孟建宇 郭慧琴 賈麗娟 楊鴻儒 馮福應(yīng)

摘要：旨在揭示內(nèi)蒙古荒漠灌木內(nèi)生解磷菌類群，為認識和利用荒漠植物內(nèi)生促生菌提供基礎(chǔ)。用無機磷、有機磷培養(yǎng)基分離篩選荒漠灌木內(nèi)生解磷菌;用16S rDNA基因序列分析解磷菌的菌群結(jié)構(gòu);用鉬銻鈧比色法測定菌株的解無機磷能力;用釩鉬比色法測定菌株的解有機磷能力;通過鉻天青S（CAS）定性檢測和分光光度計定量分析菌株的產(chǎn)鐵載體能力。結(jié)果表明，從荒漠灌木根部共分離得到12株解磷細菌，分屬于4綱7屬，其中芽孢桿菌綱（Bacilli，41.67%）為最優(yōu)勢菌綱，芽孢桿菌屬（Bacillus，41.67%）為最優(yōu)勢菌屬;8株菌可以使無機磷培養(yǎng)基（PVK培養(yǎng)基）變色，解無機磷能力較強，達5.32～23.99 μg/mL;這8株菌中有6株菌可在有機磷培養(yǎng)基上生長，其解有機磷能力為 .01～96.15 μg/mL;有5株具有產(chǎn)鐵載體能力，其產(chǎn)鐵載體的相對含量（As/Ar）范圍為0.47～0.87。由研究結(jié)果可以看出，內(nèi)蒙古荒漠灌木植物內(nèi)生解磷細菌類群多樣，可作為多種植物內(nèi)生促生菌的重要來源。

關(guān)鍵詞：荒漠灌木;內(nèi)生解磷菌;解磷能力;產(chǎn)鐵載體能力;芽孢桿菌

中圖分類號：S154.39;S182文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2022）12-0260-05

收稿日期：2021-07-27

基金項目：內(nèi)蒙古自治區(qū)自然科學基金（編號：2018MS03042、2020BS03045）;內(nèi)蒙古自治區(qū)應(yīng)用技術(shù)研究與開發(fā)資金（編號：2021GG0360）;2020-科技興蒙-草種業(yè)技術(shù)創(chuàng)新中心-2項目（編號：RZ2100000122）;內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學生命科學學院科研創(chuàng)新團隊項目（編號：202104）。

作者簡介：孟建宇（1977—），男，內(nèi)蒙古烏蘭察布人，碩士，副教授，從事資源與環(huán)境微生物研究，E-mail：meng_jianyu@imau.edu.cn;共同第一作者：郭慧琴（1979—），女，內(nèi)蒙古呼和浩特人，碩士，副教授，從事應(yīng)用與環(huán)境微生物研究，E-mail：huiqinguo@126.com。

磷是植物生長過程中必需的重要營養(yǎng)元素和養(yǎng)分資源[1]，對植物的抗逆性、抗病性和光合作用都有影響。土壤中生物可利用的磷僅占總磷含量的0.1%，可利用磷的匱乏導(dǎo)致植物獲取有效磷的途徑受限，嚴重影響了作物的正常生長[2-3]。據(jù)報道，土壤中無效態(tài)磷占95%以上，很難被植物直接吸收利用，嚴重限制了農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展[4]。與其他環(huán)境相比，寒旱區(qū)土壤缺磷更是普遍存在的現(xiàn)象[5]，是影響農(nóng)業(yè)高產(chǎn)的主要因素。

土壤中存在大量解磷微生物，可以提高植物對磷的需求，并且它們廣泛參與不可溶性磷的轉(zhuǎn)化[6]。解磷微生物通過溶解和礦化作用將土壤中的無效磷轉(zhuǎn)化為有效磷。此外，解磷微生物不僅可以促進土壤中其他養(yǎng)分（如碳、氮）的運轉(zhuǎn)和循環(huán)，也可以促進植物的生長和發(fā)育。因此，利用解磷微生物提高土壤有效磷含量是既經(jīng)濟又有利于農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的措施。

植物內(nèi)生細菌在宿主體內(nèi)多定殖于植物的根、莖、葉、果實及種子中，與宿主形成互惠共生關(guān)系，通過信號傳導(dǎo)或自身代謝物對其施加影響[7]，在植物-土壤反饋機制中扮演著重要角色[8]，是高效解磷菌的重要來源庫[9]。植物內(nèi)生解磷菌的促生和生防功效能協(xié)助植物抵御各種逆境脅迫[10-11]。因此，探究植物內(nèi)生菌在磷素循環(huán)中的作用意義重大。

灌木作為荒漠的主要植被組成，在防風固沙、保持水土和改善氣候等方面具有重要的生態(tài)功能[12]。由于內(nèi)蒙古自治區(qū)51.50%的面積為荒漠區(qū)，因此分析內(nèi)蒙古自治區(qū)荒漠灌木內(nèi)生解磷菌類群、認識荒漠解磷菌多樣性及促生功能，對于改良和保護荒漠地區(qū)的生態(tài)環(huán)境具重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 樣品采集 試驗樣品為2019年9月采自內(nèi)蒙古西鄂爾多斯巴拉貢地區(qū)的霸王、 四合木、沙冬青、半日花和白刺5種灌木植物的主根和須根。

1.1.2 培養(yǎng)基配方 牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：3.0 g/L牛肉膏，10.0 g/L蛋白胨，5.0 g/L氯化鈉，pH值為7.0～7.5。LB培養(yǎng)基：10.0 g/L胰蛋白胨，5.0 g/L酵母粉，5.0 g/L氯化鈉，pH值為7.2。無機磷培養(yǎng)基：10.00 g/L葡萄糖，10.00 g/L磷酸鈣，0.30 g/L硫酸鎂，0.30 g/L氯化鉀，0.50 g/L硫酸銨，0.30 g/L氯化鈉，0.03 g/L硫酸亞鐵，0.03 g/L硫酸錳，pH值為7.0～7.5。無機磷培養(yǎng)基（PVK培養(yǎng)基）：10.000 g/L 葡糖糖，5.000 g/L磷酸鈣，0.500 g/L硫酸銨，0.200 g/L氯化鈉，0.100 g/L硫酸鎂，0.200 g/L 氯化鉀，0.500 g/L酵母粉，0.002 g/L硫酸錳，0.002 g/L硫酸亞鐵，0.600 g/L 0.4%溴酚藍，18.000 g/L瓊脂，pH值為7.0～7.2。有機磷培養(yǎng)基：10.0 g/L葡萄糖，0.2 g/L硫酸銨，5.0 g/L氯化鎂，0.5 g/L硫酸鎂，0.1 g/L氯化鉀，2.0 g/L植酸鈣。液體發(fā)酵培養(yǎng)基：15.00 g/L葡萄糖，3.00 g/L蛋白胨，20.00 g/L可溶性淀粉，0.50 g/L硫酸銨，0.50 g/L氯化鉀，0.03 g/L 硫酸鎂，0.03 g/L硫酸錳，0.04 g/L硫酸亞鐵，0.02 g/L磷酸二氫鉀，pH值為5.5。蔗糖-天冬氨酸（MSA）培養(yǎng)基：20.0 g/L蔗糖，2.0 g/L天冬酰胺，1.0 g/L磷酸氫二鉀，0.5 g/L硫酸鎂，pH值為7.0。鉻天青S（CAS）固體培養(yǎng)基：葡萄糖 100.0 g/L，蛋白胨 0.0 g/L，硫酸鎂 0.5 g/L，氯化鈣5.0 g/L，哌嗪1，4-二乙磺酸32.24 g/L，瓊脂20.0 g/L，氯化鐵0.002 7 g/L，鉻天青S 0.06 g/L，十六烷基三甲基溴化銨0.073 g/L，pH值為6.8。

1.2 試驗方法

1.2.1 植物內(nèi)生解磷細菌的分離 稱取2 g植株根部小段，按如下方法進行表面消毒：用75%乙醇浸泡2 min→用無菌水漂洗→用0.1%氯化汞浸泡 1～3 min→用無菌水漂洗5～6次。然后在無菌研缽（含10 mL無菌水）中研磨。將研磨液轉(zhuǎn)入無菌玻璃管中進行稀釋后倒平板，各稀釋梯度設(shè)置3個平行，于26℃培養(yǎng)。5 d后挑取形態(tài)各異的單菌落劃線純化培養(yǎng)。將純化后的菌株分別接種于PVK固體培養(yǎng)基和有機磷培養(yǎng)基上進行篩選。

1.2.2 菌株的16S rDNA的鑒定及其同源性分析 菌株的16S rDNA基因擴增引物為細菌通用引物27F、1492R。PCR產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序，將測序得到的16S rDNA序列通過Blast-n與EX-TAXON數(shù)據(jù)庫進行比對，用MEGA 6.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.3 解無機磷能力的測定 將菌株在PVK培養(yǎng)基平板上劃線培養(yǎng)3 d，挑選變?yōu)樗{色的菌落。采用鉬銻鈧比色法測定菌株的解磷能力。將初篩菌株接種于LB培養(yǎng)基上后，在28 ℃搖床中振蕩過夜。將菌液在10 000 r/min條件下離心后制成菌懸液，取0.5 mL接種到無機磷培養(yǎng)基上，在30 ℃、170 r/min搖床上培養(yǎng)7 d后，10 000 r/min離心并測定上清液的pH值。取1.25 mL上清液于比色管中，再加入2.5 mL鉬銻抗比色劑，用去離子水定容后靜置 30 min，測定D730 nm，根據(jù)標準曲線y=2.733x+0.011（r2=0.997 5）計算含磷量。

1.2.4 解有機磷能力的測定 利用釩鉬比色法測定菌株解植酸磷能力。將能在有機磷培養(yǎng)基上生長的菌株接種于LB液體培養(yǎng)基上，在28 ℃搖床上培養(yǎng)過夜，10 000 r/min離心收集菌體。用生理鹽水稀釋菌體制成菌懸液，取0.5 mL菌懸液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，在30 ℃、160 r/min搖床上發(fā)酵培養(yǎng) 72 h 后10 000 r/min離心，取1 mL上清液，再加入1 mL濃度為8.4 g/L的植酸鈉溶液，于37 ℃保溫30 min后中止反應(yīng)，測定D415 nm。參照標準曲線y=24.389x+0.037（r2=0.994 7）計算含磷量。

1.2.5 產(chǎn)鐵載體能力的測定 用滅菌牙簽挑取單菌落后接種于CAS培養(yǎng)基平板上，每個平板接種4個點，每個菌株設(shè)3次重復(fù)，于28 ℃恒溫培養(yǎng)96 h。測定暈圈直徑（D）及菌落直徑（d）并計算其比值（D/d）。對于篩選得到的產(chǎn)鐵載體能力較強的菌株，參考Payne的方法[13]進行定量測定。將菌株接種到MSA培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h，將菌液于6 000 r/min條件下離心后取1.5 mL上清液，再加1.5 mL CAS溶液充分混勻，1 h后測定D630 nm（As），以雙蒸水為對照。另取 1.5 mL CAS溶液，加入1.5 mL MSA培養(yǎng)基的上清液后測定D630 nm（參比值，Ar）。以As/Ar表示鐵載體的相對含量，其值越低，表示鐵載體的含量越高。As/Ar（1.0～0.0）表示每減小0.2增加1個“+”;As/Ar低于0.5，表示產(chǎn)鐵載體能力較強（+++）[14]。

2 結(jié)果與分析

2.1 內(nèi)生解磷菌的分離及類群分析

從內(nèi)蒙古荒漠5種灌木根內(nèi)共分離得到12株解磷細菌，其中半日花2株，霸王2株，白刺1株，沙冬青2株，四合木5株。內(nèi)生解磷細菌分類類群組成（表1）和系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果（圖1）表明，12株解磷細菌分屬于α-變形菌綱（α-Proteobacteria，占比25.00%）、γ-變形菌綱（γ-Proteobacteria，占比16.67%）、芽孢桿菌綱（Bacilli，占比41.67%）和放線菌綱（Actinobacteria，占比16.67%），其中芽孢桿菌綱為最具優(yōu)勢的類群，其次為γ-變形菌綱和放線菌綱。在屬分類水平上，12株解磷細菌分屬于7個屬，分別為根瘤菌屬（Rhizobium，2株）、中華根瘤菌屬（Sinorhizobium，1株）、單胞菌屬（Stenotrophomonas，1株）、假單胞菌屬（Psedumonas，1株）、芽孢桿菌屬（Bacillus，5株）、節(jié)桿菌屬（Arthrobacter，1株）和短桿菌屬（Brevibacterium，1株），其中芽孢桿菌屬為最具優(yōu)勢的菌屬，占總菌數(shù)的41.67%，其次為根瘤菌屬，占總菌數(shù)的16.67%。在不同灌木之間，分離得到的內(nèi)生解磷細菌類群組成差異較明顯，其中芽孢桿菌屬分布較廣，存在于4種灌木中，其余屬僅分布于1種灌木中，如根瘤菌屬只在半日花中分離到，中華根瘤菌屬、假單胞菌屬和短桿菌屬只在四合木中分離到，單胞菌屬只在霸王中分離到，節(jié)桿菌屬只在沙冬青中分離到。

2.2 解無機磷能力

對既能在無機磷培養(yǎng)基上生長，又能使PVK平板產(chǎn)生明顯顏色變化的8株菌（RP0201、RP0501、RP0604、RP0101、RP0203、RP0607、RP0303、RP0601）的解磷能力進行測定，由圖2可知，各菌株的解無機磷（磷酸鈣）能力在5.32～9.08 μg/mL之間;有4株菌的解磷能力大于16 μg/mL，占總數(shù)的50%，其余4株菌的解磷能力在5.32～9.08 μg/mL 之間;解磷能力最強的是分離自霸王的菌株RP020 為23.99 μg/mL，具有良好的應(yīng)用潛力。

2.3 解有機磷能力

本研究對菌株的解無機磷能力進行定性分析后，將解無機磷能力較強的8株菌在有機磷液體發(fā)酵培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)其中6株菌有解有機磷（植酸磷）的能力。從圖3可以看出，解有機磷能力高于 45 μg/mL 的菌株有4株，占總數(shù)的66.67%，分別是分離自半日花的菌株RP0101（96.15 μg/mL）、分離自四合木的菌株RP0604（46.52 μg/mL）、分離自霸王的菌株RP0201（56.64 μg/mL）和分離自白刺的菌株RP0303（51.40 μg/mL）; 分離自四合木的菌株RP0607的解有機磷能力為19.08 μg/mL，而分離自霸王的菌株RP0203只有2.01 μg/mL。綜上可知，菌株RP0101的解有機磷能力最強，具有較好的應(yīng)用潛力。

2.4 產(chǎn)鐵載體分析

利用CAS檢測平板和分光光度法對篩選出的8株內(nèi)生解磷菌的產(chǎn)鐵載體能力進行測定。由表2可以看出，有5株解磷菌具有產(chǎn)鐵載體能力，這些菌株的As/Ar范圍為0.47～0.87;菌株RP0101、RP0604和RP0501的產(chǎn)鐵載體能力較高;所篩選的內(nèi)生解磷菌中產(chǎn)鐵載體菌株占62.5%，能力較強的菌株所占比例為37.5%。

3 結(jié)論與討論

目前，有關(guān)解磷菌的研究主要集中于土壤和根際，對于內(nèi)生菌的解磷活性報道還較少。本研究從內(nèi)蒙古5種植物根內(nèi)生組織中分離得到12株解磷細菌，分屬4綱7屬，說明內(nèi)蒙古荒漠灌木有種類豐富的根內(nèi)解磷菌資源。Kumar在印度哈里亞納邦干旱半干旱地區(qū)所分離得到的解磷菌絕對優(yōu)勢門、屬分別為厚壁菌門（Firmicutes）、芽孢桿菌屬[15]，本研究中干旱的內(nèi)蒙古荒漠灌木根部優(yōu)勢解磷菌群的研究結(jié)果與之一致。

經(jīng)過PVK平板劃線后，很多菌株都沒有表現(xiàn)出解無機磷的能力，即便具有解磷能力，其能力也都不高。目前已報道的解磷能力較強的植物內(nèi)生菌都是來自生長環(huán)境條件較好的作物或草地優(yōu)勢植物，如李振東等從乳白香青中分離得到4株內(nèi)生解磷菌，解磷量為65.24～315.36 mg/L[9]。本研究中發(fā)現(xiàn)，解磷菌培養(yǎng)液的pH值（4.13～5.79）都有不同程度的下降，但與解磷量沒有很強的正相關(guān)性，這與很多研究報道的結(jié)果[16-18]類似。

在本研究篩選出的解有機磷菌中，絕大多數(shù)為假單胞菌（33.3%）和芽孢桿菌（50.0%）。其中，解有機磷能力高于45 μg/mL的有4株，解有機磷能力最高的菌株是RP010 解有機磷能力高達 96.15 μg/mL，處于較高水平。在本研究中，具有解有機磷能力的菌株占所篩菌株總數(shù)的50%，分屬于3屬，表明荒漠環(huán)境中具有豐富的解有機磷植物內(nèi)生菌。本研究篩選得到的具有產(chǎn)鐵載體能力的菌株占總菌數(shù)的41.67%，且絕大多數(shù)（80%）為解有機磷細菌，表明內(nèi)蒙古荒漠植物可成為篩選較高促生能力的解有機磷內(nèi)生菌的重要來源。

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