王喜春，梁遠鋒，林展翼，3

［1.華南理工大學醫(yī)學院，廣州 510006；2.廣東省人民醫(yī)院（廣東省醫(yī)學科學院），廣州 510080；3.廣東省老年醫(yī)學研究所，廣州510080］

細胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）材料作為一種生物材料來源于哺乳動物的組織，可以用來修復(fù)或替代各種受損器官和組織，例如心臟、食管、肌腱、真皮等［1-2］。ECM 的獲得是通過對天然組織進行有效的脫細胞，實現(xiàn)完全去除細胞和細胞碎片等抗原成分，同時保留ECM 的生化組成、生物活性、三維結(jié)構(gòu)以及ECM 的完整性，從而降低植入體內(nèi)的免疫原性［3］。對于血管這樣一種對力學性能要求比較高的移植支架材料來說，如何選擇合理的評價指標來評價洗脫效果尤其重要。既往研究已經(jīng)表明，巨噬細胞是宿主應(yīng)對植入材料的第一效應(yīng)細胞，通常分為促炎型的M1 表型和促重構(gòu)的M2 表型［4］。M1 表型產(chǎn)生大量的促炎信號和細胞因子介導(dǎo)慢性炎癥的持續(xù)，損害組織再生和傷口愈合。M2 表型分泌抗炎因子發(fā)揮抗炎癥能力，可以減輕急、慢性炎癥的發(fā)生，同時通過促進祖細胞和干細胞的增殖分化，協(xié)調(diào)ECM 的再組裝和重構(gòu)［5］。未完全洗脫細胞的材料將含有殘存DNA，勢必對巨噬細胞的極化產(chǎn)生影響。本研究擬通過建立巨噬細胞極化影響的體外實驗研究，評價血管ECM 材料內(nèi)DNA 濃度是否超“閾值”，評判材料植入體內(nèi)的長期效果。

1 材料和方法

本研究已經(jīng)由南方醫(yī)科大學倫理委員會批準（審查號L2019225），所有程序都遵循其操作規(guī)范及指導(dǎo)原則進行，實驗動物均來自南方醫(yī)科大學實驗動物中心。

1.1 脫細胞血管的制備

獲取成年牛新鮮主動脈，保存在含有1%青鏈霉素的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution，PBS）（pH7.4）中。脫細胞方法參考之前文獻的方法［6］。簡言之，將牛主動脈放入3-［（3-膽酰胺基丙基）二甲氨基］-1-丙磺酸內(nèi)鹽［3-（3-Cholamidopropyl）dimethylammonium-1-propanesulfonate，CHAPS］和十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）脫細胞溶液中進行洗滌。最后用含10%胎牛血清的PBS 中漂洗。其中SDS 脫細胞時間設(shè)置為36 h 和24 h 兩組，將制備好的脫細胞血管放入PBS 緩沖液中4 ℃保存。

1.2 蘇木素-伊紅染色及DNA 定量

將脫細胞前后的血管用4%多聚甲醛固定2 d，石蠟包埋，切成5 μm 切片。切片用蘇木精-伊紅染料染色。同時進行DNA 定量，將脫細胞前后的牛主動脈（n=6）冷凍保存后，凍干稱重，再用木瓜蛋白酶溶液（125 μg/mL 木瓜蛋白酶，5 mmol/L 半胱氨酸及5 mmol/L 乙二胺四乙酸）常溫下消化過夜。消化后的溶液用TE 緩沖液（10 mmol/L Tris-HCl 及1 mmol/L 乙二胺四乙酸，pH7.5）稀釋，用等體積的QuantiTTM PicoGreen dsDNA 試劑孵育，在485 nm 激發(fā)波長和530 nm 發(fā)射波長下測定熒光值，根據(jù)標準品的濃度和對應(yīng)的熒光值畫出標準曲線方程，最后計算樣本濃度。

1.3 溶解性細胞外基質(zhì)的制備

脫細胞牛主動脈ECM 溶液的制備參考之前的方法［7］。簡單來說，將脫細胞ECM 凍干后研磨成粉末狀，然后用10 mg/mL 胃蛋白酶將粉末消化成溶液狀態(tài)，消化過程在37 ℃條件下進行。接著將可 溶性 的ECM 用1/10 體積0.1 mol/L 的NaOH 和1/9 體積的10×PBS 中和至pH 為7.4，放在4 ℃條件下備用。

1.4 巨噬細胞的極化

雄性2～3 個月齡的SD 大鼠通過頸椎脫臼實施安樂死。在無菌條件下，切除后肢皮膚，分離出脛骨和股骨。剪開骨的一端，并用巨噬細胞完全培養(yǎng)基沖洗骨髓腔并收集骨髓，該培養(yǎng)基包括DMEM、10%胎牛血清、100 U/mL的青霉素、100 μg/mL 的鏈霉素。無菌PBS洗滌骨髓細胞，并以106個/mL 的密度接種在六孔板上。將六孔板置于37 ℃、5%二氧化碳的培養(yǎng)箱在中，每48 h換液一次，培養(yǎng)7 d。7 d 后使用基礎(chǔ)培養(yǎng)基加刺激因素進行極化原始巨噬細胞：（1）20 ng/mL γ 干擾素（γ-IFN）和100 ng/mL的脂多糖（LPS）刺激形成M1型巨噬細胞；（2）20 ng/mL白細胞介素（interleukin，IL）-4刺激形成M2型巨噬細胞；（3）SDS脫細胞時間為24 h的血管基質(zhì)材料刺激形成M24hSDS表型；（4）SDS 脫細胞時間為36 h 的血管基質(zhì)材料刺激形成M36hSDS表型。在37 ℃、5%二氧化碳的培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h。

1.5 巨噬細胞表型及分泌細胞因子鑒定

刺激24 h 后，細胞使用TRIzol 試劑分離總RNA?？俁NA 使用PrimeScript?RT Master Mix 試劑盒（Taraka）逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。采用定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative polymerase chain reaction，qPCR）定量基因表達，最終反應(yīng)體積為10 μL，包括TB Green（Taraka）、10 μmol/L 正向和反向引物和4 ng cDNA（引物序列見表1），在qPCR 儀器上運行。使用GraphPad Prism8.3 對數(shù)據(jù)進行分析。以3-磷酸甘油醛脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）為內(nèi)參基因，計算相對表達量2-ΔΔCT。

表1 基因引物序列

1.6 統(tǒng)計學分析

使用GraphPad Prizm 8.3 統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行分析。所有的數(shù)據(jù)均以（）表示，以單因素方差分析進行檢驗。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 不同方法脫細胞后血管表征比較

對原生動脈以及兩種方法脫細胞的牛主動脈進行蘇木素-伊紅染色（圖1 A-C）。結(jié)果可見新鮮原生動脈結(jié)構(gòu)清晰，可見大量完整細胞核。牛主動脈24 h SDS 脫細胞后，蘇木素-伊紅染色未見明顯完整的細胞核，但可看到較多的殘存細胞碎片。牛主動脈36 h SDS 脫細胞后可見血管結(jié)構(gòu)完整，未見殘留核。Picogreen 法DNA 定量可見24 h SDS 脫細胞后DNA 濃度為（121.01±4.09）ng/mg，＞50 ng/mg干重（圖1D）。36 h SDS 脫細胞的牛主動脈DNA 濃度為（9.46±0.75）ng/mg，小于＜50 ng/mg干重（圖1D），符合脫細胞標準。

圖1 不同方法脫細胞后血管表征光學顯微鏡下圖像（標尺：50 μm；A：原生牛主動脈蘇木素-伊紅染色顯微鏡下圖像；B：SDS 脫細胞為24 h 的牛主動脈蘇木素-伊紅染色顯微鏡下圖像；C：SDS 脫細胞為36 h 的牛主動脈蘇木素-伊紅染色顯微鏡下圖像；D：Picogreen 法DNA 定量）

2.2 不同表型巨噬細胞表面標記基因表達比較

利用qPCR 法對不同刺激因素所得的巨噬細胞表面標志物進行分析。M1 表型iNOS 和CD80 的表達明顯增加，M2 表型CD206 和CD163 的表達升高。與24 h 脫細胞表型M24hSDS促炎性巨噬細胞表面標志物iNOS 和CD80 的表達量相比，SDS 脫細胞時間為36 h 的脫細胞血管基質(zhì)材料刺激獲得的巨噬細胞M36hSDS表達量要明顯減少，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；而對促重構(gòu)巨噬細胞的表面標記物CD206 和CD163，M36hSDS表型較M24hSDS表型表達明顯增加，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），詳見圖2。

圖2 不同表型巨噬細胞表面標記基因表達比較（A：M1 表型表面標記物iNOS 的表達；B：M1 表型表面標記物CD80 的表達；C：M2 表型表面標記物CD206 表達；D：M2 表型表面標記物CD163 表達）

2.3 不同表型巨噬細胞分泌的細胞因子基因表達比較

不同表型巨噬細胞分泌的細胞因子基因分析比較，見圖3。IL-1B 和腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）在M1 表型表達增加。M36hSDS表型與M24hSDS表型相比，IL-1β和TNF-α的表達明顯較少，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.005）。M36hSDS表型與M24hSDS表型相比，TNF-α 的表達明顯減少，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.005）。IL-10 在M1 表型表達較M2 表型增加。M36hSDS表型與M24hSDS表型相比，IL-10 的表達明顯減少，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.005）。

圖3 不同表型巨噬細胞分泌的細胞因子基因表達分析（A：細胞因子IL-1β 基因表達；B：細胞因子TNF-α 表達；C：細胞因子IL-10 的表達）

3 討論

自體血管來源的局限性以及取血管帶給患者二次創(chuàng)傷等問題，使得異種來源血管或者異種細胞構(gòu)建的組織工程血管成為必然趨勢，而美國Niklason團隊已經(jīng)使用來源于牛的平滑肌細胞成功構(gòu)建出組織工程血管并進入到Ⅲ期臨床試驗［8-9］。但是，由于這些材料中存在完整的異體或異種DNA 物質(zhì)，必須有效去除其抗原表位和細胞成分，才能降低植入后宿主的不良免疫反應(yīng)。目前脫細胞的方法各式各樣，如何選擇理想的方法進行恰當?shù)南疵摲浅Ｖ匾?，特別是對于血管組織這種移植之后馬上就要承受一定壓力血液沖刷的材料。

異種脫細胞基質(zhì)材料制備的多個過程，包括脫細胞的有效性及脫細胞后的修飾，均會影響植入體內(nèi)材料-宿主相互作用過程，進一步?jīng)Q定遠期重構(gòu)反應(yīng)和功能結(jié)果。之前有研究顯示CHAPS 聯(lián)合SDS 的脫細胞方案中經(jīng)過24 h SDS 脫細胞處理，可以去除人臍動脈及大鼠主動脈細胞及殘留細胞碎片，使得DNA 濃度低于50 ng/mg，達到公認的脫細胞純度［10-11］。但是正如本研究所發(fā)現(xiàn)，24 h SDS脫細胞后牛主動脈仍然有殘留細胞核及細胞碎片，并不能達到像其他動脈同樣的脫細胞純度，將SDS 脫細胞時間延長至36 h 才可使得DNA 濃度低于50 ng/mg。這也說明了盡管脫細胞的原則是簡單的，但具體操作過程比較復(fù)雜，必須考慮到種屬來源、組織來源等因素［3］。

既往研究一般是選擇免疫熒光的方法測定組織殘余DNA 濃度，但是如何進一步評價材料未來移植進入體內(nèi)可能引起的免疫反應(yīng)，一直沒有很好的方法。近年來隨著對巨噬細胞相關(guān)表型研究的深入，發(fā)現(xiàn)巨噬細胞存在M1 和M2 兩種不同表型，它可以隨著環(huán)境變化在這兩種表型之間轉(zhuǎn)化，即巨噬細胞極化現(xiàn)象。M1 型巨噬細胞與急性炎癥相關(guān)，而M2 型巨噬細胞與組織再生相關(guān)。之前Badylak［12］團隊所開展的研究結(jié)果顯示，充分去細胞化的小腸黏膜將促進巨噬細胞表型從M1 向M2的轉(zhuǎn)化有關(guān)。而在靈長類動物模型研究中發(fā)現(xiàn)，支架內(nèi)細胞的存在及促炎細胞因子數(shù)量的增加可以帶來巨噬細胞M1 表型的增加，與不良重構(gòu)結(jié)果有關(guān)。植入含有細胞成分的異種ECM 支架會導(dǎo)致單核細胞浸潤的經(jīng)典炎癥過程級聯(lián)，包括植入后3 d 主要為M1 表型的巨噬細胞［13］。因此，通過體外巨噬細胞極化結(jié)果，將可以提前預(yù)知材料移植后的中遠期效果。

巨噬細胞分泌的細胞因子是其發(fā)揮生物功能的關(guān)鍵成分。本研究結(jié)果顯示異種血管組織經(jīng)過36 h 洗脫后，誘導(dǎo)的M36hSDS表型對促炎型細胞因子IL-1β、TNF-α 的表達量要明顯減少。IL-10 是抗炎型細胞因子，既往認為在人和小鼠體內(nèi)是由M2型巨噬細胞分泌，而本研究中在M1 型巨噬細胞及M24hSDS表型表達增加，與之前大鼠巨噬細胞極化的研究結(jié)果一致［14］。

本研究的結(jié)果表明，生物支架材料的脫細胞化效果是巨噬細胞表型反應(yīng)的一個重要因素。除了測定殘存DNA 之外，體外誘導(dǎo)巨噬細胞極化的方法是對異種或異體組織脫細胞處理效果的客觀評價手段之一。