黃瓊，黃曉梅，何燕萍

（福建農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，福建 福州 350119）

鐵皮石斛（Dendrobium officinale）為蘭科石斛屬草本植物[1-2]。鐵皮石斛葉含有多糖、多酚、石斛堿、黃酮、萜類等生物活性物質(zhì)，具有抗氧化[3]、抗炎鎮(zhèn)痛、調(diào)節(jié)免疫力等多種功效[4]。《中國藥典》規(guī)定鐵皮石斛以莖入藥，導(dǎo)致較多的葉子常被丟棄，造成鐵皮石斛資源的嚴(yán)重浪費(fèi)。因此，對鐵皮石斛葉活性成分進(jìn)行提取及利用可以提高鐵皮石斛資源利用率。

目前國內(nèi)外對鐵皮石斛的研究多集中在鐵皮石斛多糖、總黃酮提取及利用[5-9]，而鐵皮石斛多酚的相關(guān)研究鮮見報(bào)道，張珍林等[10]研究了鐵皮石斛干花多酚的提取工藝，但關(guān)于鐵皮石斛葉多酚的研究鮮見。植物多酚因具有抗氧化、抗病毒等功效而引起人們廣泛關(guān)注[11]。植物多酚提取方法有溶劑浸提[12]、超聲波輔助提取[13]、超聲-微波協(xié)同提取[14]、超臨界CO2萃取[15]等。超聲輔助提取具有無溶劑殘留、提取能力強(qiáng)、易操作、能耗低等優(yōu)點(diǎn)，目前被廣泛應(yīng)用于天然產(chǎn)物的提取。本試驗(yàn)對鐵皮石斛葉多酚超聲輔助提取的最優(yōu)工藝條件和鐵皮石斛葉多酚清除自由基活性進(jìn)行研究，旨在擴(kuò)大鐵皮石斛產(chǎn)品附加值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鐵皮石斛葉：福建南靖鐵皮石斛人工大棚種植基地；沒食子酸（純度≥98%）：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；福林酚試劑（分析純）：阿拉丁試劑（上海）有限公司；抗壞血酸（純度≥99%）：南京建成生物工程研究所；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼 （1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）（純度為 96%）：上海銘博生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

KQ5200DE超聲清洗儀：昆山市超聲儀器有限公司；UV-1800-DS2紫外可見分光光度計(jì)：上海美譜達(dá)儀器有限公司；LGR10-4.2高速冷凍離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：上海亞榮生化儀器設(shè)備公司；FD-2C-80真空冷凍干燥機(jī)：上海繼譜電子科技有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 鐵皮石斛葉多酚提取工藝流程

鐵皮石斛葉→60℃烘干→粉碎過篩→樣品粉末→超聲輔助提取→離心→取上清液→濃縮→干燥→多酚樣品。

1.3.2 鐵皮石斛葉多酚提取量計(jì)算

鐵皮石斛葉多酚含量測定采用福林酚法[16]，鐵皮石斛葉多酚提取量計(jì)算參考文獻(xiàn)[17]。

1.3.3 單因素試驗(yàn)

1.3.3.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對鐵皮石斛葉多酚提取量的影響

固定超聲功率為200 W，提取溫度為40℃，提取時(shí)間為 20 min，液料比為 10∶1（mL/g），提取 1 次，考察乙醇體積分?jǐn)?shù)（0%、15%、30%、45%、60%、75%）對鐵皮石斛葉多酚提取量的影響。

1.3.3.2 超聲功率對鐵皮石斛葉多酚提取量的影響

固定乙醇體積分?jǐn)?shù)為45%，提取溫度為40℃，提取時(shí)間為 20 min，液料比為 10∶1（mL/g），提取 1 次。考察超聲功率（200、250、300、350、400、450 W）對鐵皮石斛葉多酚提取量的影響。

1.3.3.3 提取時(shí)間對鐵皮石斛葉多酚提取量的影響

固定乙醇體積分?jǐn)?shù)為45%，超聲功率為350 W，提取溫度為40℃，液料比為10∶1（mL/g），提取1次?？疾焯崛r(shí)間（20、25、30、35、40、45 min）對鐵皮石斛葉多酚提取量的影響。

1.3.3.4 液料比對鐵皮石斛葉多酚提取量的影響

固定乙醇體積分?jǐn)?shù)為45%，超聲功率為350 W，提取溫度為40℃，提取時(shí)間為30 min，提取1次。考察液料比[10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1（mL/g）]對鐵皮石斛葉多酚提取量的影響。

1.3.3.5 提取溫度對鐵皮石斛葉多酚提取量的影響

固定乙醇體積分?jǐn)?shù)為45%，超聲功率為350 W，提取時(shí)間為 35 min，液料比為 40∶1（mL/g），提取 1 次?？疾焯崛囟龋?0、50、60、70、80、90 ℃）對鐵皮石斛葉多酚提取量的影響。

1.3.4 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

以鐵皮石斛葉多酚提取量作為試驗(yàn)設(shè)計(jì)的響應(yīng)值，由單因素顯著性分析得到對響應(yīng)值影響較大的4個(gè)因素，采用四因素三水平的試驗(yàn)設(shè)計(jì)確定最優(yōu)鐵皮石斛葉多酚提取工藝條件。試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平Table 1 Factors and levels of response surface experiment

1.3.5 鐵皮石斛葉多酚清除自由基試驗(yàn)

以VC為對照，參考文獻(xiàn)[18]測定鐵皮石斛葉多酚對羥自由基的清除作用，參考文獻(xiàn)[19]測定鐵皮石斛葉多酚對超氧陰離子自由基的清除作用，參考文獻(xiàn)[20]測定鐵皮石斛葉多酚對DPPH自由基的清除作用。

1.4 數(shù)據(jù)分析

利用SPSS 21.0對單因素試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行顯著性分析，利用Design Expert 8.0.6軟件進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)。試驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對鐵皮石斛葉多酚提取量的影響

乙醇體積分?jǐn)?shù)對鐵皮石斛葉多酚提取量的影響見圖1。

圖1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對鐵皮石斛葉多酚提取量的影響Fig.1 Effects of ethanol volume fraction on extaction amount of polyphenols from Dendrobium officinale leaves

由圖1可得，多酚提取量隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)增大呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為45%時(shí)，多酚提取量最大。原因是乙醇有利于含有羥基的多酚溶解析出，但是乙醇體積分?jǐn)?shù)太大，多酚受醇溶性雜質(zhì)影響，抑制溶出。因此，乙醇體積分?jǐn)?shù)以45%為宜。

2.1.2 超聲功率對鐵皮石斛葉多酚提取量的影響

超聲功率對鐵皮石斛葉多酚提取量的影響見圖2。

圖2 超聲功率對鐵皮石斛葉多酚提取量的影響Fig.2 Effects of ultrasonic power on extaction amount of polyphenols from Dendrobium officinale leaves

由圖2可得，多酚提取量隨著超聲功率增大先增大后減少，超聲功率為350 W時(shí)，多酚提取量最大。原因是超聲功率增加，萃取溫度升高，細(xì)胞組織被分解得更徹底，增大多酚提取量；但超聲功率過高，導(dǎo)致萃取溫度過高，多酚被氧化分解，降低多酚提取量。因此，超聲功率以350 W為宜。

2.1.3 提取時(shí)間對鐵皮石斛葉多酚提取量的影響

提取時(shí)間對鐵皮石斛葉多酚提取量的影響見圖3。

圖3 提取時(shí)間對鐵皮石斛葉多酚提取量的影響Fig.3 Effects of extraction time on extaction amount of polyphenols from Dendrobium officinale leaves

由圖3可得，多酚提取量隨著提取時(shí)間延長先增大后減小，提取時(shí)間為35 min時(shí)，多酚提取量最大。原因是延長提取時(shí)間，鐵皮石斛葉與溶劑接觸時(shí)間越長，多酚越能充分地從鐵皮石斛葉擴(kuò)散到溶液中，但是提取時(shí)間過長，多酚易被氧化破壞，導(dǎo)致多酚提取量下降。因此，提取時(shí)間以35 min為宜。

2.1.4 液料比對鐵皮石斛葉多酚提取量的影響

液料比對鐵皮石斛葉多酚提取量的影響見圖4。

圖4 液料比對鐵皮石斛葉多酚提取量的影響Fig.4 Effects of liquid-solid ratio on extaction amount of polyphenols from Dendrobium officinale leaves

由圖4可得，多酚提取量隨著液料比增大先增大后減小，液料比為40∶1（mL/g）時(shí)，多酚提取量最大。原因是提取溶劑體積越大，接觸面積也越大，多酚提取量越高，但是提取溶劑體積過大，多糖、蛋白質(zhì)等雜質(zhì)溶解析出，多酚提取量降低，也不利于后續(xù)多酚的提純。因此，液料比以 40∶1（mL/g）為宜。

2.1.5 提取溫度對鐵皮石斛葉多酚提取量的影響

提取溫度對鐵皮石斛葉多酚提取量的影響見圖5。

圖5 提取溫度對鐵皮石斛葉多酚提取量的影響Fig.5 Effects of extraction temperature on extaction amount of polyphenols from Dendrobium officinale leaves

由圖5可得，多酚提取量隨著提取溫度升高先增大后減少，提取溫度為60℃時(shí)，多酚提取量最大。原因是提取溫度越高，有機(jī)溶劑擴(kuò)散和傳播得越快，越有利于多酚提取，但溫度太高，易造成多酚分解。因此，提取溫度以60℃為宜。

2.2 各單因素與鐵皮石斛葉多酚提取量的方差分析

對5個(gè)單因素進(jìn)行方差分析，結(jié)果如表2所示。

表2 單因素試驗(yàn)方差分析結(jié)果Table 2 Variance analysis on single-factor experiment

由表2可知，乙醇體積分?jǐn)?shù)、超聲功率和液料比對多酚提取量均有極顯著影響（P＜0.01），提取時(shí)間對多酚提取量影響顯著（0.01＜P＜0.05），提取溫度對多酚提取量影響不顯著（P＞0.05）。因此，選擇影響多酚提取量的關(guān)鍵因素（乙醇體積分?jǐn)?shù)、超聲功率、提取時(shí)間和液料比）進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)。

2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)

2.3.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及方差分析見表3～表4。

表3 Box-Behnken設(shè)計(jì)方案及試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Box-Behnken design and results

續(xù)表3 Box-Behnken設(shè)計(jì)方案及試驗(yàn)結(jié)果Continue table 3 Box-Behnken design and results

表4 回歸方程的方差分析Table 4 Analysis of variance of the regression equation

對表3數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多項(xiàng)式回歸模型方程擬合，得到鐵皮石斛葉多酚提取量（Y）對乙醇體積分?jǐn)?shù)（A）、超聲功率（B）、提取時(shí)間（C）、液料比（D）的回歸方程：Y=32.60+0.72A+0.22B+0.34C-0.20D-0.087AB-0.35AC+0.28AD+0.083BC-0.14BD-0.022CD-0.47A2-0.076B2-0.30C2-0.32D2。（R2=0.982 6），說明實(shí)測值與預(yù)測值之間有很高的相關(guān)性。由表4可知，模型中的失擬項(xiàng)（P＞0.05）表明此模型擬合度良好。A、B、C、D、AC、AD、BD、A2、C2和 D2對多酚提取量的影響極顯著（P＜0.01），B2對多酚提取量的影響顯著（P＜0.05）。影響多酚提取量主次順序：乙醇體積分?jǐn)?shù)（A）>超聲功率（C）>液料比（B）>提取時(shí)間（D）。

2.3.2 響應(yīng)面分析因素間的相互作用

各因素交互作用對鐵皮石斛葉多酚提取量影響結(jié)果見圖6。

圖6 不同因素對鐵皮石斛葉多酚提取量影響的響應(yīng)面圖Fig.6 Response surface map of the effect of different factors on the extraction of polyphenols from Dendrobium officinale leaves

由圖6可得，各響應(yīng)面均具有最高點(diǎn)，表明在所選的范圍內(nèi)多酚提取量均具有最大值。響應(yīng)曲面越陡峭，表明該因素對多酚提取量的影響越顯著。由圖6響應(yīng)曲面得，4個(gè)因素對多酚提取量的影響均顯著，這與表5方差分析的結(jié)果一致。

2.3.3 響應(yīng)面試驗(yàn)?zāi)Ｐ偷尿?yàn)證

根據(jù)模型獲得4個(gè)變量的最優(yōu)值，乙醇體積分?jǐn)?shù)50.55%，超聲功率350 W，提取時(shí)間37.47 min，液料比36.02∶1（mL/g），在最優(yōu)提取工藝條件下，鐵皮石斛葉多酚提取量理論值為33.03 mg/g。為了進(jìn)一步檢驗(yàn)試驗(yàn)方法的可靠性，考慮實(shí)際操作簡便，調(diào)整最優(yōu)提取工藝條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)50%，超聲功率350 W，提取時(shí)間 37 min，液料比 36∶1（mL/g）。結(jié)果表明試驗(yàn)值（32.87 mg/g）與理論預(yù)測值（33.03 mg/g）相對誤差為0.48%，差異不顯著（P>0.05）。因此，利用響應(yīng)面優(yōu)化鐵皮石斛葉多酚提取工藝條件結(jié)果可信。

2.4 提取次數(shù)對鐵皮石斛葉多酚提取量的影響

按鐵皮石斛葉多酚最優(yōu)提取工藝條件即乙醇體積分?jǐn)?shù)50%，超聲功率350 W，提取時(shí)間37 min，液料比 36∶1（mL/g），提取溫度 60℃，分別提取 1、2、3次，結(jié)果見圖7。

圖7 提取次數(shù)對鐵皮石斛葉多酚提取量的影響Fig.7 Effects of extraction times on extaction amount of polyphenols from Dendrobium officinale leaves

由圖7可知，提取2次，鐵皮石斛葉多酚提取量最大，說明提取2次已基本提取完全，若增加提取次數(shù)不但多酚提取量降低，還會導(dǎo)致其他成分溶出，不利后續(xù)提純。因此，提取以2次為宜，鐵皮石斛葉多酚提取量為34.15 mg/g。

2.5 鐵皮石斛葉多酚清除自由基能力

2.5.1 鐵皮石斛葉多酚對羥自由基的清除能力

鐵皮石斛葉多酚對羥自由基的清除能力結(jié)果見圖8。

圖8 不同濃度鐵皮石斛葉多酚和VC對羥自由基的清除率的影響Fig.8 Effects of different concentrations of Dendrobium officinale leaf polyphenols and VCon the scavenging rate of hydroxyl radicals

由圖8可知，鐵皮石斛葉多酚和VC對羥自由基清除率均隨著質(zhì)量濃度增大而升高。鐵皮石斛葉多酚和VC對羥自由基清除率IC50值分別為 0.554 mg/mL和0.325 mg/mL，說明鐵皮石斛葉多酚清除羥自由基能力弱于VC。

2.5.2 鐵皮石斛葉多酚對超氧陰離子自由基的清除能力

鐵皮石斛葉多酚對超氧陰離子自由基的清除能力結(jié)果見圖9。

圖9 不同濃度鐵皮石斛葉多酚和VC對超氧陰離子自由基的清除率的影響Fig.9 Effects of different concentrations of Dendrobium officinale leaf polyphenols and VCon the scavenging rate of superoxide anion free radicals

由圖9可知，鐵皮石斛葉多酚和VC對超氧陰離子自由基清除率均隨著質(zhì)量濃度的增大而升高。鐵皮石斛葉多酚和VC對超氧陰離子自由基清除率IC50值分別為0.775 mg/mL和0.364 mg/mL，說明鐵皮石斛葉多酚清除超氧陰離子自由基能力弱于VC。

2.5.3 鐵皮石斛葉多酚對DPPH自由基的清除能力

鐵皮石斛葉多酚對DPPH自由基的清除能力結(jié)果見圖10。

圖10 不同濃度鐵皮石斛葉多酚和VC對DPPH自由基的清除率的影響Fig.10 Effects of different concentrations of Dendrobium officinale leaf polyphenols and VCon the scavenging rate of DPPH free radicals

由圖10可知，鐵皮石斛葉多酚和VC對DPPH自由基清除率均隨著質(zhì)量濃度的增大而升高。鐵皮石斛葉多酚和VC對DPPH自由基清除率 IC50分別為0.596 mg/mL和0.358 mg/mL，說明鐵皮石斛葉多酚清除DPPH自由基能力弱于VC。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)以鐵皮石斛葉為原料，通過單因素和響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化，得到各因素對鐵皮石斛葉多酚提取量影響主次順序：乙醇體積分?jǐn)?shù)＞超聲功率＞料液比＞提取時(shí)間。超聲輔助提取鐵皮石斛葉多酚的最優(yōu)工藝條件：乙醇體積分?jǐn)?shù)50%，超聲功率350 W，提取時(shí)間37 min，液料比 36∶1（mL/g），提取溫度 60 ℃，提取 2 次，在此條件下，鐵皮石斛葉多酚提取量為34.15 mg/g，說明利用超聲輔助提取鐵皮石斛葉多酚具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。以同濃度梯度的VC作對照，清除自由基試驗(yàn)結(jié)果表明，鐵皮石斛葉多酚能夠有效清除羥自由基、超氧陰離子自由基及DPPH自由基，且清除能力隨著多酚質(zhì)量濃度增加而增強(qiáng)，表明鐵皮石斛葉多酚具有較強(qiáng)的抗氧化活性，根據(jù)IC50值的比較可知鐵皮石斛葉多酚的清除自由基效果均弱于同濃度梯度的VC。