■楊小軍 雷新建 王佳堃 孔祥峰 蘇 勇 曾祥芳 劉作華 姚軍虎*

（1.西北農(nóng)林科技大學動物科技學院，陜西 楊凌 712100；2.浙江大學動物科學學院，浙江 杭州 310058；3.中國科學院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所，湖南 長沙 410125；4.南京農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，江蘇 南京 210095；5.中國農(nóng)業(yè)大學動物科學技術學院，北京 100193；6.重慶市畜牧科學院，重慶 402460）

消化道是動物機體消化吸收營養(yǎng)物質(zhì)的主要場 所，其形態(tài)結構的完整性是保證營養(yǎng)正常吸收的基礎。消化道上皮細胞按照單層有序排列，對腸腔內(nèi)的物質(zhì)進行選擇性透過，實現(xiàn)營養(yǎng)物質(zhì)的流動過程。伴隨食物進入消化道內(nèi)的雜質(zhì)和致病原直接與消化道接觸，物理屏障在保證消化道對食物中營養(yǎng)物質(zhì)消化吸收的同時，維持消化道通透性，阻隔有害物質(zhì)或病原微生物進入機體內(nèi)部。消化道物理屏障受損可能導致有害物質(zhì)和微生物進入動物血液，危害機體健康。因此，完整的物理屏障對養(yǎng)分攝入和機體健康有重要作用。消化道物理屏障分為增加營養(yǎng)物質(zhì)吸收面積的乳頭、絨毛與隱窩等組織形態(tài)學結構，維持消化道通透性的細胞緊密連接，以及緩沖隔離食糜、覆蓋上皮細胞的黏液層。文章對畜禽消化道物理屏障的功能與影響因素展開綜述，結合Meta 分析探究評價畜禽胃腸道物理屏障的測定指標，并提供相關指標的健康范圍，以期為畜禽消化道健康的物理屏障評估提供指標和參數(shù)支撐。

1 消化道物理屏障及其影響因素

1.1 瘤胃乳頭

瘤胃是高效降解碳水化合物的天然生物反應器，含有多種細菌、真菌、古細菌、原生動物，是保障養(yǎng)分利用和機體健康的基礎。幼齡反芻動物的瘤胃體積小，發(fā)育不完全，且不具備纖維消化功能，瘤胃乳頭高度和上皮固有層厚度均隨日齡的增加而逐步提高。瘤胃形態(tài)和功能的完善是幼齡反芻動物發(fā)育成熟的重要標志之一。成年反芻動物瘤胃內(nèi)壁出現(xiàn)大量乳頭狀突起，既可增加瘤胃內(nèi)壁表面積，增強瘤胃對揮發(fā)性脂肪酸（volatile fatty acids，VFA）等營養(yǎng)物質(zhì)的吸收能力；又能增加代謝產(chǎn)物從瘤胃上皮進入毛細血管的速率來促進代謝活動；此外還具有一定的免疫保護功能。瘤胃乳頭最外層是由完全角質(zhì)化的細胞構成的角質(zhì)層，可保護乳頭免受瘤胃食糜的磨損侵蝕，同時角質(zhì)化程度也直接影響瘤胃乳頭對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收。

瘤胃乳頭是反映瘤胃健康的形態(tài)學基礎，而營養(yǎng)素是調(diào)節(jié)瘤胃乳頭發(fā)育的主要因素之一。高精料水平的飼糧可顯著降低瘤胃乳頭的上皮總厚度，但過量的淀粉精料反而對瘤胃乳頭的發(fā)育不利。VFA 為瘤胃乳頭發(fā)育提供必需的營養(yǎng)物質(zhì)，丁酸可調(diào)控上皮細胞增殖和凋亡，增加瘤胃乳頭的生長速度。丙酸和乙酸也能促進乳頭發(fā)育，但效果弱于丁酸。熱應激會增加反芻動物精飼料的采食量，其中淀粉攝入量的加大使得動物的瘤胃乳頭高度有所增加，并對瘤胃乳頭上皮的角質(zhì)層有一定程度的損傷。瘤胃上皮對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收轉運很大程度上依賴于角質(zhì)層細胞的角質(zhì)化程度。高濃度營養(yǎng)飼糧水平能增加瘤胃上皮基底層細胞數(shù)量，基底層細胞分化向上遷移，引起顆粒層和棘層細胞數(shù)量增加，從而促進瘤胃上皮乳頭的發(fā)育。但當反芻動物發(fā)生亞急性瘤胃酸中毒時，瘤胃pH 快速下降導致內(nèi)毒素和組胺的形成，刺激瘤胃上皮出現(xiàn)炎癥，加重瘤胃上皮細胞的損傷。高精料日糧山羊瘤胃角質(zhì)層脫落明顯，角質(zhì)層細胞和顆粒層之間的黏附受到損害，破壞瘤胃上皮的形態(tài)結構，進而影響其屏障功能。

1.2 腸道絨毛與隱窩

腸上皮細胞有序內(nèi)陷形成隱窩，上有指狀細小突起為腸道絨毛，形成了小腸的主要形態(tài)結構，極大增加了營養(yǎng)物質(zhì)消化吸收的面積。腸道絨毛高度（vil?lus height，VH）是反映小腸消化和吸收能力的主要指標，VH 增加，腸道的吸收面積增大。隱窩深度（crypt depth，CD）體現(xiàn)腸道細胞的生成速度，通常較淺的CD意味著更快的細胞成熟率和更強的營養(yǎng)吸收功能。腸道絨毛高度/隱窩深度（VH/CD）是評估小腸吸收能力的重要參數(shù)，VH/CD降低則預示著黏膜損傷和營養(yǎng)吸收能力下降。

研究表明多種添加劑可通過促進腸道發(fā)育和完善消化道屏障進而促進營養(yǎng)物質(zhì)的吸收利用，改善生長性能。日糧中補充蘇氨酸可提高肉仔雞腸道VH，進而減輕注射脂多糖誘導的炎癥反應。在肉雞日糧中添加谷氨酰胺可增加十二指腸和空腸的VH和表面積。Hamid 等（2018）研究發(fā)現(xiàn)，酸化飲水可顯著提高肉雞空腸VH，并改善肉雞生產(chǎn)性能。胡貴麗等（2018）研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加博落回生物堿顯著提高黃羽肉雞空腸VH 和VH/CD。腸上皮細胞在發(fā)揮營養(yǎng)吸收功能的同時，自身細胞代謝也相對旺盛，對能量需求較大。食糜中結構性多糖（包括可溶性膳食纖維、低聚糖、抗性淀粉等）可在腸道微生物的發(fā)酵下生成短鏈脂肪酸，直接被腸上皮細胞作為營養(yǎng)物質(zhì)吸收，促進腸道發(fā)育，保障物理屏障功能正常。Tian 等（2018）發(fā)現(xiàn)日糧補充低聚半乳糖能顯著降低21日齡仔豬空腸CD。田時祎等（2018）研究發(fā)現(xiàn)，早期灌喂低聚半乳糖顯著提高仔豬回腸VH/CD。消化道疾病的發(fā)生往往伴隨著腸道形態(tài)學結構的病變，隱窩細胞增殖和上皮細胞凋亡之間的平衡改變導致腸絨毛萎縮和隱窩增生，從而導致營養(yǎng)吸收表面的損失。感染球蟲病肉雞的腸道炎癥導致絨毛壞死，其特征是VH/CD 降低、隱窩擴張和杯狀細胞減少。在熱應激狀態(tài)下，肉雞空腸VH 下降，CD 增加，VH/CD 降低。Ma 等（2020）研究發(fā)現(xiàn)日糧補充酵母細胞壁顯著提高犢牛回腸的VH 和VH/CD。Zhang 等（2020）發(fā)現(xiàn)用淀粉芽孢桿菌或短小芽孢桿菌喂養(yǎng)斷奶山羊可促進瘤胃乳頭和小腸絨毛的生長。Costa 等（2019）發(fā)現(xiàn)日糧添加甘露聚糖顯著提高犢?？漳cVH。

1.3 緊密連接與通透性

腸上皮的一個重要作用是將管腔內(nèi)容物與間質(zhì)分開，這一功能的發(fā)揮主要依賴腸上皮的完整性和細胞旁空間的緊密連接。腸上皮細胞間的連接方式包括橋粒（desmosome）、半橋粒（hemidesmosome）、黏附連接（adherence junction）、間隙連接（gap junction）和緊密連接（tight junction）等多種形式。其中緊密連接是腸道上皮細胞之間的主要連接方式，也是調(diào)節(jié)腸道黏膜通透性和屏障功能的關鍵結構。緊密連接通過連接復合體中的閉合蛋白（Claudins）和其他蛋白質(zhì)結構調(diào)節(jié)水、離子和小分子的流動。緊密連接復合體由膜內(nèi)蛋白、封閉蛋白和閉合蛋白家族的不同成員組成。與緊密連接相關的蛋白質(zhì)包括跨膜蛋白和細胞骨架蛋白?？缒さ鞍装艘Ш系鞍祝∣ccludin，OCLN）家族、閉合蛋白（Claudin，CLDN）家族和連接黏附分子（Junction adhesive molecule，JAM）家族，細胞骨架蛋白僅包含閉合小環(huán)蛋白（Zonula occludens，ZO）家族。OCLN家族是經(jīng)典的腸上皮細胞緊密連接蛋白，可封閉細胞間隙，過濾小分子和大分子物質(zhì)。CLDN 家族包含24 種蛋白，有4 個跨膜區(qū)和2 個胞外環(huán)狀結構，作為緊密連接的整合蛋白參與屏障大小選擇性地調(diào)節(jié)。JAM家族共有4種蛋白，在內(nèi)皮和上皮中均有緊密連接作用。JAM-2特異性定位于細胞-細胞連接處并在同型緊密連接處富集表達，具有調(diào)節(jié)內(nèi)皮和上皮細胞通透性、白細胞募集、細胞增殖等多種功能。ZO 家族在維持上皮細胞屏障功能的基礎上，還在維持上皮極性和細胞物質(zhì)轉運中發(fā)揮重要功能。

早期移植母豬的糞菌可降低仔豬血漿中內(nèi)毒素和二胺氧化酶（diamineoxidase，DAO）的濃度，降低腸道通透性。低聚半乳糖可提高哺乳仔豬空腸ZO-1和Claudin-1 的基因表達，提高新生哺乳仔豬空腸組織中ZO-1 的蛋白表達，改善腸道屏障功能。凝結芽孢桿菌可降低仔豬血漿中DAO 濃度。添加糞腸球菌NCIMB 11181 可提高肉雞緊密連接蛋白CLDN-1 的基因表達量，同時提高空腸中Claudin-1 蛋白的表達。補飼紫丁香苷顯著增加了豬空腸上皮細胞CLDN-3、OCLN 和ZO-1 的mRNA 和蛋白表達。另一方面，色氨酸可增加斷奶仔豬血清DAO 活性和內(nèi)毒素濃度，降低斷奶仔豬回腸中OCLN、ZO-1 和CLDN-1 的豐度，并降低斷奶仔豬回腸中OCLN、ZO-1 和CLDN-1的mRNA表達。大豆凝集素顯著降低仔豬小腸上皮細胞跨上皮電阻值，提高堿性磷酸酶活性，增加通透性，并降低OCLN 和CLDN-3 的蛋白表達水平。當動物處于應激狀態(tài)或患有腸道炎癥時，少量的腸腔內(nèi)毒素、共生微生物和病原體可能穿過上皮并通過緊密連接進入循環(huán)，病原體還可以刺激免疫和腸上皮細胞局部分泌促炎細胞因子。這些炎癥和應激反應可能通過肌球蛋白輕鏈激酶誘導肌球蛋白輕鏈磷酸化，導致腸上皮緊密連接的收縮和開放以及腸通透性增加。

2 益生與應激處理對腸道物理屏障影響的Meta分析

2.1 文獻檢索與篩選

此次Meta 分析的文章采用網(wǎng)絡數(shù)據(jù)庫進行電子檢索，共包含CNKI、Science Direct、Pub Med、Web of Science 四個數(shù)據(jù)庫來源。目標文獻的研究類型為探究益生或應激處理對動物消化道物理屏障影響的試驗性論文。檢索與納入文章的篩選條件包括：試驗對象為豬、蛋雞、肉雞、?；蜓?；試驗處理為飼料改良、益生菌添加等益生處理或熱應激、饑餓、添加致病菌等應激處理；試驗設計中須包含健康動物正常飼喂的空白對照組；試驗結果包含瘤胃乳頭長度、寬度、表面積和肌層厚度，腸道VH、CD 或VH/CD，血液內(nèi)毒素、D-乳酸、異硫氰酸熒光素（FITC-d）或DAO含量；胃腸道上皮OCLN、CLDN、JAM、ZO 或黏蛋白（MUC）蛋白家族的基因表達量等指標。

2.2 數(shù)據(jù)提取

從納入文章中獲得試驗動物、試驗處理、樣本類型、檢測值等原始數(shù)據(jù)。按照不同動物的應激或益生處理分組進行Meta分析，組內(nèi)包含文獻少于3篇時舍棄分組。緊密連接蛋白同基因家族中選納入文章數(shù)量最多的基因進行Meta 分析。檢測值包括平均值（mean）、標準差（SD）和樣本量（n），當文章誤差以標準誤（SE）呈現(xiàn)時可按公式換算為SD值。

SD=SE×n

按消化道不同部位劃分亞組，同一亞組中有多個處理的按公式合并。

式中：k——處理數(shù)；

mi、SDi和ni——分別為第i個處理的平均數(shù)、標準差和樣本量。

2.3 統(tǒng)計學分析

計算瘤胃乳頭和腸道絨毛的健康范圍時，將對照和益生組的平均值錄入SPSS 24.0 軟件，按n值進行個案加權后進行數(shù)據(jù)的正態(tài)性檢驗和描述性統(tǒng)計：當數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布時，取95%置信區(qū)間（CI），當數(shù)據(jù)不符合正態(tài)分布時，取上下四分位數(shù)作為健康范圍的參考值。

Meta 分析使用Stata 15.1 軟件，所有結果指標為連續(xù)型變量，使用隨機效應模型（random effect，RE）和標準均值差（standard mean difference，SMD）算法進行標準化處理后計算合并效應值和95%CI，采用U檢驗，當P≤0.05 時認為益生或應激處理顯著影響該指標。

2.4 瘤胃乳頭Meta分析結果（見表1、表2）

表1 瘤胃乳頭相關指標的Meta分析

表2 瘤胃乳頭相關指標的健康范圍

篩選到64 篇文獻符合Meta 分析要求：其中乳頭表面積10篇，肌層厚度16篇，乳頭寬度45篇，乳頭長度52篇。由表1可見，瘤胃乳頭表面積不隨益生處理發(fā)生顯著變化（P>0.05），牛的瘤胃肌層厚度、乳頭寬度和乳頭長度在益生處理后均顯著提高（P<0.05），而益生處理對羊的肌層厚度和乳頭寬度均無顯著影響（P>0.05），僅瘤胃乳頭長度在益生處理后顯著提高（P<0.05）。瘤胃乳頭相關指標的健康范圍見表2。綜合Meta 分析結果發(fā)現(xiàn)，在粗飼料、熱應激、pH 的多重調(diào)控下，瘤胃乳頭表面積、肌層厚度、乳頭長度和寬度，作為腸道物理屏障的重要評價指標，其數(shù)值大小與腸道健康程度有重要的相關性，應當將其作為評估腸道健康的指標，納入物理屏障的評價體系之中。

2.5 腸道絨毛與隱窩Meta分析結果

在四個數(shù)據(jù)庫共篩選出符合Meta 分析要求的文獻527篇：其中VH 527篇，CD 508篇，VH/CD 397篇。由表3 和圖1（a、c、e）可見，益生處理顯著增加豬、肉雞、蛋雞、羊、牛腸道VH（P<0.05），顯著降低豬、肉雞腸道CD（P<0.05），顯著增加豬、肉雞、蛋雞腸道VH/CD（P<0.05），對牛、羊腸道VH/CD 沒有顯著影響（P>0.05）。應激處理顯著降低豬、肉雞、牛的腸道VH（P<0.05），顯著增加豬腸道CD（P<0.05），顯著降低豬、肉雞腸道VH/CD（P<0.05），但對蛋雞、牛、羊腸道CD 沒有顯著影響（P>0.05）。從漏斗圖（圖1b、d、f）可見益生處理后合并效應值左右兩側文章分布對稱，表明Meta 分析結果穩(wěn)健。不同腸段的亞組分析結果見表4～表6。所用數(shù)據(jù)均不符合正態(tài)分布，因此選用四分位法Q25和Q75做指標健康范圍，結果見表7。Me?ta 分析結果表明，腸道VH 是評價畜禽腸道物理屏障的重要指標，而腸道CD 與VH/CD 是評估單胃動物腸道物理屏障的重要指標，應當將其作為評估腸道物理屏障的指標。

表3 腸道絨毛相關指標的Meta分析

表4 不同腸段VH的亞組分析

表5 不同腸段CD的亞組分析

表6 不同腸段VH/CD的亞組分析

表7 腸道絨毛相關指標的健康范圍

圖1 益生處理對羊腸道絨毛相關指標的影響

2.6 緊密連接與黏蛋白Meta分析結果

緊密連接蛋白與黏蛋白的相對表達量在四個數(shù)據(jù)庫中共篩選出400 篇文獻納入Meta 分析，其中包括：OCLN-1（273篇）、ZO-1（230篇）、CLDN-1（188篇）、MUC-2（121 篇）、ZO-2（30 篇）、CLDN-3（30 篇）、CLDN-2（25 篇）、CLDN-4（21 篇）、JAM-2（17 篇）、CLDN-5（8篇）、JAM-1（6篇）。選取各基因家族納入文章最多的基因進行Meta 分析，由表8 和圖2 可知，所有緊密連接蛋白和黏蛋白基因的表達規(guī)律相同：應激條件下基因表達下調(diào)，益生條件下基因表達上調(diào)。其中益生或應激處理對豬、肉雞、牛、羊OCLN-1基因和ZO-1 基因的表達量有顯著影響（P<0.05）；處理僅對豬和肉雞CLDN-1 基因表達有顯著影響（P<0.05），而對蛋雞、牛、羊CLDN-1 基因表達沒有顯著影響（P>0.05）；處理對豬、蛋雞、肉雞MUC-2 基因表達有顯著影響（P<0.05）；JAM-2 納入文獻較少，處理對肉雞的JAM-2 表達沒有顯著影響（P>0.05）。漏斗圖中應激處理對OCLN-1（圖2b）、ZO-1（圖2f）和CLDN-1（圖2j）表達量的合并效應值兩側文章分布不對稱，可能是由于應激處理的類型不同對相關蛋白的表達量影響不一；而益生處理下漏斗圖左右對稱（圖2d、h、l），可靠性強。不同處理下動物在各腸段中緊密連接蛋白和黏蛋白表達量差異的亞組分析結果在表9～表13 中展示。結合Meta 分析結果，評估動物腸道屏障功能時可將緊密連接蛋白相關基因，如OCLN-1、ZO-1、CLDN-1、MUC-2 等作為評估腸道物理屏障的指標。

圖2 不同處理對羊胃腸道緊密連接蛋白的影響

表8 腸道緊密連接蛋白和黏蛋白基因表達量的Meta分析

表9 不同腸段OCLN-1基因表達量的亞組分析

表10 不同腸段ZO-1基因表達量的亞組分析

表10（續(xù)） 不同腸段ZO-1基因表達量的亞組分析

表11 不同腸段CLDN-1基因表達量的亞組分析

表12 不同腸段JAM-2基因表達量的亞組分析

表13 不同腸段MUC-2基因表達量的亞組分析

2.7 通透性的Meta分析結果

腸道通透性文獻篩選后共147 篇符合Meta 分析要求，其中包括：內(nèi)毒素（23 篇）、D-乳酸（53 篇）、FITC-d（19 篇）、DAO（52 篇）。由Meta 分析結果（表14）可見，應激處理顯著提高肉雞血液內(nèi)毒素水平（P<0.05），益生處理不影響豬血液內(nèi)毒素水平（P=0.283）。益生處理顯著降低豬血液D-乳酸水平（P<0.05），應激處理顯著提高肉雞血液D-乳酸水平（P<0.05）。應激處理顯著提高肉雞血液FITC-d水平（P<0.05），但益生處理不影響肉雞血液FITC-d水平（P=0.136）。應激處理顯著提高豬、肉雞血液DAO 水平（P<0.05），益生處理顯著降低豬、肉雞血液DAO 水平（P<0.05）。綜合Meta 分析結果發(fā)現(xiàn)，腸道通透性（內(nèi)毒素、D-乳酸、FITC-d或DAO 等）是評價消化道物理屏障的有效指標。

表14 腸道通透性的Meta分析

3 結論

完整的物理屏障是消化道健康的重要標志之一，用瘤胃乳頭長度、腸道VH、CD、VH/CD和緊密連接蛋白與黏蛋白表達、腸道通透性等指標評估畜禽胃腸道物理屏障功能具有可行性。其中，瘤胃乳頭長度能夠反映反芻動物消化道的健康狀態(tài)，腸道CD、VH/CD能夠反映豬和肉雞腸道的健康狀態(tài)，腸道VH、緊密連接蛋白與黏蛋白表達以及腸道通透性指標能夠反映畜禽腸道的健康狀態(tài)。