齊科研，楊 鍇，閆有圣，王一鵬，陰赪宏

據(jù)第二次殘疾人抽樣調查顯示，我國聽力殘疾者數(shù)量達2780萬。其中50%以上病例是由遺傳學因素所導致的，不合并其他表型的非綜合征性耳聾(non-syndromic hearing impairment，NSHI)占70%。我國通過近20年大規(guī)模的先天性耳聾分子流行病學調查，逐步建立“孕前-產(chǎn)前-出生后”三級防控體系，為減少聾兒出生或早期干預提供依據(jù)。多種分子遺傳學檢測技術的應用，也極大提高了先天性耳聾患者的檢出率。GJB2基因(間隙連接蛋白2，MIM編號*121011，又名Connecxin 26，CX26)編碼間隙連接復合物的一個重要亞基，幫助相鄰細胞間形成液體孔隙通道，實現(xiàn)細胞間的物質流通。GJB2基因突變是引起非綜合征遺傳性耳聾最常見的原因，我國有21%中重度以上NSHI患者攜帶有GJB2基因突變。然而，由于GJB2突變所引發(fā)疾病的異質性和表型可變程度很強，需多科室綜合分析，以提供準確的咨詢意見及再生育指導意見。

本研究納入了4例先天性耳聾家系，對其進行全面臨床表現(xiàn)、家族病史評估，并利用耳聾基因芯片、全外顯子組測序技術進行遺傳學檢測，Sanger測序對特定位點驗證，從而明確其發(fā)病原因。并且對新檢出的3個錯義突變所影響的氨基酸進行了進化保守性分析，4個病例均與GJB2基因相關，但卻存在著不同的情況。

1 對象與方法

1.1 對象 本研究納入2020-05至2022-01于我院產(chǎn)前診斷中心遺傳咨詢門診就診的4例先天性耳聾家系。由患者家屬配合完成臨床信息采集，包括患者基本信息、耳聾病史、出生史、家族史、個人相關病史(外傷、耳毒性藥物使用史、感染史)等。全部納入?yún)⑴c者均簽署書面知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 試劑與儀器 TIANamp Genomic DNA Kit離心柱式血液gDNA提取試劑盒(天根，北京)，十五項遺傳性耳聾基因檢測試劑盒(博奧晶芯，成都)，xGenExome Research Panel外顯子捕獲試劑盒(IDT，美國)；NovaSeq 6000二代測序平臺(Illumina，美國)，晶芯EasyArray3A集成化芯片工作站(博奧晶芯，成都)，晶芯LuxScanDx24微陣列芯片掃描儀(博奧晶芯，成都)，ABI 3730基因分析儀(Thermo Fisher，美國)，Bioanalyzer 2100(Agilent，美國)，ND 2000紫外分光光度計(Thermo Fisher，美國)。

1.2.2 樣本采集和DNA提取 根據(jù)所采集家系背景資料，以先證者為核心，使用Cyrillic軟件繪制系譜圖。采集每位參與成員3 ml EDTA抗凝血，提取總DNA。取2 μl利用紫外分光光度計檢測DNA濃度及純度。

1.2.3 耳聾基因芯片 采用十五項遺傳性耳聾基因突變微陣列診斷芯片對納入的6名家系成員(包括患者1、患者2及其配偶、患者3及其配偶、患者4)進行初篩。該芯片包含了GJB2基因的4個熱點突變，即35delG、176del16、235delC、299delAT；SLC26A4基因的8個熱點突變，即IVS7-2A>G、2168A>G、1229C>T、1975G>C、1174A>T、1226G>A、2027T>A和IVS15+5G>A；線粒體DNA(mtDNA)的2個熱點突變，即1555G>A、1494C>T；以及GJB3基因的538C>T突變。實驗過程中的PCR擴增、磁珠捕獲分離、磁珠雜交和結果檢測的各部分操作均依據(jù)廠家提供的標準操作流程進行。

1.2.4 全外顯子組測序 對經(jīng)過1.2.2初篩實驗仍無法明確診斷的病例，進行全外顯子組測序分析。用xGenExome Research Panel進行外顯子區(qū)序列雜交捕獲，定量熒光PCR的方法測試文庫富集情況、大小分布及濃度。NovaSeq 6000平臺完成測序；Picard v軟件(1.57)去除PCR重復，軟件(Burrows-Wheeler Aligner)將原始數(shù)據(jù)比對人類基因組參考序列(GRCh38版本)。Verita TrekkerVariants Detection systemv2.0(貝瑞基因，中國)和Genome Analysis Toolkit軟件進行變異calling；再利用ANNOVAR(v 2.0)和EnlivenVariants Annotation Interpretation系統(tǒng)(貝瑞基因，中國)根據(jù)美國醫(yī)學遺傳學與基因組學協(xié)會(American College of Medical Genetics and Genomics，ACMG)發(fā)布的通用指南進行變異注釋解讀。

1.2.5 Sanger測序驗證 針對各疑似致病的位點利用Primer 5在線軟件(網(wǎng)址：http://frodo.wi.mit.edu/primer3)進行引物設計。PCR方法擴增，利用Qiagen純化試劑盒對產(chǎn)物進行純化；進行上機測序，系統(tǒng)軟件進行結果分析。

1.2.6 錯義變異分析 依據(jù)先前方法，使用MEGA7在線軟件對新檢測出的錯義變異所影響的氨基酸在各物種間的進化保守性進行分析，全部參數(shù)為默認值。同時，利用Revel在線軟件對新錯義變異的危害性加以評分。

2 結 果

2.1 臨床檢查 患者1，女，5歲，診斷感音神經(jīng)性耳聾(雙耳)、白甲病、掌跖角化??；其他各項體征均正常，常規(guī)實驗室血液檢測(血常規(guī)、血生化等)未見異常。其父母表型正常，否認家族內有耳聾等遺傳性疾病患病史，否認患兒致聾性外傷、耳毒性藥物使用史、感染史。本例家系圖如圖1A所示。患者2，女，35歲，出生即診斷先天感音神經(jīng)性耳聾，其他體征無異常；其妹妹同患先天性耳聾；其丈夫，34歲，出生時聽力正常，2歲左右開始聽力逐漸下降，直至5歲左右耳聾?；颊?，男，2歲，診斷為先天性耳聾、全面發(fā)育落后，常規(guī)實驗室血液檢測未見異常。其父母表型均正常。其母親就診時孕第二胎7周，要求明確患兒遺傳學診斷，并對第二胎進行產(chǎn)前診斷。本例的家系圖如圖1E所示?；颊?，男，33歲，聽力下降十余年，因備孕來我中心咨詢，要求行遺傳學診斷。

2.2 遺傳學檢測結果 由于耳聾基因芯片的篩查效率有限，不能滿足充分明確遺傳診斷目的，故利用WES檢測，結果均以Sanger測序進行驗證。結果顯示，4個先天性耳聾病例均與GJB2基因突變相關，然而其具體情況卻存在各異性。4個病例的家系圖及遺傳檢測結果見圖1；其中，A-B為病例1情況，C-D為病例2，E-F為病例3，G-H為病例4。在病例1中，第II代男性個體為患者(圖1A)，攜帶GJB2: c.167T>C雜合突變(圖1B)，家系驗證證明其為新發(fā)突變。病例2中，患者2攜帶MYO7A: c.1214G>A(圖1C，左側)和MYO7A: c.3545A>G(圖1C，右側)的復合雜合突變，這兩個突變均為錯義突變，且是未報道過的新突變；而患者2的丈夫攜帶GJB2: c.299delAT(圖1D，左側)和GJB2: c.235delC(圖1D，右側)的復合雜合突變，與患者2為不同基因導致的遺傳性耳聾。病例3中，患者3(圖1E)存在GJB2: c.257C>G(p.Thr86Arg)(圖1F，左側)和GJB: c.235delC(圖1F，右側)的復合雜合突變；進一步的羊水產(chǎn)前診斷驗證發(fā)現(xiàn)患者3的同胞胎兒攜帶c.257C>G突變，而在c.235delC為野生型，僅為雜合子攜帶者，不會發(fā)病。在病例4中，患者4存在GJB: c.109G>A (p.Val37Ile)(圖1G)和GJB: c.235delC(圖1H)的復合雜合突變，這是導致其后天聽力下降的原因。

遺傳學檢測結果細節(jié)見表1。如表所示，本研究檢出3個與遺傳性耳聾相關的新突變體，分別為GJB2: c.167T>C，MYO7A: c.1214G>A和MYO7A: c.3545A>G，擴展了該疾病的突變譜。

2.3 錯義變異分析結果 本研究檢出3個新的錯義變異，分別是GJB: c.167T>C(p.Leu56Pro)、MYO7A: c.1214G>A(p.Arg405Gln)及MYO7A: c.3545A>G(p.Asn1182Ser)。經(jīng)MEGA軟件分析，這3個變異體所影響的氨基酸在各物種間保持著高度的進化保守性(圖2)。Revel評分預測這3個新的錯義變異均對蛋白有害(表1)。

3 討 論

遺傳性耳聾在新生兒中的發(fā)病率約為1/1000，該類疾病具有很強的遺傳異質性，可涉及上百種基因；其中，非綜合征性遺傳性耳聾約占70%，另外30%為綜合征性耳聾，GJB2的基因突變占據(jù)非綜合征感音神經(jīng)性耳聾常染色體隱性致病原因的近50%；同時，GJB2突變還可以常染色體顯性形式致病，或造成合并有耳聾表型的綜合征性疾病。最初，Kelsell等報道了GJB2基因可導致遺傳性耳聾。大量的研究揭示了在不同的種族中，該基因存在不同的熱點突變分布情況，東亞人群中235delC最常見，歐洲和中東地區(qū)35delG最多，W24X在印度人群中最多。從基因型-表型關聯(lián)角度講，一般的，截短性突變(無義、移碼突變等)會導致更嚴重的表型，而氨基酸替代(錯義突變等)癥狀較輕。由于GJB2基因有大量頻率較高的突變存在，各個突變相互組合后可能產(chǎn)生的預后情況又不盡相同，因此臨床中需格外注意。

在本研究中的4例入組家系，經(jīng)臨床評估和遺傳檢測分析后，證明其均存在GJB2的突變，但均有差異。家系1的患兒臨床除了耳聾表型還有白甲病、掌跖角化癥，遺傳檢測發(fā)現(xiàn)新發(fā)錯義突變GJB: c.167T>C(p.Leu56Pro)，符合常染色體顯性模式。綜合判斷，該患兒特征較符合Bart-Pumphrey綜合征(MIM #148350)。另外，已經(jīng)有過在此突變臨近位置的錯義突變導致Bart-Pumphrey綜合征的報道，佐證了上述判斷。一般情況下，該患兒的父母再次生育受累個體的概率較低，但不能完全排除父母存在生殖腺細胞嵌合的情況。家系2中，夫妻雙方雖然均為先天聾人，但兩人屬于在不同的基因上存在復合雜合突變，孕育先天耳聾患兒的機會非常低，不建議依據(jù)雙方所攜帶的突變去進行產(chǎn)前診斷，而是采取常規(guī)產(chǎn)檢即可?；颊?攜帶MYO7A基因的兩個新突變，且其致病性受到生物信息學分析結果的支持，這個發(fā)現(xiàn)擴充了該基因的突變譜。家系3為典型的GJB2復合雜合突變導致常染色體隱性先天性耳聾的情況，對胎兒羊水細胞進行GJB2基因測序驗證，結果顯示其帶有c.257C>G雜合突變，應當為無癥狀攜帶者，建議繼續(xù)妊娠。家系4屬于GJB2復合雜合突變導致常染色體隱性遲發(fā)性耳聾，這在一定程度上反映了GJB2: c.109G>A突變在臨床咨詢中的挑戰(zhàn)。由于該突變存在人群頻率高、表型異質性強的問題，常與遲發(fā)性耳聾相關。因此，在臨床咨詢中，應當就此為患者進行詳細解釋，對再次妊娠說明情況，尊重夫妻雙方的選擇。

本研究對4例先天性耳聾相關病例進行了詳細的遺傳診斷及咨詢，明確了其不同的發(fā)病原因。同時，檢出了一個GJB2基因新突變，兩個MYO7A基因新突變，擴充了遺傳性耳聾的突變譜，為后續(xù)研究和臨床診療實踐奠定了基礎。本研究樣本量較小，無法充分反映GJB2基因相關耳聾的臨床表型多樣性之全貌，專科醫(yī)院在監(jiān)控先天性耳聾病例的診療全過程無法覆蓋患者初診、產(chǎn)前篩查及診斷、治療及妊娠處置的全過程，會造成部分信息丟失。筆者將繼續(xù)關注該疾病，進一步開展研究工作。