku，1∶2 000)，IL-10(Affinity DF6894，20～35 ku，1∶2 000)，β-actin(Bioworld bs6007m，40～45 ku，1∶5 000).

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析.實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，普通膳食組(CON)和高脂膳食組(HFD)采用獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)；高脂膳食組(HFD),MICT,HIIT采用單因素方差分析后進(jìn)行組間比較.

2 結(jié) 果

2.1 體質(zhì)量變化

經(jīng)過15周膳食和12周運(yùn)動(dòng)干預(yù)后，HFD組小鼠體質(zhì)量明顯高于CON組，MICT和HIIT運(yùn)動(dòng)干預(yù)均降低小鼠體質(zhì)量，但兩組間無顯著性差異，見圖1.

2.2 肝臟內(nèi)脂質(zhì)含量變化

肝組織內(nèi)脂質(zhì)含量指單位質(zhì)量蛋白質(zhì)含有脂質(zhì)的物質(zhì)的量(表3).與CON組相比，HFD組小鼠肝臟TG含量明顯增加(P<0.01).與HFD組相比，MICT和HIIT運(yùn)動(dòng)干預(yù)均降低小鼠肝組織TG含量，但只有HIIT組有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05).肝組織TC含量在各組間無顯著性差異.

表3 肝臟組織脂質(zhì)含量(n=8)

肝組織形態(tài)學(xué)(20×10)觀察，HE染色顯示：CON組肝細(xì)胞核呈藍(lán)色，大而圓，肝小葉形態(tài)完整；HFD組肝組織內(nèi)有空泡，細(xì)胞呈氣球樣變，提示肝細(xì)胞脂肪變性；兩個(gè)運(yùn)動(dòng)組肝組織內(nèi)空泡減少，HIIT組比MICT組明顯.油紅O染色顯示：肝組織內(nèi)紅色脂滴，HFD組明顯多于CON組，MICT和HIIT運(yùn)動(dòng)均能減少肝內(nèi)脂滴，HIIT組優(yōu)于MICT組.

2.3 肝損傷指標(biāo)

肝臟內(nèi)ALT與AST含量豐富，是參與糖和蛋白質(zhì)代謝的必需酶，可作為診斷肝組織損傷及程度的重要指標(biāo).與CON組相比，HFD組小鼠肝臟組織ALT,AST活力明顯增加(P<0.01)，提示肝組織有損傷.與HFD組相比，MICT組和HIIT組小鼠因運(yùn)動(dòng)干預(yù)肝組織內(nèi)ALT,AST活力降低，且HIIT優(yōu)于MICT，見表4.

表4 肝臟組織酶活力(n=8)

2.4 肝組織巨噬細(xì)胞表型變化

肝臟巨噬細(xì)胞通常認(rèn)為有M1和M2表型，M1型發(fā)揮促炎作用，M2型具有抗炎修復(fù)作用，兩者在功能、基因表達(dá)譜和代謝方面有區(qū)別.M1常用的標(biāo)記物為TNF-α，iNOS(inducible nitric oxide synthase)和IL-6(interleukin-6)，M2的標(biāo)記物為Ym1(chitinase 3-like 3),Arg1(Arginase1)和IL-10(Interleukin-10).由表5可知，與CON組相比，HFD組小鼠肝組織內(nèi)M1巨噬細(xì)胞相關(guān)基因(IL-6,INOS,TNF-α)相對(duì)表達(dá)量非常顯著增加(P<0.01)，M2巨噬細(xì)胞相關(guān)基因(Arg1,YM1,IL-10)相對(duì)表達(dá)量下降非常顯著(P<0.01).高脂膳食小鼠結(jié)合HIIT和MICT運(yùn)動(dòng)干預(yù)后，肝組織M1巨噬細(xì)胞相關(guān)基因(IL-6,INOS,TNF-α)相對(duì)表達(dá)量顯著下降，但只有TNF-α表達(dá)量在兩組間有顯著性差異(P<0.05)；M2巨噬細(xì)胞相關(guān)基因(Arg1，YM1，IL-10)表達(dá)明顯增高，HIIT組優(yōu)于MICT組.以上結(jié)果提示：HIIT和MICT使高脂膳食小鼠肝組織巨噬細(xì)胞M1表型減少，M2表型增加，HIIT效果更好.

表5 巨噬細(xì)胞不同表型基因表達(dá)變化

2.5 肝組織炎癥TNF-α和IL-10蛋白表達(dá)的變化

與CON組相比，HFD組小鼠肝組織內(nèi)TNF-α蛋白表達(dá)水平顯著增高(P<0.01)，IL-10蛋白相對(duì)表達(dá)水平顯著下降(P<0.01).與HFD組相比，高脂膳食小鼠結(jié)合HIIT和MICT運(yùn)動(dòng)干預(yù)后肝組織TNF-α蛋白表達(dá)水平顯著下降，HIIT組優(yōu)于MICT組(P<0.05)；肝組織IL-10蛋白表達(dá)水平在MICT組具有顯著上升(P<0.05)，在HIIT組具有非常顯著水平(P<0.01)，但MICT和HIIT組無顯著性差異，見表6和圖3.

表6 肝臟TNF-α,IL-10蛋白表達(dá)變化

3 討 論

長(zhǎng)期高脂膳食促使體內(nèi)脂肪含量增加，其不僅儲(chǔ)存在脂肪細(xì)胞內(nèi)[20]，也可沉積于非脂肪細(xì)胞.肝臟是脂質(zhì)代謝的重要臟器，肝細(xì)胞內(nèi)過量脂肪堆積會(huì)導(dǎo)致脂肪變性和肝組織炎癥狀態(tài).鐘立等[21]認(rèn)為C57BL/6J小鼠在42%的高脂膳食喂養(yǎng)下，4月后開始出現(xiàn)肝細(xì)胞氣球樣變和肝小葉內(nèi)炎癥狀態(tài)，8月后進(jìn)入明確的非酒精脂肪肝炎階段.本研究對(duì)照組雌性小鼠為單純高脂膳食喂養(yǎng)，27周后體質(zhì)量增加，肝內(nèi)TG聚積，肝組織切面脂滴量增加，肝細(xì)胞發(fā)生脂肪變性，同時(shí)肝組織損傷標(biāo)志物ALT與AST上升.

有氧運(yùn)動(dòng)即使在未改變體質(zhì)量的情況下也能減少肝內(nèi)脂質(zhì)含量[22]，但運(yùn)動(dòng)量和強(qiáng)度對(duì)肝臟脂質(zhì)的最佳益處缺乏共識(shí).KEATING等[23]將超重/肥胖成年人隨機(jī)分為3組進(jìn)行運(yùn)動(dòng)干預(yù)8周，即中低強(qiáng)度高運(yùn)動(dòng)量組(50%VO2peak，60 min，4 d/周)、高強(qiáng)度低運(yùn)動(dòng)量組(70%VO2peak，45 min，3 d/周)、中低強(qiáng)度低運(yùn)動(dòng)量組(50%VO2peak，45 min，3 d/周)，結(jié)果顯示3組運(yùn)動(dòng)均減少肝臟脂肪，但有氧運(yùn)動(dòng)的量和強(qiáng)度對(duì)肝內(nèi)脂肪減少的效果沒有差異.而NATH[24]認(rèn)為6個(gè)月的中等強(qiáng)度(3.6METs)比低強(qiáng)度(2.1METs)運(yùn)動(dòng)，更能改善非酒精性脂肪肝病(Non-alcohol Fatty Liver Disease，NAFLD)患者肝臟脂肪變性.WINN等[25]將18名肥胖成年人隨機(jī)分為HIIT組(4 min，80 %VO2peak+3 min，50%VO2peak)和MICT組(50%VO2peak，60 min)，兩組運(yùn)動(dòng)中能量消耗相同，4周干預(yù)后HIIT和MICT均減少肝內(nèi)脂質(zhì)，兩者無顯著性差異.CHO[26]用高脂飼料喂養(yǎng)C57BL/6小鼠8周后，再結(jié)合8周的MICT(45 min，10 m/min)或HIIT(12組(1 min，17 m/min)+(2 min，10 m/min)).兩組小鼠每次運(yùn)動(dòng)距離相同.結(jié)果顯示HIIT在減輕肝臟脂肪變性方面優(yōu)于MICT.本研究雌性小鼠在高脂喂養(yǎng)15周后，膳食不變情況下進(jìn)行12周的MICT或HIIT運(yùn)動(dòng)，小鼠體質(zhì)量和肝組織TG含量下降明顯，與MICT相比，HIIT能明顯降低肝組織TG含量、改善肝損傷，并且HIIT組每次運(yùn)動(dòng)時(shí)間減少為MICT組的20%(36 min v.s. 45 min)，HIIT量效關(guān)系更優(yōu).綜上推測(cè)，對(duì)于長(zhǎng)期高脂膳食的人群或NAFLD患者進(jìn)行個(gè)體化運(yùn)動(dòng)處方制定時(shí)，運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度可作為考慮的重要因素.

在NAFLD的發(fā)展過程中，巨噬細(xì)胞起核心作用[27]，肝細(xì)胞內(nèi)過多的脂肪堆積導(dǎo)致細(xì)胞死亡，釋放損傷相關(guān)分子模式(DAMPS)，觸發(fā)巨噬細(xì)胞活化，促使組織產(chǎn)生炎癥[28].HUANG[29]在高脂飲食的C57BL/6J小鼠肝臟內(nèi)檢測(cè)到T輔助細(xì)胞1和M1巨噬細(xì)胞增加，如果用氯膦酸脂質(zhì)體去除巨噬細(xì)胞可保護(hù)小鼠免于脂肪變性的發(fā)生.本研究雌性小鼠高脂膳食喂養(yǎng)后，肝組織巨噬細(xì)胞相關(guān)基因的表達(dá)結(jié)果顯示M1表型增加，M2表型降低.其機(jī)制可能是巨噬細(xì)胞p38絲裂原活化蛋白誘導(dǎo)M1巨噬細(xì)胞極化和促炎因子分泌[30]，也可能是過載脂肪的肝細(xì)胞或巨噬細(xì)胞釋放超微小泡可活化NLRP3炎癥小體造成肝組織炎癥的發(fā)生[31].

運(yùn)動(dòng)能減少機(jī)體組織的巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)狀態(tài).就脂肪組織而言，KAWANISH在2010-2015年間發(fā)現(xiàn)運(yùn)動(dòng)可以減少高脂膳食的雄性C57BL/6J小鼠附睪周圍脂肪組織內(nèi)M1巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)[32-34].賀強(qiáng)等[35]發(fā)現(xiàn)db/db小鼠4周游泳訓(xùn)練(60 min/d，5 d/周)后附睪周圍脂肪組織內(nèi)M1巨噬細(xì)胞數(shù)量下降，M2巨噬細(xì)胞數(shù)量上升.關(guān)于持續(xù)運(yùn)動(dòng)和間歇運(yùn)動(dòng)對(duì)巨噬細(xì)胞的影響差異，KOLAHDOUZI等[36]將高脂膳食的雄性Wistar大鼠，分為持續(xù)運(yùn)動(dòng)組和有氧間歇組，間歇運(yùn)動(dòng)組的高強(qiáng)度≥85%VO2peak，兩組每次運(yùn)動(dòng)距離相等，5次/周，10周干預(yù)后，有氧間歇運(yùn)動(dòng)減少腹膜內(nèi)脂肪組織炎性M1巨噬細(xì)胞和增加M2巨噬細(xì)胞的效果更明顯.運(yùn)動(dòng)對(duì)肝臟組織內(nèi)巨噬細(xì)胞的影響，AI[37]采用8周的下坡跑離心運(yùn)動(dòng)(-5°，1 h/d，6 d/周)與限制熱量飲食相結(jié)合，可以明顯抑制高脂膳食小鼠肝臟M1巨噬細(xì)胞生成并促進(jìn)M2巨噬細(xì)胞表型形成，從而改善NAFLD.因此，本研究HIIT與MICT相比，能明顯減低肝組織TG含量和改善肝損傷，可能與HIIT運(yùn)動(dòng)時(shí)高強(qiáng)度達(dá)到90%～100%VO2peak，小鼠肝臟巨噬細(xì)胞的表型變化有關(guān)，即M1表型明顯減少，M2表型明顯增加.

巨噬細(xì)胞通常分為MI和M2兩種表型，M1表型產(chǎn)生TNF-α,iNOS和IL-6等細(xì)胞因子[38]，能引起組織胰島素抵抗和炎癥；M2表型產(chǎn)生Arg1,IL-10等細(xì)胞因子[39]，可發(fā)揮清除炎癥和組織修復(fù)功能.M1型巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的炎癥因子TNF-α等在促進(jìn)肝臟炎癥和纖維化過程中發(fā)揮重要作用，TNF-α水平與脂肪變性程度、肝硬化和NAFLD肝纖維化評(píng)分顯著相關(guān)[40]，肥胖誘導(dǎo)產(chǎn)生的TNF可導(dǎo)致肝臟炎癥和致癌轉(zhuǎn)錄因子STAT3的激活[41].POTOUPNI等[42]用Meta分析納入56篇文獻(xiàn)，共有1 634名對(duì)照組和4 214名NAFLD患者，發(fā)現(xiàn)NAFLD患者血清TNF-α水平高于對(duì)照組，且水平高低與病情嚴(yán)重程度正相關(guān).TNF-α介導(dǎo)的肝損傷主要通過TNF-受體-1(TNFR1)信號(hào)發(fā)生，WANDRER等[43]用HFD喂養(yǎng)TNFR1基因敲入小鼠32周，然后進(jìn)行8周的抗TNFR1抗體和對(duì)照抗體治療，結(jié)果表明抑制TNFR1后能明顯改善肝臟脂肪變性、降低TG含量和ALT水平.在NAFLD發(fā)病前期，促炎M1型巨噬細(xì)胞發(fā)揮主要作用，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，抗炎M2型巨噬細(xì)胞在促進(jìn)肝臟組織修復(fù)中起主要作用[44]，主要產(chǎn)生Arg1,IL-10等細(xì)胞因子.WAN等[45]表明IL-10表達(dá)增加對(duì)高脂膳食誘導(dǎo)的小鼠肝損傷和脂肪變性起到保護(hù)作用，AMORAS等[46]認(rèn)為肝組織IL-10mRNA表達(dá)增加，有助于降低組織內(nèi)炎癥浸潤(rùn)，限制丙型肝炎病毒患者肝臟纖維化反應(yīng).艾磊等[47]對(duì)C57BL/6N雄性小鼠喂養(yǎng)高脂膳食12周，復(fù)制伴有NAFLD的胰島素抵抗模型小鼠，隨后進(jìn)行中等強(qiáng)度下坡跑運(yùn)動(dòng)(-5°，45%的最大運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度，6 d/周)，8周后小鼠肝臟內(nèi)巨噬細(xì)胞M2表型相關(guān)IL-10,Arg-1的蛋白表達(dá)顯著增加，改善NAFLD的發(fā)生發(fā)展.

綜上，本研究認(rèn)為，與MICT相比，HIIT能明顯改善高脂膳食對(duì)雌性小鼠肝臟組織的影響，原因可能與高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)明顯增加肝臟組織內(nèi)IL-10蛋白表達(dá)，降低TNF-α蛋白表達(dá)有關(guān).有資料顯示4周有氧運(yùn)動(dòng)結(jié)合飲食控制可以降低肥胖青年的體脂和血脂，且男性優(yōu)于女性[48]，確切機(jī)制不詳，HIIT是否通過巨噬細(xì)胞極化改善高脂膳食對(duì)雄性小鼠肝臟的影響，有待后續(xù)進(jìn)一步證實(shí).

4 結(jié) 論

同等運(yùn)動(dòng)距離情況下，高強(qiáng)度間歇訓(xùn)練比中等強(qiáng)度持續(xù)訓(xùn)練更能改善高脂膳食雌性小鼠肝細(xì)胞脂肪變性，降低肝組織炎癥狀態(tài)，這可能與肝內(nèi)巨噬細(xì)胞從M1極化為M2表型有關(guān).