瀘型酒釀造過程中各層酒醅揮發(fā)性物質變化規(guī)律

敖 靈，梅軍蘭，郎召偉，曾 珊，沈小娟，陸震鳴，張曉娟，柴麗娟，王松濤，沈才洪，史勁松，許正宏2，*

（1.瀘州老窖股份有限公司，四川 瀘州 646000；2.國家固態(tài)釀造工程技術研究中心，四川 瀘州 646000；3.江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫 214122；4.江南大學 糧食發(fā)酵與食品生物制造國家工程研究中心，江蘇 無錫 214122；5.江南大學 生命科學與健康工程學院，江蘇 無錫 214122）

我國白酒是世界蒸餾酒的典型代表，其主要成分為乙醇（體積分數(shù)38%～65%）和水，呈香呈味物質的含量約占2%左右，這些微量成分種類和含量的差異以及不同物質之間的相互作用決定了不同香型白酒的典型風格[1-2]。不同香型白酒的主體風味物質各異，基于化合物含量和其香氣強度分析，濃香型白酒的關鍵呈香物質為己酸乙酯，它和乳酸乙酯、乙酸乙酯、丁酸乙酯及其相應的有機酸（即己酸、乳酸、乙酸和丁酸）共同形成了濃香型白酒的典型風格，業(yè)界稱為“四大酸四大酯”，優(yōu)質濃香型白酒取決于四大酸四大酯和其他香氣成分的含量與比例和諧平衡[3-5]。酯類、醇類、酸類、醛類、酮類等揮發(fā)性物質是瀘型酒酒醅風味的主要來源[6-7]，它們通過蒸餾進入原酒中，形成了瀘型酒的獨特風格[8-9]。

濃香型白酒的風味形成是多菌種協(xié)同發(fā)酵的結果，泥窖池生香發(fā)酵是其典型的工藝特征，前期研究表明，以乳酸桿菌屬（Lactobacillus）為優(yōu)勢菌的酒醅菌群和以梭菌綱（Clostridia）為優(yōu)勢菌的窖泥菌群通過“分工合作，協(xié)同發(fā)酵”形成了濃香型白酒的主體風味物質[10-13]。紛繁復雜的微生物將以高粱為主要原料的酒醅中的淀粉等大分子逐步水解，在發(fā)酵過程中形成大量的富含營養(yǎng)底物和風味物質的水解液，稱作黃水[14]，其在重力的作用下逐漸聚集在窖池中下部，造成不同層酒醅風味物質積累的空間異質性。目前，關于瀘型酒酒醅的研究集中在酒醅中微生物群落方面[15-16]。而四大酸和四大酯是酒醅揮發(fā)性風味物質研究的焦點[17]；在探究酒醅整體或不同層次酒醅揮發(fā)性風味物質的研究中，往往通過測定發(fā)酵結束時的最終含量來研究酒醅、窖泥與基酒的關系，從而指導生產(chǎn)[18-19]。但對整個發(fā)酵過程中不同層級酒醅揮發(fā)性風味物質變化的研究相對較少，通過對發(fā)酵過程中不同層次酒醅中揮發(fā)性風味物質相對含量進行橫向和縱向對比，能更全面地探究發(fā)酵過程中不同層次酒醅的揮發(fā)性風味物質積累的特點和規(guī)律。

本研究采用頂空固相微萃?。╤eadspace solid-phase micro-extraction，HS-SPME）結合氣相色譜-質譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）聯(lián)用技術[20]，對瀘型酒上、中、下層酒醅發(fā)酵過程中的主要揮發(fā)性化合物的變化規(guī)律進行分析，對比不同層酒醅中主要揮發(fā)性物質的變化差異，并采用主成分分析（principal component analysis，PCA）解析不同發(fā)酵時期酒醅中的酯類特征風味物質，通過研究濃香型白酒釀造過程中不同位置酒醅揮發(fā)性物質的特點，以期為分層餾酒工藝提供基礎數(shù)據(jù)參考，為后續(xù)探究濃香型白酒釀造機理奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 原料

酒醅樣品：自酒醅入泥窖后開始取樣，將酒醅從窖頂至窖底平均分為上、中、下3層，每層取3個平行樣品，放入無菌自封袋后盡快轉入-80 ℃冰箱保存。在瀘型酒整個發(fā)酵過程中每隔3 d取樣，共發(fā)酵39 d，共取117個樣品。

1.1.2 試劑

2-辛醇、甲醇（均為色譜純）：美國Sigma-Aldrich公司；氯化鈉（分析純）：國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

Bruker SCIONSQ456氣相色譜-質譜聯(lián)用儀：德國Bruker公司；DB-Wax色譜柱（30 m×0.32 mm×0.25 μm）：美國Agilent公司；DVB/CAR/PDMS（50/30 μm）頂空固相萃取頭、手動SPME進樣器：美國Supelco公司。

1.3 方法

1.3.1 酒醅中揮發(fā)性風味物質的測定[21]

樣品前處理：稱取2 g酒醅樣品至20 mL規(guī)格HS-SPME樣品瓶中，加入2.88 g氯化鈉和8 mL蒸餾水，振蕩均勻后加入10 μL質量濃度為2.2 g/L的2-辛醇作為內(nèi)標。采用頂空固相微萃取方法進行風味物質富集，吸附溫度為50 ℃，時間為40 min，隨后在250 ℃下解吸5 min后進行GC-MS分析。

GC條件[22]：使用DB-Wax色譜柱（30 m×0.32 mm×0.25μm），載氣為高純氦氣（He）（≥99.999%）；流速1.0mL/min，氣化室溫度250 ℃；升溫程序為起始溫度40 ℃，維持3 min后再以5 ℃/min的速率升至60 ℃，然后以10 ℃/min速率升至230 ℃，最后維持8 min，共計32 min。

MS條件：電離方式為電子電離（electron ionization，EI）源，電子倍增器電壓為350 V，發(fā)射電流200 μA，電子能量為70 eV，離子源和接口溫度分別為200 ℃和250 ℃，掃描方式為全掃描，掃描范圍33～450 amu。

定性定量分析：揮發(fā)性風味化合物經(jīng)計算機檢索，與美國國家標準技術研究所（national institute of standards and technology，NIST）譜庫相匹配，結合保留指數(shù)（retention index，RI）對酒醅中的揮發(fā)性風味物質進行定性，采用內(nèi)標法計算各揮發(fā)性風味物質的含量，以干醅質量計。

1.3.2 主成分分析[23-24]

選取巴特利特球形檢驗（Bartlett Test of Sphericity）和KMO（Kaiser-Meyer-Olkin）檢驗驗證所選的21種揮發(fā)性酯類物質（即變量）是否適用于主成分分析?；?1個變量的協(xié)方差矩陣，選取特征值＞1以及累計方差貢獻率＞80%的主成分進一步分析[25]。通過主成分的載荷圖和得分圖解析造成各樣本差異的主要變量。

1.3.3 數(shù)據(jù)處理

本研究采用R3.6.3軟件對GC-MS下機數(shù)據(jù)進行處理，通過Graphpad Prism 8.0軟件繪制折線圖、堆積柱狀圖。

2 結果與分析

2.1 發(fā)酵過程中上層酒醅揮發(fā)性風味物質變化

在上層酒醅發(fā)酵過程中共檢測到99種揮發(fā)性風味物質，其中包括54種酯類、12種醇類、15種酸類、7種醛酮類、5種酚類和6種其他化合物。上層酒醅中，醇、酸和酯3類揮發(fā)性物質含量之和占揮發(fā)性風味物質總含量的99%。對發(fā)酵過程中上層酒醅的醇類、酸類、酯類化合物含量的變化進行分析，結果見圖1。

由圖1a可知，在整個發(fā)酵過程中，上層酒醅的醇類、酸類、酯類含量的變化具有很強的相似性。在第0～15天有較大的波動性；在發(fā)酵末期（第36～39天）增長較迅速。醇類物質的含量在發(fā)酵終止（11.5 μg/g干醅）比發(fā)酵起始（0.8 μg/g干醅）提高10倍以上；酸類物質含量在發(fā)酵終止（95.8 μg/g干醅）比發(fā)酵起始（8.9 μg/g干醅）提高10倍以上；酯類物質含量在發(fā)酵終止（457.6 μg/g干醅）比發(fā)酵起始（9.4 μg/g干醅）增加約50倍。綜合來看，在上層酒醅特有的發(fā)酵環(huán)境中，各類物質的產(chǎn)生、積累和消耗具有相似性和統(tǒng)一性。

圖1 發(fā)酵過程中上層酒醅醇、酸、酯三類化合物總量（a）與相對含量（b）變化規(guī)律Fig. 1 Changes rule of the total contents (a) and relative contents (b)of alcohols,acids and esters in upper layer of fermented grains during fermentation process

由圖1b可知，在上層酒醅中，在第0～15天范圍內(nèi)，酯類物質含量從49.0%增加至80.4%；發(fā)酵時間＞15 d后，酯類物質含量變化小幅度波動；發(fā)酵起始時，上層酒醅中酸類物質相對含量為46.9%，在第15天，其相對含量減少至15.4%，發(fā)酵時間＞15 d后，酸類物質相對含量變化趨勢較平穩(wěn)；而醇類物質在整個發(fā)酵過程中相對含量的變化幅度較?。?.7%～8.5%）。這可能是由于在發(fā)酵前期微生物產(chǎn)生酯化酶，催化醇類和酸類物質生成多種酯類化合物，隨著酸類物質相對含量的減少，酯化速度逐漸變緩，到后期這些酯類化合物穩(wěn)定積累，或者重新分解、合成，形成更高級脂肪酸酯類化合物，在整個發(fā)酵過程中醇類物質相對含量在產(chǎn)生與消耗中保持動態(tài)平衡[26]。

2.2 發(fā)酵過程中中層酒醅中揮發(fā)性風味物質變化

瀘型酒發(fā)酵過程中，中層酒醅中共檢測到98種揮發(fā)性風味物質，其中包括54種酯類、14種醇類、8種酸類、9種醛酮類、6種酚類和7種其他類物質，其中，醇、酸和酯三類揮發(fā)性含物質的含量之和占總含量的99%。對發(fā)酵過程中中層酒醅的醇類、酸類、酯類化合物進行分析，分析結果見圖2。

圖2 發(fā)酵過程中中層酒醅醇類、酸類、酯類化合物總量（a）與相對含量（b）變化規(guī)律Fig. 2 Changes rule of the total contents (a) and relative contents (b)of alcohols,acids and esters in middle layer of fermented grains during fermentation process

由圖2a可知，在整個發(fā)酵過程中，酸類物質的變化較平穩(wěn)，而醇類和酯類物質都是在發(fā)酵第0～24天和第24～39天表現(xiàn)出先上升后下降的變化趨勢，與上層酒醅發(fā)酵過程中醇、酸、酯類物質的變化趨勢不同。酸類物質含量在整個發(fā)酵過程中的含量范圍在8.9 μg/g干醅～9.2 μg/g干醅范圍內(nèi)；從發(fā)酵起始到發(fā)酵終止，醇類物質含量從0.8 μg/g干醅增長到2.8 μg/g干醅；發(fā)酵終止酯類物質含量（77.1 μg/g干醅）比發(fā)酵起始（9.4 μg/g干醅）增加約8倍。綜合比較中層酒醅發(fā)酵過程中醇類、酸類、酯類化合物的變化發(fā)現(xiàn)，中層酒醅中的揮發(fā)性風味物質相對含量相較于上層酒醅都明顯減少，可能是由于中層酒醅未接觸封窖泥，較少被窖泥中微生物利用所致。

由圖2b可知，中層酒醅與上層酒醅在發(fā)酵過程中的主要揮發(fā)性風味物質相對含量變化趨勢相同，在發(fā)酵第0～15天，酯類物質相對含量從49.0%迅速上升至87.7%，當發(fā)酵時間＞15 d，酯類物質相對含量變化小幅度上升；在發(fā)酵第0～15天，酸類物質相對含量迅速下降，從46.9%下降至10.9%，當發(fā)酵時間＞15 d，酸類物質相對含量小幅度下降；在整個發(fā)酵過程中，醇類物質相對含量變化趨于平穩(wěn)（1.6%～4.2%）。

2.3 發(fā)酵過程中下層酒醅中揮發(fā)性風味物質變化

瀘型酒發(fā)酵過程中，下層酒醅中檢測到97種揮發(fā)性風味物質，其中包括49種酯類、16種醇類、9種酸類、12種醛酮類、4種酚類和7種其他化合物。下層酒醅中醇類、酸類、酯類揮發(fā)性物質含量之和占揮發(fā)性風味物質總含量的99%。對發(fā)酵過程中中層酒醅的醇類、酸類、酯類化合物進行分析，分析結果見圖3。

圖3 發(fā)酵過程中下層酒醅醇類、酸類、酯類化合物總量（a）與相對含量（b）變化規(guī)律Fig. 3 Changes rule of the total contents (a) and relative contents (b)of alcohols,acids and esters in lower layer of fermented grains during fermentation process

由圖3a可知，在整個發(fā)酵過程中，醇類、酸類、酯類化合物的變化趨勢表現(xiàn)出極高的一致性，在發(fā)酵第0～12天和第15～27天表現(xiàn)出先上升后下降的變化趨勢，在發(fā)酵后期（第36～39天）呈上升趨勢，與上層和中層酒醅中此三類物質的變化有一定區(qū)別。醇類物質含量在發(fā)酵終止（4.0 μg/g干醅）比發(fā)酵起始（0.8 μg/g干醅）提高5倍；酸類物質含量在發(fā)酵終止（43.8 μg/g干醅）比發(fā)酵起始（8.9 μg/g干醅）提高約5倍；酯類化合物含量在發(fā)酵終止（196.0 μg/g干醅）比發(fā)酵起始（9.4 μg/g干醅）增長20倍以上。

由圖3b可知，與上層和中層酒醅相同，瀘型酒發(fā)酵過程中，下層酒醅中醇類、酸類和酯類化合物相對含量變化差異明顯。在下層酒醅發(fā)酵過程中，酯類物質相對含量在0～15 d范圍內(nèi)，從49.0%增加至84.5%，當發(fā)酵時間＞15 d后，酯類物質含量小幅度波動；酸類物質相對含量在0～15 d范圍內(nèi)，從46.9%減少至11.5%，當發(fā)酵時間＞15 d后，相對含量變化相對穩(wěn)定；與上、中層酒醅相同，醇類物質占比在下層酒醅整個發(fā)酵過程中變化幅度較?。?.4%～7.1%）。

上述結果表明，瀘型酒窖池內(nèi)不同層酒醅的理化環(huán)境不盡相同，導致生長在酒醅中的微生物所處微環(huán)境不同，由代謝活力的差異影響了代謝物在酒醅中積累的含量[27]。在整個發(fā)酵過程中，上層酒醅中主要揮發(fā)性風味物質的含量最高，中層酒醅次之，下層酒醅最低。通過對比發(fā)酵過程中三層酒醅的相對含量可知，各類化合物的含量占比在不同層酒醅中變化趨勢較一致，說明不同層酒醅中微生物代謝規(guī)律具有一定的相似性，但有待進一步研究。

2.4 主成分分析

酯類物質是白酒風味的主要組成部分，具有多種水果香氣，在濃香型白酒中是種類和含量最多的風味物質[26，28]。選擇相對含量最高的酯類物質進行主成分分析。在發(fā)酵過程中，不同層酒醅中酯類物質變化規(guī)律相似，酯類物質的變化包括2個階段：含量占比上升的第0～15天以及變化較為平穩(wěn)的第18～39天，但仍不清楚這兩個階段的特征酯類物質。因此，選擇在整個發(fā)酵過程＞75%檢出率的酯類，最終確定了21種酯類物質，編號為Z1～Z21，作為主成分分析的21個變量。

首先考察所取的21個變量是否適合進行主成分分析，采用的檢驗方法是Bartlett球度檢驗（相伴概率＜0.05）和KMO檢驗（KMO值＞0.6）。結果顯示，相伴概率為0.00，KMO值為0.64，證明了21個酯類物質可作為主成分分析的代表性變量。

對21個酯類物質進行主成分分析，原始信息被降為4個主成分，F(xiàn)1、F2、F3和F4的方差貢獻率分別為35.64%、20.87%、12.54%和8.04%，累計方差貢獻率為77.092%，說明這4個主因子對21個變量的解釋度為77.092%?；谥鞒煞址治龅?1種酯類物質的成分矩陣見表1。

由表1可知，對第一主成分F1來說，乳酸乙酯（Z2）、丁二酸二乙酯（Z4）、戊酸乙酯（Z6）、己酸丙酯（Z8）、己酸丁酯（Z9）、庚酸乙酯（Z12）、反油酸乙酯（Z16）、亞油酸乙酯（Z17）、棕櫚酸乙酯（Z19）和苯乙酸乙酯（Z20）表現(xiàn)出較高的載荷值，說明這些物質與F1相關性較強；丁酸異戊酯（Z5）、己酸乙酯（Z7）、己酸異戊酯（Z10）、辛酸乙酯（Z13）、壬酸乙酯（Z14）、癸酸乙酯（Z15）和月桂酸乙酯（Z18）在第二主成分F2上有較高的載荷值，表明F2與其有很強的相關性；在第三主成分F3上，乙酸乙酯（Z1）、丁酸乙酯（Z3）和己酸己酯（Z11）載荷值較高，表明F3與這三個變量相關性較強；同理，第四主成分F4與苯丙酸乙酯（Z21）有很強的相關性。通過考察瀘型酒發(fā)酵過程酒醅樣本揮發(fā)性物質的特征差異以及21個變量的貢獻度，獲得21個變量的得分圖與載荷圖，結果見圖4。

圖4 瀘型酒發(fā)酵過程酒醅中21種酯類物質的得分圖（a）與載荷圖（b）Fig. 4 Score diagram (a) and load diagram (b) of 21 esters in fermented grains during strong-flavor Baijiu fermentation process

表1 基于主成分分析的21種酯類物質的成分矩陣Table 1 Composition matrix of 21 esters based on principal component analysis

由圖4a可知，發(fā)酵過程酒醅風味特征可以以第15天為界限，被明顯地區(qū)分為兩個發(fā)酵階段。由圖4b可知，21種酯類物質在主成分1（principal component1，PC1）軸上區(qū)分度良好，所有長鏈脂肪酸酯或芳香族脂肪酸酯都分布在PC1軸的正向區(qū)域，除乳酸乙酯、丁二酸二乙酯、己酸乙酯、癸酸乙酯之外，其他的中短鏈脂肪酸酯都分布在PC1軸的負向區(qū)域。

由圖4b可知，在發(fā)酵前期（第0～15天）的特征酯類化合物中，出現(xiàn)了白酒四大酯中的乙酸乙酯和丁酸乙酯；戊酸乙酯、庚酸乙酯、辛酸乙酯和壬酸乙酯4種其他乙酯；以及丁酸異戊酯、己酸丙酯、己酸丁酯、己酸異戊酯、己酸己酯5種其他酯類；發(fā)酵后期（第18～39天）的特征酯類化合物出現(xiàn)了四大酯中的己酸乙酯和乳酸乙酯，以及丁二酸二乙酯和癸酸乙酯這兩種乙酯。結合己酸乙酯在酒醅發(fā)酵過程中的相對含量變化，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵后期為己酸乙酯積累的主要時期，推測適當延長發(fā)酵時間對瀘型酒主體風味特征的突出有重要的正向作用。

3 結論

本研究聚焦于瀘型酒釀造過程中的酒醅發(fā)酵工藝環(huán)節(jié)，通過HS-SPME/GC-MS分析技術對窖池內(nèi)不同層酒醅揮發(fā)性風味物質的組成和變化規(guī)律進行了分析發(fā)現(xiàn)，上、中、下三層酒醅中的主要揮發(fā)性風味物質為醇類、酸類和酯類，在整個發(fā)酵過程中，不同層酒醅中醇類、酸類和酯類的變化趨勢相似，其中，醇類物質相對含量的變化在整個發(fā)酵過程中變化不明顯；酯類物質相對含量在發(fā)酵前期（第0～15天）呈上升趨勢，而酸類物質相對含量逐漸下降，在發(fā)酵后期（第18～39天），這兩類物質相對含量相對穩(wěn)定；發(fā)酵結束時，上層酒醅中醇類、酸類、酯類物質總量最多，下層酒醅次之，中層酒醅最低。通過PCA分析，確定了瀘型酒發(fā)酵過程的兩個不同階段（發(fā)酵第0～15天和18～39天）酒醅中的特征酯類物質。通過以上分析發(fā)現(xiàn)，適當延長發(fā)酵時間對瀘型酒主體風味特征的突出有重要的正向作用。本研究初步確定了酒醅中的特征風味物質，為后續(xù)探究濃香型白酒釀造機理奠定了基礎。