宋莉萍，耿啟華,2，湯利光，王斌才，高長斌，余楚英，林處發(fā)，汪愛華

（1. 武漢市農(nóng)業(yè)科學院，湖北 武漢 430070；2. 華中農(nóng)業(yè)大學，湖北 武漢 430070）

維生素C（VC）又叫抗壞血酸，是一種水溶性維生素，分子式為C6H8O6。它是人體需要量最大的一種維生素，正常情況下，成人體內(nèi)VC 含量約為1 500 mg，最高可達3 000 mg。它對維持人體生理機能意義重大。由于其高效的抗氧化性，VC 在人類機體的健康發(fā)育及疾病預防中發(fā)揮著不可或缺的作用[1]。當人體嚴重缺乏VC 時會引起壞血病，還會導致人體免疫力下降。人體所需的絕大多數(shù)其他維生素膳食推薦供應(yīng)量都在20 mg/d 以下，而VC 的膳食推薦供應(yīng)量卻為100 mg/d[2]，但人體因缺乏古洛糖內(nèi)酯氧化酶，不能自身合成VC，只能從水果和蔬菜中攝取[3]，由于VC 在身體內(nèi)不能積累，所以每天都需要吃適量的蔬菜和水果。因此，VC 含量的多少與果蔬的品質(zhì)、營養(yǎng)價值、抗病及抗衰老能力直接相關(guān)。

常態(tài)下VC 不穩(wěn)定，容易被氧氣及Cu2+、Fe3+等金屬離子氧化，也易受溫度、pH 值、光照等的影響。根據(jù)不同的原理，VC 含量的測定方法有很多種，一般包括紫外分光光度法[4]、熒光法[5]、碘量法[6]，比色法（2,4-二硝基苯肼比色法）[7]、滴定法（碘酸鉀滴定法、2,6-二氯靛酚鈉滴定法）[8-9]等，但大多存在操作繁瑣、測定效率不高等問題。近年來，高效液相色譜法由于其高效、快速、穩(wěn)定可靠等特點，被廣泛應(yīng)用于果蔬、食品、藥物等的VC 含量測定[10]。筆者在現(xiàn)行標準（GB5009.86—2016 食品安全國家標準食品中抗壞血酸的測定）的基礎(chǔ)上，借鑒王超等[11]高效測定油菜中VC 含量的方法，對高效液相色譜法測定VC 含量進行了優(yōu)化，可滿足蔬菜中VC 含量測定的高通量、高準確率要求。

十字花科蔬菜是蔬菜體系中的一大類，主要包括白菜類、甘藍類、芥菜類、蘿卜類、水生蔬菜類和油菜。白菜類包含小白菜、菜心、大白菜、紫菜薹、紅菜薹等；油菜和白菜有許多變種，如塌菜、烏菜之類都屬于這一族，它們顏色深綠，炒食后味道濃香，都屬于優(yōu)質(zhì)蔬菜。小白菜葉和油菜幼苗及其薹中都含有豐富的VC，具有很高的食用價值。該研究選擇6 種不同類型的十字花科蔬菜進行葉和薹的VC 含量測定，旨在為培育高VC 含量的十字花科類蔬菜品種提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試樣品如表1 所示，2020 年9 月15 日將搜集到的不同來源的白梗小白菜（9 份）、青梗小白菜（29 份）、烏塌菜（13 份）、快菜（5 份）、油菜（12 份）、紅菜薹（8 份）共76 份資源播種于穴盤中，9 月29日移栽到武漢市農(nóng)業(yè)科學院北部院區(qū)武湖試驗基地，11 月2 日于試驗田中編號掛牌并采樣，每個材料選擇9 株大小相近的、由內(nèi)往外數(shù)的第4 片葉，取3 株的葉混合為一個樣品，每份資源取3個樣，2020年12月—2021 年2 月在各類型材料的花蕾期進行薹取樣（每種蔬菜薹的取樣時間均處于可食用狀態(tài)），選擇與葉編號相對應(yīng)的主薹，液氮迅速冷凍，并于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 供試樣品及來源

1.1.2 儀器與試劑主要儀器設(shè)備有高效液相色譜儀（e2695，美國Waters 公司）、色譜柱（美國Waters XBridge-C18 色譜柱，柱長250 mm，內(nèi)徑4.6 mm，粒徑5 μm）、PDA 檢測器（美國Waters2998，紫外檢測器）、超聲波清洗機（ SB25-12DTN，寧波新芝生物科技股份有限公司）、磨樣機（ MFJ-W300，利仁電器京東自營）、真空抽濾裝置（ VP-10L，JOAN LAB 公司）。主要試劑有VC 標準品（純度99%以上，Sigma-Aldrich公司）、偏磷酸（國藥集團化學試劑有限公司）、乙酸銨（Sigma-Aldrich 公司）、色譜甲醇（Fisher 公司）、2 mL 色譜進樣瓶和250 μL 內(nèi)插管（上海安譜實驗科技股份有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 VC 標準工作液配制稱取0.1 g VC 標準品于100 mL 棕色容量瓶中，用1%的偏磷酸溶解并定容，充分搖勻后放置在4℃冰箱中避光保存。分別吸取1、2、5、10、20 mL 的VC 標準溶液（1 000 μg/mL）于容量瓶中，用1%的偏磷酸定容至100 mL，由此獲得濃度為10.0、20.0、50.0、100.0 和200.0 μg/mL 的VC 標準工作液。

1.2.2 VC 的提取取出樣品在液氮中預冷，再置于磨粉機中研磨成粉狀；用萬分之一的天平稱取2 g 樣品，置于50 mL 離心管中，加入40 mL 提取液（即1%的偏磷酸），然后用均質(zhì)機均質(zhì)破碎；用10 mL 注射器吸取樣品勻漿，經(jīng)0.45 和0.22 μm 2 層濾膜過濾；將濾液打入2 mL 色譜進樣瓶中，等待上機檢測。

1.2.3 HPLC 檢測條件流動相為甲醇和20 mmol/L乙酸銨（2 者比例為7 ∶93；其中，乙酸銨溶液現(xiàn)配現(xiàn)用，稱取1.54 g 乙酸銨，先溶解于200 mL 超純水中，超聲15 min 后，再用超純水定容至1 000 mL，繼續(xù)超聲脫氣15 min，超聲結(jié)束后用真空抽濾泵+0.22 μm 微孔水相濾膜進行抽濾）；流速 1.0 mL/min；進樣量10 μL；目標柱溫25℃；檢測波長245 nm；VC 的保留時間2.5 min。

2 結(jié)果與分析

2.1 VC 標準曲線的繪制

由圖1 可以看出，在10～200 μg/mL 濃度范圍內(nèi)，VC 含量呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系，所得方程為y=20 566.9x+2 753，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 885，可以滿足測定要求。

圖1 VC 的標準工作曲線

2.2 檢測方法的穩(wěn)定性和重復性

取同一小白菜葉片樣品在相同試驗條件下重復測定6 次，VC 含量分別為84.53、85.45、86.57、87.60、88.49 和89.09 mg/100g，這一小白菜葉片VC 含量的平均值為86.96 mg/100g，相對標準偏差RSD 僅為1.8543%，說明該檢測方法穩(wěn)定性和可重復性較好，如圖2 所示，VC 的保留時間為2.464 min。

圖2 樣品中VC 的色譜圖

2.3 各樣品的VC 含量

2.3.1 小白菜類如圖3 所示，白梗小白菜葉的VC含量在77.16～123.58 mg/100g 之間，平均值為103.13 mg/100g，白梗小白菜薹的VC 含量在54.22～90.98 mg/100g 之間，平均值為77.81 mg/100g；青梗小白菜葉的VC 含量在59.39～111.57 mg/100g 之間，平均值為94.11 mg/100g，青梗小白菜薹的VC 含量在54.21～102.87 mg/100g 之間，平均值為79.01 mg/100g。

2.3.2 烏塌菜如圖4 所示，烏塌菜葉中VC 含量在58.41～141.24 mg/100g 之間，平均值為89.37 mg/100g，薹中VC 含量在56.32～115.69 mg/100g 之間，平均值為78.33 mg/100g；其中，XJ668、XJ827、XJ838 這3份材料中薹的VC 含量比葉高；其他10 份材料中薹的VC 含量比葉低。這種差異的產(chǎn)生可能是地域不同所致，也可能是品種不同所致。

圖4 烏塌菜中葉和薹的VC 含量

2.3.3 快菜、紅菜薹及油菜由圖5A 可知，快菜葉中VC 的含量在49.71～111.69 mg/100g 之間，平均值為74.05 mg/100g；薹中VC 的含量在75.11～91.75 mg/100g 之間，平均值為77.37 mg/100g，薹的VC含量均比葉高。由圖5B 可知，紅菜薹葉中VC 的含量在69.53～103.02 mg/100g 之間，平均值為87.78 mg/100g；薹中VC 的含量在43.15～86.35 mg/100g 之間，平均值為69.98 mg/100g。由圖5C 可知，油菜葉中VC 的含量在51.48～113.19 mg/100g 之間，平均值為81.48 mg/100g；薹中VC 的含量在74.20～104.78 mg/100g 之間，平均值為89.50 mg/100g?？觳酥修返腣C 含量高于葉，可能是受生育期長短的影響，快菜作為早熟的大白菜，其生長周期短，葉中營養(yǎng)物質(zhì)的積累相對普通小白菜要弱一些。不同生長時期、水肥供應(yīng)、光照時長等也可能是造成葉和薹中VC 含量差異的原因。

圖5 快菜、紅菜薹及油菜中葉和薹的VC 含量

3 討論與結(jié)論

3.1 結(jié) 論

利用高效液相色譜法測定了6 種類型十字花科蔬菜共76 份資源葉和薹的VC 含量，結(jié)果顯示，不同材料的VC 含量差異較大；食用葉中，VC 含量的均值由高到低依次為白梗小白菜＞青梗小白菜＞烏塌菜＞紅菜薹＞油菜＞快菜；食用薹中，VC 含量的均值由高到低依次為油菜＞青梗小白菜＞烏塌菜＞白梗小白菜＞快菜＞紅菜薹。青梗小白菜和白梗小白菜的葉VC 含量均高于薹；烏塌菜、油菜和紅菜薹中大部分資源的葉VC 含量高于薹，少部分資源薹VC 含量高于葉；5 個快菜資源的薹VC 含量均高于葉。

3.2 討 論

VC 作為維持機體生理功能的重要維生素之一，對人體健康有著非常重要的意義。目前采用的國標中的高效液相色譜法樣品前處理比較繁瑣，一個樣品從處理到上機檢測至少需要15 min，對于大群體樣本測定效率不高。因此，實驗借鑒了王超等[11]的方法，進一步優(yōu)化了十字花科蔬菜VC 含量測定的高效液相色譜法，樣品中VC 提取步驟簡單，1%偏磷酸提取比1%鹽酸提取更穩(wěn)定，基本沒有其他雜峰出現(xiàn)，而且出峰時間可穩(wěn)定在2.5 min 左右，重復性好，準確度高，可滿足蔬菜中VC 含量測定的高通量、高準確率要求。

隨著人民生活水平的日益提高，蔬菜的營養(yǎng)品質(zhì)及口感越來越受到重視。十字花科蔬菜可提供人體所必須的多種礦物質(zhì)和維生素等營養(yǎng)物質(zhì)，水溶性VC可在體內(nèi)形成一種“透明質(zhì)酸抑制物”，這種物質(zhì)具有抗癌作用，可使癌細胞喪失活力[12]。目前已有關(guān)于黃瓜[13]、番茄[14]、辣椒[15]、擬南芥[16]中VC 遺傳的分析，但是很少有關(guān)于十字花科蔬菜的遺傳機理的研究報道。VC 作為蔬菜品質(zhì)性狀中的重要指標，其含量的快速準確測定有助于其遺傳機理的解析，以便挖掘高VC 含量的十字花科蔬菜種質(zhì)，加快培育高VC含量新品種，為以新需求為導向的十字花科蔬菜產(chǎn)業(yè)發(fā)展戰(zhàn)略以及提高十字花科蔬菜的葉用和薹用價值奠定基礎(chǔ)。