劉宗科，鄒 鵬，李浩浩，嚴平生*

（陜西省果蔬及加工產(chǎn)品質(zhì)量檢驗檢測中心 眉縣食品安全檢測檢驗中心，陜西 寶雞 722300）

生物胺是一類具有生物活性的含胺基礎(chǔ)化合物的總稱，在發(fā)酵食品中普遍存在，其主要由發(fā)酵微生物對氨基酸的脫酸作用產(chǎn)生[1]。攝入適量的生物胺具有促進機體蛋白合成、調(diào)節(jié)血管和肌肉張力、控制血壓和血糖穩(wěn)定、增強機體免疫調(diào)節(jié)、參與神經(jīng)信號傳導(dǎo)、清除體內(nèi)自由基等生理活性[2]，但高劑量的生物胺則會對機體產(chǎn)生毒性，特別是組胺和酪胺，可引發(fā)偏頭痛和高血壓等不良反應(yīng)[3]，因此，生物胺被認為是反映安全性的重要指標之一[4]。

發(fā)酵食品中常見的生物胺主要有色胺、苯乙胺、腐胺、尸胺、組胺、酪胺、亞精胺、精胺8種[5]，其在發(fā)酵食品中的含量受樣品中氨基酸的濃度、發(fā)酵微生物種類、脫羧酶活性、發(fā)酵條件等因素的影響[6-7]。目前在常見的食品發(fā)酵微生物乳桿菌（Lactobacillus）、片球菌（Pediococcus）、乳球菌（Lactococcus）、鏈球菌（Streptococcus）、腸球菌（Enterococcus）等屬的部分菌株中均檢測到了氨基酸脫羧酶基因及活性[8]，但不同菌種來源的氨基酸脫羧酶在底物特異性和催化活性上差異較大[9]。

由于氨基酸水平是制約發(fā)酵食品生物胺含量最關(guān)鍵的因素，因此那些高蛋白質(zhì)含量的發(fā)酵食品通常含有較高水平的生物胺，如發(fā)酵肉制品[10]、發(fā)酵水產(chǎn)品[11]和發(fā)酵豆制品等[12]。我國的傳統(tǒng)發(fā)酵豆制品種類較多，包括豆醬、豆豉、腐乳、醬油等，相關(guān)文獻中已經(jīng)系統(tǒng)報道了國內(nèi)市售豆醬[13]、豆豉[14]和醬油[15]中的生物胺水平，但國內(nèi)市售腐乳中的生物胺水平尚缺乏系統(tǒng)報道。

本研究的主要目的是分析檢測我國市售不同品牌腐乳中的生物胺種類及水平，采用丹磺酰氯柱前衍生結(jié)合高效液相色譜（high-performance liquid chromatography，HPLC）法對我國市售的20個品牌白方腐乳和20個品牌紅方腐乳中的生物胺含量進行分析，并揭示發(fā)酵工藝對產(chǎn)品中生物胺含量影響的規(guī)律，以期為全面解析我國市售腐乳中生物胺分布規(guī)律提供科學(xué)數(shù)據(jù)，為腐乳生產(chǎn)企業(yè)有針對性地降低產(chǎn)品中特定生物胺的水平進而提高產(chǎn)品安全性提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

腐乳樣品（共計80個，其中白方腐乳和紅方腐乳各40個，分別來自20個品牌，每個品牌取2批次樣品，生產(chǎn)日期為2020年和2021年）：西安市大型超市以及網(wǎng)絡(luò)電商平臺購買。

腐胺、尸胺、酪胺、組胺、色胺，β-苯乙胺、精胺、亞精胺生物胺標準物質(zhì)（純度均＞98%）、丙酮、三氯甲烷、正丁醇（均為色譜純）：美國Sigma-Aldrich公司；衍生劑（丹磺酰氯）（色譜純）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

1260高效液相色譜儀：美國安捷倫公司；ULPHW超純水機：四川優(yōu)普超純科技有限公司；N-EVAP-34氮吹儀：美國Organomation公司。

1.3 檢測方法

1.3.1 生物胺提取

取5 g腐乳樣品加入50 mL離心管中，加入0.4 mol/L三氯乙酸溶液20 mL，高速勻漿2 min，離心，將全部液相轉(zhuǎn)移至100 mL具塞量筒內(nèi)，沉淀物用0.4 mol/L三氯乙酸溶液20 mL再提取一次，合并提取液至具塞量筒內(nèi)，然后添加4 mol/L氫氧化鈉溶液4 mL和0.5 mol/L碳酸鈉溶液4 mL，將溶液調(diào)至pH 11.0，繼后依次加入三氯甲烷20 mL和正丁醇20 mL，上下振蕩1 min，靜置10 min，傾出上層水相，向下層有機相中加入1 mol/L鹽酸1 mL，然后于50 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干，再加入0.1 mol/L鹽酸5 mL復(fù)溶殘留物，待衍生。

1.3.2 生物胺衍生

取1 mL上述樣品提取液或標準溶液，加入至5 mL具塞試管中，再依次加入0.5 mol/L碳酸鈉溶液0.5 mL和5 g/L丹磺酰氯丙酮溶液（將0.5 g丹磺酰氯溶于100 mL丙酮中）0.5 mL，混合均勻，于50 ℃水浴避光加熱反應(yīng)60 min，然后加入0.1 mL濃氨水，去除過剩衍生劑，經(jīng)尼龍濾膜過濾后加入至色譜瓶中，待HPLC分析[16]。

1.3.3 高效液相色譜分析

衍生劑丹磺酰氯采用安捷倫TC-C18反相色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）在40 ℃柱溫下對目標物進行分離，然后利用紫外檢測器在波長254 nm處對目標物進行檢測。

HPLC分析色譜條件：進樣量20 μL，柱流量1 mL/min，使用梯度洗脫，流動相A為水，流動相B為甲醇，流動相B在30 min內(nèi)從55%升至75%，然后在隨后10 min內(nèi)升至90%，維持10 min。

2 結(jié)果與分析

2.1 生物胺衍生物及色譜分離

本研究對腐乳的8種生物胺（腐胺、尸胺、酪胺、組胺、色胺，β-苯乙胺、精胺、亞精胺）進行了定量檢測，該8種生物胺的分子結(jié)構(gòu)信息見表1。由表1可知，腐胺、尸胺、精胺、亞精胺為脂肪族生物胺；酪胺、β-苯乙胺為芳香族生物胺；組胺和色胺為雜環(huán)生物胺。每種生物胺分子在所含胺基類型上存在較大差異，腐胺、尸胺、酪胺和β-苯乙胺只含伯胺基，而精胺、亞精胺、組胺和色胺則同時含有伯胺基和仲胺基。不同生物胺分子在所含的胺基數(shù)量上也存在較大差別，β-苯乙胺和酪胺分子只含1個胺基，而精胺分子則含有4個胺基。

表1 8種生物胺的分子結(jié)構(gòu)Table 1 Molecular structure of 8 kinds of biogenic amines

盡管許多衍生劑，如9-芴甲氧羰酰氯[17]、苯甲酰氯[18]、4-二甲胺基苯基偶氮苯磺酰氯[19]等，均能與生物胺分子中的伯胺基和仲胺基中的至少一個發(fā)生反應(yīng)，但產(chǎn)生的這些生物胺衍生物穩(wěn)定性不佳，容易降解[20]，而丹磺酰氯與生物胺形成的衍生物即便在室溫下也能在48 h內(nèi)保持足夠的穩(wěn)定性[20]，因此，選擇丹磺酰氯對樣品中的生物胺進行了衍生，以確保目標物在高效液相色譜批處理分析過程中具有足夠的穩(wěn)定性。

丹磺酰氯與伯胺基和仲胺基均能發(fā)生反應(yīng)，并且在反應(yīng)過程中均釋放出氯化氫，故反應(yīng)體系維持堿性環(huán)境對加快反應(yīng)速率和提高衍生產(chǎn)物得率非常必要[21]。此外，酪胺分子的羥基也能與丹磺酰氯發(fā)生反應(yīng)，這是丹磺酰氯區(qū)別于其他胺基衍生化試劑的一個典型特征[22]。丹磺酰氯衍生生物胺的反應(yīng)如下：

生物胺標準物質(zhì)衍生物的HPLC分析結(jié)果見圖1。由圖1可知，每種衍生物都實現(xiàn)了基線分離，且峰形尖銳和對稱，未見明顯前沿峰和拖尾峰。由于衍生物極性不同，故其在C18色譜柱上的保留時間也存在響應(yīng)差異，色胺衍生物的保留時間最短，而精胺衍生物的保留時間最長。精胺具有極性的四個胺基均被丹磺酰氯衍生，致使其極性顯著降低，這是其保留時間最長的關(guān)鍵原因。

圖1 生物胺標準物質(zhì)衍生物HPLC分析色譜圖Fig. 1 Chromatogram of biogenic amine standard derivatives analyzed by HPLC

2.2 腐乳樣品中生物胺含量的測定

由圖2可知，腐乳樣品中存在的主要生物胺為色胺、β-苯乙胺、腐胺、尸胺、組胺和酪胺。由于在絕大多數(shù)樣品中精胺和亞精胺的含量都接近或低于檢出限0.5 mg/kg，因此在本研究中未對該兩種生物胺的含量進行統(tǒng)計學(xué)分析。

圖2 紅方腐乳和白方腐乳中生物胺含量的比較Fig. 2 Comparison of biogenic amines contents in red and white sufu

對于紅方腐乳樣品，生物胺的平均含量由高到低依次為酪胺、組胺、腐胺、色胺、β-苯乙胺和尸胺，含量分別為56.4 mg/kg、30.6 mg/kg、17.4 mg/kg、12.8 mg/kg、3.1 mg/kg和2.7 mg/kg；對于白方腐乳，生物胺的平均含量由高至低依次為酪胺、腐胺、組胺、色胺、尸胺和β-苯乙胺，含量分別為90.9 mg/kg、59.6 mg/kg、56.9 mg/kg、42.6 mg/kg、8.1 mg/kg和7.7 mg/kg。由此可見，紅方腐乳與白方腐乳在不同類型生物胺水平的高低規(guī)律上大致相似，僅是二者在組胺和酪胺的順序上相反。在該圖中也可以發(fā)現(xiàn)另一個明顯的規(guī)律，即白方腐乳中每種生物胺的水平都顯著高于紅方腐乳（P＜0.05）。白方腐乳中色胺、β-苯乙胺、腐胺、尸胺、組胺和酪胺的含量分別為紅方腐乳的3.3、2.3、3.4、3.0、1.9和1.6倍。

2.3 腐乳中不同類型生物胺含量水平

將白方腐乳和紅方腐乳共計160個樣品放在一起進行統(tǒng)計以分析不同種類生物胺在含量水平上的差異，結(jié)果見圖3。由圖3可知，在腐乳樣品中含量最高的生物胺是酪胺、組胺和腐胺次之，色胺再次之，β-苯乙胺和尸胺含量最低。上述6種生物胺在它們的含量水平上差距很大，酪胺的平均水平約是β-苯乙胺和尸胺的13.6倍。

圖3 腐乳樣品中不同類型生物胺含量比較Fig. 3 Comparison of different types of biogenic amines contents in sufu samples

2.4 腐乳中酪胺和組胺含量頻數(shù)

由于組胺和酪胺是食品中毒性最強也是最被關(guān)注的生物胺，因此進一步對不同腐乳樣品中的酪胺和組胺的水平進行了頻數(shù)統(tǒng)計分析，結(jié)果見表2。

由表2可知，不同樣品中的組胺和酪胺水平高度分散。酪胺含量范圍為8.9～146.0 mg/kg，最高含量是最低含量的16.4倍；組胺含量范圍為4.5～155.5 mg/kg，最高含量是最低含量的34.6倍。在總樣品中，有10%樣品的酪胺含量高于119.0 mg/kg，這些樣品均為白方腐乳；在總樣品中，有10%樣品的組胺水平高于81.1 mg/kg，這些樣品只有1個為紅方腐乳，其余樣品均為白方腐乳。

表2 腐乳樣品中酪胺和組胺含量的頻數(shù)統(tǒng)計結(jié)果Table 2 Frequency statistics results for tyramine and histamine content in sufu samples

3 討論

高蛋白發(fā)酵食品腐乳中生物胺含量過高的現(xiàn)象已逐漸受到關(guān)注，食品發(fā)酵過程中生物胺產(chǎn)生的途徑見圖4。高含量生物胺的產(chǎn)生與產(chǎn)品在發(fā)酵過程中產(chǎn)生足夠的游離氨基酸、發(fā)酵微生物能夠分泌高活性的氨基酸脫羧酶、發(fā)酵條件促進脫羧酶活性微生物的生長及代謝等因素都有關(guān)[23]。腐乳是以大豆為原料，經(jīng)磨漿、成坯、前酵、腌制、后酵等過程制成的傳統(tǒng)發(fā)酵豆制品。大豆中蛋白質(zhì)含量約40%，其氨基酸組成與牛奶蛋白質(zhì)接近，除蛋氨酸略低外，其余必需氨基酸含量均較豐富，是植物性的完全蛋白質(zhì)[24]。在腐乳發(fā)酵的前酵階段，通常采用純菌接種發(fā)酵，除了黑龍江克東腐乳等少數(shù)腐乳接種的是微球菌屬的細菌外[25]，其他的腐乳接種的主要是毛霉屬和根霉屬等霉菌微生物，霉菌在豆腐坯周圍形成菌絲，同時利用菌體分泌的淀粉酶將豆腐中的少量淀粉糖化，利用分泌的蛋白酶和肽酶將蛋白質(zhì)水解為肽和游離氨基酸，而在后酵階段，需要在此基礎(chǔ)上再加入食鹽、紅曲、黃酒等輔料然后再裝壇進行發(fā)酵，是毛霉菌和其他多種微生物共同參與的復(fù)雜發(fā)酵過程[26]。本研究發(fā)現(xiàn)白方腐乳樣品中存在較高水平的酪胺、組胺和腐胺的現(xiàn)象與腐乳發(fā)酵過程中產(chǎn)生的大量游離酪氨酸、組氨酸和精氨酸有關(guān)，因為后者分別是前者產(chǎn)生的前體物質(zhì)[27]。

圖4 食品發(fā)酵過程中生物胺的產(chǎn)生途徑Fig. 4 Production pathways of biogenic amines during food fermentation

在本研究中發(fā)現(xiàn)的白方腐乳中生物胺水平普遍高于紅方腐乳的現(xiàn)象應(yīng)與發(fā)酵工藝有關(guān)。在紅方腐乳發(fā)酵過程中要加入紅曲米和白酒（或黃酒）等，紅曲米中含有紅曲霉微生物，接種后其在一定程度上主導(dǎo)后發(fā)酵過程，從而抑制其他具有更強氨基酸脫羧酶活性微生物的生長或繁殖，再者，紅曲米中含有紅曲霉的活性代謝物洛伐他汀[28]，其關(guān)鍵作用是能夠抑制體內(nèi)膽固醇合成的關(guān)鍵酶3-羥基-3-甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶的活性，進而發(fā)揮體內(nèi)降膽固醇活性[29]，由紅曲米接種引入的洛伐他汀可能對參與發(fā)酵微生物的氨基酸脫羧酶或其他代謝酶產(chǎn)生一定程度的抑制作用，進而影響了發(fā)酵微生物的氨基酸脫羧酶活性或其他代謝活性。另外，在紅方腐乳制備過程中添加的白酒或黃酒等在一定程度上也抑制了部分微生物的生長或代謝，進而也會影響最終產(chǎn)品中的生物胺水平。無論是白方腐乳還是紅方腐乳，其生物胺水平均呈現(xiàn)高度分散化，這主要與發(fā)酵微生物的構(gòu)成有關(guān)，并且也與發(fā)酵時間、發(fā)酵工藝、輔料種類等有關(guān)[30-31]。目前我國僅對鮮、凍動物性水產(chǎn)品中的組胺含量進行了限量要求，規(guī)定鮐魚和其他魚類中組胺的限量分別為400 mg/kg和200 mg/kg，而美國則對所有食品中的組胺含量進行限量要求，限值為50 mg/kg[32]。在本研究檢測的白方腐乳和紅方腐乳樣品中分別有約60%和10%的樣品超過了美國的限量標準，說明我國市售腐乳特別是白方腐乳在組胺含量上存在著一定安全隱患。由此可見，在國家標準層面，制定和出臺腐乳中生物胺特別是組胺的限量標準以確保腐乳產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展非常必要。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，在我國市售的腐乳中存在的主要生物胺有6種，其平均含量由高至低依次為酪胺、組胺、腐胺、色胺、β-苯乙胺、尸胺，每種生物胺在白方腐乳中的平均水平均顯著高于紅方腐乳，且在不同品牌之間高度差異化。但由于組胺和酪胺相對于其他生物胺具有更高毒性作用及潛在多靶點潛在危害效應(yīng)，因此生產(chǎn)企業(yè)通過優(yōu)化工藝特別是嚴控發(fā)酵劑菌種使用以降低腐乳中組胺和酪胺水平非常必要。