徐亞奇，王一伊，李飛，邱穩(wěn)輝，沈滟,b，沈國民,b

(河南科技大學 a.基礎(chǔ)醫(yī)學院；b.河南省血栓與止血國際聯(lián)合實驗室，河南 洛陽 471023)

維生素K環(huán)氧化物還原酶(vitamin K epoxide reductase，VKOR)是位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的整合膜蛋白，是維生素K循環(huán)中的限速酶，在血液凝集中發(fā)揮重要作用[1-2].在維生素K循環(huán)中，VKOR先后把維生素K環(huán)氧化物(vitamin K epoxide,VKO)轉(zhuǎn)化為維生素K(vitamin K,VK)以及VK轉(zhuǎn)化為二氫維生素K(vitamin K hydroquinone,VKH2)[3].VKH2作為輔因子參與γ-谷氨酰羧化酶(γ-glutamyl carboxylase，GGCX)對維生素K依賴性凝血因子進行γ羧基化修飾[4]，這種翻譯后修飾是維生素K依賴性凝血因子發(fā)揮生理功能的必要條件[5].VKOR是臨床常用抗凝藥華法林的特異性靶點[6].華法林通過抑制VKOR的活性，使VKO不能轉(zhuǎn)化為VK和VKH2，從而阻斷了維生素K循環(huán)，進而抑制維生素K依賴性凝血因子的γ羧基化修飾，發(fā)揮抗凝作用.在臨床應(yīng)用中，華法林存在個體用藥量差異大和華法林耐受等問題[7-8]，因此，開發(fā)克服華法林耐受的新型抗凝藥具有重要應(yīng)用價值和廣泛應(yīng)用前景.

為了鑒定化合物特異靶向抑制VKOR，需要利用VKOR活性實驗進行測定.目前，VKOR活性實驗方法有微粒體法[1-2]和報告基因法[9]，其中微粒體法可以直接測定VKOR活性，但步驟較為繁瑣.報告基因法雖然方便快捷，由于是間接測定VKOR活性，所以只能測定已知靶向VKOR化合物的抑制作用，而不能鑒定抑制VKOR的新型化合物.因此有必要建立一種方便快捷，且直接測定VKOR活性的方法.本研究利用高效液相色譜法建立了一種基于細胞測定VKOR活性的方法，該方法方便快捷，可用于鑒定靶向抑制VKOR的化合物.

1 材料與方法

1.1 材料

GGCX基因敲除細胞系293-GGCX-knockout為本實驗室構(gòu)建[10].DMEM培養(yǎng)基購自Hyclone公司，胎牛血清購自ABW公司，青霉素-鏈霉素溶液、胰蛋白酶溶液、TritonX-100購自北京索萊寶科技有限公司，色譜純乙腈、正己烷和異丙醇購自天津科密歐化學試劑有限公司，維生素E醋酸酯(vitamin E acetate,VE)購自BBI公司，華法林、維生素K1(VK)、維生素K1-2,3-環(huán)氧化物(VKO)購自Sigma公司.

1.2 方法

1.2.1HPLC檢測VK和VKO的條件

用高效液相色譜分析儀分析從細胞中萃取的維生素K，色譜柱為Eclipse XDB-C18(4.6 mm×150 mm，5.0 μm)，流動相為乙腈-異丙醇(體積比為92.5∶7.5)，流速1.2 mL/min，檢測波長248 nm，柱溫40℃，進樣量30 μL，進樣后洗脫時間為25 min.

1.2.2標準曲線樣品、測試樣品和內(nèi)標樣品的配制

首先配制500 μmol/L的VK溶液和50 μmol/L的VKO溶液.按倍比稀釋法，用乙腈分別配制VK和VKO的標準工作液.VK標準工作液的濃度分別為500.00，250.00，125.00，62.50，31.20，15.60，7.80，3.90，1.96，0.98 μmol/L.VKO標準工作液的濃度分別為50.000，25.000，12.500，6.250，3.120，1.560，0.780，0.390，0.196，0.098 μmol/L.空白對照為乙腈溶液，用乙腈配制不同濃度的測試樣品.維生素E醋酸酯為制備細胞樣品的內(nèi)標物，在萃取VK和VKO的過程中，用正己烷配制含維生素E醋酸酯的萃取試劑.

1.2.3細胞培養(yǎng)以及測定細胞內(nèi)VKOR活性的預(yù)處理

293-GGCX-knockout細胞在體積分數(shù)為10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基中培養(yǎng).為了測定293-GGCX-knockout細胞的VKOR活性，把細胞鋪至10 cm皿中，待細胞長至90%覆蓋率時，加VKO至終濃度為10 μmol/L，繼續(xù)培養(yǎng)4～6 h后收集細胞，萃取細胞內(nèi)VK和VKO.對于華法林處理組，在加入VKO的同時，加入華法林，終濃度為10 μmol/L.

1.2.4VK和VKO的萃取與重懸

細胞處理后，棄培養(yǎng)液上清，收集細胞，用PBS洗3次，后收集細胞沉淀；加入1 mL細胞裂解液(50 mmol/L Tris-HCL pH7.5，150 mmol/L NaCL，體積分數(shù)1% TritonX-100)，渦旋使細胞充分裂解，置于冰上20 min(期間再渦旋1次)；向離心管中加入500 μL異丙醇，渦旋混勻30 s，再加入500 μL含維生素E醋酸酯(濃度為1 mmol/L)的正己烷，渦旋混勻30 s，封口膜封閉離心管，室溫放置30 min(每隔10 min渦旋1次)；2 000 r/min水平離心10 min，輕輕取出離心管(切勿震蕩)置于管架上，此時溶液分為上層有機相和下層水相；吸取450 μL上層有機相于2 mL的棕色進樣瓶中，將瓶開口避光室溫放置使有機相自然揮發(fā)晾干(或氮氣快速吹干).加入100 μL乙腈，使瓶壁及底部殘留的脂溶性物質(zhì)充分溶解，并轉(zhuǎn)移到新的1.5 mL離心管中,13 000 r/min，4 ℃離心10 min，取上清進行HPLC分析.

2 結(jié) 果

2.1 方法的專屬性

分別用乙腈配制不同濃度的含VK,VKO,VE和同時含有VK,VKO和維生素E醋酸酯的樣品溶液，進行色譜分析檢測，依據(jù)文獻選取248 nm為檢測波長[11].VK,VKO和維生素E醋酸酯的保留時間分別約為17.1,11.7和14.3 min(圖1).三者峰形較好，在液相中分離良好，互不干擾.

2.2 標準曲線和定量限

用HPLC分別分析VK和VKO的標準品，以標準品濃度為橫坐標，對應(yīng)的峰面積為縱坐標進行線性回歸分析，得直線回歸方程，即為標準曲線(圖2).結(jié)果表明，VK在0.97～500.00 μmol/L的濃度范圍內(nèi)，其濃度與峰面積線性關(guān)系良好，回歸方程為：Y=24.804X+19.54(圖2(a)，R2=0.999 9).VKO在0.097～50.000 μmol/L的濃度范圍內(nèi)，濃度與峰面積具有良好線性關(guān)系，回歸方程為：Y=54.9X+6.05(圖2(b)，R2=0.999 8).因此，本研究中VK的定量限為0.97～500.00 μmol/L，VKO的定量限為0.097～50.000 μmol/L.

2.3 精密度和穩(wěn)定性

為了檢測方法的精密度和回收率，分別配制低、中、高(62.5,125.0,375.0 μmol/L)3種濃度的VK質(zhì)控樣品和低、中、高(6.25,12.5,37.5 μmol/L)3種濃度的VKO質(zhì)控樣品.將上述質(zhì)控樣品置于-20 ℃冰箱中保存，分別在第1、2、3 d進行色譜分析，每個質(zhì)控樣品每天測定5次，依據(jù)上述標準曲線，分析日內(nèi)精密度、日間精密度和回收率(表1).結(jié)果顯示各濃度VK的日內(nèi)精密度為0.1%～1.2%，日間精密度為0.2%～1.6%，回收率為94.0%～98.9%；各濃度VKO的日內(nèi)精密度為0.30%～1.70%，日間精密度為0.9%～3.2%，回收率為94.3%～103.2%，均符合要求(表1).

表1 VK和VKO的精密度和回收率結(jié)果

2.4 GGCX基因敲除細胞中測定VKOR活性

收集不同處理組的GGCX基因敲除細胞，按1.2.4方法萃取VK和VKO，在萃取過程中加入維生素E醋酸酯為內(nèi)標，用于分析不同樣品在萃取過程中的誤差.結(jié)果表明，在未處理組，可以檢測到特異的維生素E醋酸酯的峰，且峰值與VKO處理組相似，但沒有檢測到VK和VKO的特異峰(圖3(a))，說明細胞內(nèi)源的VK和VKO極少，檢測不到，因此用該細胞測定VKOR活性時，內(nèi)源的VK和VKO對測定VKOR活性的影響可以忽略.在VKO處理組，可以檢測到VK和VKO的峰，說明細胞吸收VKO后，在VKOR的催化下部分VKO被還原為K(圖3(b))；依據(jù)峰面積和標準曲線分別計算出VK和VKO的濃度，VKO的轉(zhuǎn)化率為CVK/(CVK+CVKO)，可計算出VKO的轉(zhuǎn)化率約為35.5%.在VKO與華法林共處理組(圖3(c))，由于華法林特異抑制VKOR活性，導致VKO不能被VKOR還原為K，所以在色譜圖上只檢測到VKO，而沒有檢測到VK(圖3(c))，因此VKO的轉(zhuǎn)化率為0.

3 討 論

VKOR作為開發(fā)抗凝藥的重要靶點，其活性測定對鑒定新型VKOR抑制劑具有重要的應(yīng)用價值[12]，但由于該蛋白是一種整合膜蛋白，其活性測定方法較為有限.目前，測定VKOR活性的常用方法為基于報告基因的方法，是一種間接測定VKOR活性的方法，不能用于鑒定靶向抑制VKOR的新型抑制劑，因為該方法還可以分析維生素K循環(huán)中GGCX的活性[12].本研究建立了一種基于HPLC檢測VK和VKO的方法，該方法簡便快速，準確性高，重復性好，且各檢測物色譜峰分離良好.在流動相優(yōu)化過程中，乙腈和異丙醇的比例對峰形和出峰時間很重要，減少異丙醇比例，各檢測物的出峰時間將延長，且峰形可能為非對稱單峰.為了兼顧各檢測物的分離效果和縮短每個樣品的檢測時間，流動相乙腈和異丙醇的體積比例為92.5∶7.5.另一方面，由于維生素K以3種形式在細胞內(nèi)循環(huán)，在測定VKOR活性中，為使VKOR還原的VK不被GGCX轉(zhuǎn)化為KO，本研究選擇在GGCX基因敲除的細胞中測定VKOR活性，可以排除細胞中GGCX活性對VKOR活性測定的干擾.在從細胞中萃取VK和VKO的過程中，為了分析萃取操作過程對結(jié)果的影響，實驗選擇維生素E醋酸酯為內(nèi)標，可分析操作過程對結(jié)果的影響[12].綜上，本研究通過建立檢測VK和VKO的方法，利用GGCX基因敲除的細胞直接測定VKOR活性，將為靶向VKOR抑制劑的鑒定和新型抗凝藥的研發(fā)提供技術(shù)支持.