李振興, 趙金龍

(中國(guó)海洋大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院, 山東 青島 266003)

甲殼類水產(chǎn)品,主要包括蝦、龍蝦和螃蟹,在人類營(yíng)養(yǎng)中起著至關(guān)重要的作用,含有多種優(yōu)質(zhì)蛋白和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),也是多不飽和脂肪酸和維生素的豐富來(lái)源[1-2]。 據(jù)聯(lián)合國(guó)糧食及農(nóng)業(yè)組織(Food and Agriculture Organization of the United Nations, FAO)于2020年發(fā)布的《世界漁業(yè)和水產(chǎn)養(yǎng)殖報(bào)告》數(shù)據(jù),2018年全球每年直接消費(fèi)甲殼類水產(chǎn)品超過(guò)93.87萬(wàn)t,其中南美白對(duì)蝦(Litopenaeus vannamei)消費(fèi)量占比高達(dá)52.9%。 甲殼類水產(chǎn)品除直接烹食外,還可用做加工原料,制成如調(diào)味品、休閑食品等甲殼類加工食品。 甲殼類水產(chǎn)品、甲殼類加工食品等甲殼類食品是FAO 認(rèn)定的8 大類主要致敏食品之一。微量的甲殼類食品成分就可以誘發(fā)嚴(yán)重的過(guò)敏反應(yīng),不僅阻礙了甲殼類食品過(guò)敏患者對(duì)味道鮮美、營(yíng)養(yǎng)豐富的甲殼類食品的攝入,而且對(duì)潛在過(guò)敏人群存在嚴(yán)重的安全隱患,已經(jīng)成為一個(gè)嚴(yán)重的全球公共衛(wèi)生問(wèn)題[2-3]。

甲殼類食品過(guò)敏問(wèn)題一直備受關(guān)注。 隨著甲殼類食品消費(fèi)的增加,其致敏率也越來(lái)越高,目前全世界高達(dá)2.5% 的人群遭受甲殼類食品過(guò)敏的痛苦[2]。 甲殼類食品過(guò)敏主要為IgE 介導(dǎo)的I 型超敏反應(yīng),是在外源甲殼類食品過(guò)敏物質(zhì)的激發(fā)下,產(chǎn)生足夠量的IgE 抗體,并與肥大細(xì)胞或嗜堿粒細(xì)胞上的高親和力受體結(jié)合,進(jìn)一步誘導(dǎo)肥大細(xì)胞或嗜堿性粒細(xì)胞脫釋放致敏介質(zhì),而引發(fā)機(jī)體產(chǎn)生一系列生理功能紊亂[4-5]。 與牛奶和雞蛋等其他食物過(guò)敏不同,甲殼類食品過(guò)敏主要流行于成年人群中,并可能伴隨一生。 甲殼類食品過(guò)敏可誘發(fā)過(guò)敏患者出現(xiàn)皮膚紅腫、瘙癢、皮疹、蕁麻疹和血管性水腫等皮膚癥狀,以及惡心、嘔吐、 腹痛和痙攣等胃腸道反應(yīng)[3]。

由于食物致敏機(jī)理的復(fù)雜性,目前在臨床上尚沒(méi)有安全有效根治食物過(guò)敏的手段,嚴(yán)格規(guī)避含有甲殼類食品致敏成分是當(dāng)前最有效的防治措施。 為了全面保障甲殼類食品的食用安全,除了必要的標(biāo)簽標(biāo)示管理之外,國(guó)內(nèi)外研究者針對(duì)甲殼類食品的過(guò)敏原及其消減技術(shù)展開了一系列的研究,致力于開發(fā)低致敏性或脫敏甲殼類食品,保障甲殼類食品過(guò)敏人群的安全。 本文闡述了目前國(guó)內(nèi)外有關(guān)甲殼類食品主要過(guò)敏原及其致敏性消減技術(shù)的研究現(xiàn)狀,以期為甲殼類食品過(guò)敏的預(yù)防與控制提供理論指導(dǎo)。

1 甲殼類水產(chǎn)品過(guò)敏原

大部分甲殼類水產(chǎn)品過(guò)敏原主要存在于可食用肌肉部分,它們的生理功能是參與肌肉運(yùn)動(dòng)和能量代謝。 隨著蛋白質(zhì)鑒定和過(guò)敏原定性技術(shù)的發(fā)展,一些甲殼類水產(chǎn)品的過(guò)敏原已經(jīng)被陸續(xù)鑒定。 目前,國(guó)內(nèi)外學(xué)者已從甲殼類水產(chǎn)品中鑒定出10 余種過(guò)敏原組分,其中主要過(guò)敏原蛋白為原肌球蛋白(tropomyosin,TM),其次是精氨酸激酶(arginine,AK)、肌質(zhì)鈣結(jié)合蛋白(sarcoplasmic calcium-binding protein,SCP)、肌球蛋白輕鏈(myosin light chain,MLC)、磷酸丙糖異構(gòu)酶蛋白(triosephosphate isomerase,TPI)、肌鈣蛋白C(troponin C,TnC)和血藍(lán)蛋白(hemocyanin,HC)等[5],見(jiàn)圖1。

1.1 原肌球蛋白

TM 是人和動(dòng)物肌肉收縮過(guò)程中重要的調(diào)節(jié)蛋白,在脊椎動(dòng)物和無(wú)脊椎動(dòng)物中均廣泛存在；它在細(xì)肌絲中與肌動(dòng)蛋白雙螺旋并行存在,參與完成體內(nèi)多種生命活動(dòng)。 然而,甲殼類水產(chǎn)品肌肉組織中的TM 被認(rèn)為是所有可食用甲殼類水產(chǎn)品中的主要無(wú)脊椎動(dòng)物泛過(guò)敏原,可與72% ～98%的甲殼類食品過(guò)敏患者血清產(chǎn)生特異性IgE 結(jié)合[5]。 自1981年,TM 首次被鑒定為褐蝦(Penaeus aztecus)的一種過(guò)敏原[6],隨后TM 在斑節(jié)對(duì)蝦(Penaeus monodon)[7]、克氏原螯蝦(Procambarus clarkii)[8]、雪蟹(Chinopecetes opilio)[9]等水產(chǎn)品中被陸續(xù)發(fā)現(xiàn)。 TM 結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)也相繼被鑒定,研究發(fā)現(xiàn)TM 是一類非常保守的高度穩(wěn)定的同源二聚體蛋白,由284 個(gè)氨基酸組成,分子質(zhì)量分布在32 ～38 kDa,等電點(diǎn)約為4.2[3,10]。 TM 是由兩個(gè)相同的α-螺旋構(gòu)型的多肽鏈相互纏繞而形成的超螺旋結(jié)構(gòu)[圖1(a)],這種形式的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)賦予了TM 結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性,因此它能夠耐受高溫和高壓加工條件,并保持其致敏性[11-12]。

圖1 甲殼類水產(chǎn)品主要過(guò)敏原的三維結(jié)構(gòu)Fig.1 Three-dimensional structure of mainly crustacean allergens

除此之外,已有研究報(bào)道TM 同時(shí)也是蟑螂、塵螨和軟體貝類的主要過(guò)敏原,因此TM 具有一定的交叉反應(yīng)性。 TM 高度保守的氨基酸序列是交叉反應(yīng)的主要原因[5]。 甲殼類水產(chǎn)品的TM 在其物種之間表現(xiàn)出高度的保守性和氨基酸序列的一致性,序列相似性為88% ～100%。 由于近的起源關(guān)系,甲殼類水產(chǎn)品的TM 與蟑螂和塵螨有很高的序列一致性,分別為80% ～97%和78% ～98%。 在對(duì)塵螨或蟑螂過(guò)敏的人群中,證明了對(duì)蝦過(guò)敏的IgE 反應(yīng)性。值得注意的是,甲殼動(dòng)物的TM 與軟體動(dòng)物的TM(55% ～65%)以及脊椎動(dòng)物的TM(54% ～60%)有較低的序列一致性[5,10]。

1.2 精氨酸激酶

AK 是一種廣泛存在于無(wú)脊椎動(dòng)物體內(nèi)的磷酸原激酶,是無(wú)脊椎動(dòng)物能量代謝中的一種重要酶,參與調(diào)節(jié)細(xì)胞ATP 水平。 AK 被鑒定為甲殼類水產(chǎn)品中僅次于TM 的一種重要過(guò)敏原。 對(duì)AK 血清特應(yīng)性結(jié)合研究發(fā)現(xiàn),10% ～51%的蝦過(guò)敏患者血清會(huì)出現(xiàn)特異性IgE 反應(yīng)。 自Yu 等[13]首次從黑虎蝦(Penaeus monodon)鑒定AK 為一種甲殼類過(guò)敏原,相繼發(fā)現(xiàn)AK 也是北海褐蝦(Crangon crangon)[14]、南美白對(duì)蝦(Litopenaeus vannamei)[15]、勇士棕蟹(Callinectes bellicosus)[16-17]、擬穴青蟹(Scylla paramamosain)[18]和羅氏沼蝦(Macrobrachium rosenbergii)[19]等多個(gè)甲殼類物種中的特異性致敏成分。 其中,南美白對(duì)蝦(Litopenaeus vannamei)[20]、擬穴青蟹(Scylla paramamosain)[21]等甲殼類水產(chǎn)品中AK 的晶體結(jié)構(gòu)也已經(jīng)通過(guò)X-射線衍射及核磁的手段被解析。 研究發(fā)現(xiàn),AK 由359 個(gè)氨基酸殘基組成,分子質(zhì)量為38 ～45 kDa,等電點(diǎn)為6.0,其蛋白三維結(jié)構(gòu)包含一個(gè)N 端的α 螺旋結(jié)構(gòu)域和一個(gè)C 端的αβ 結(jié)構(gòu)域[圖1(b)][13]。 AK 廣泛存在于各種甲殼類水產(chǎn)品中,具有較強(qiáng)的交叉反應(yīng)性。 與TM 一樣,AK 也被認(rèn)定為一種無(wú)脊椎動(dòng)物的泛過(guò)敏原。 對(duì)軟體動(dòng)物章魚、蝦和蟹等甲殼類水產(chǎn)品中AK 一級(jí)序列的同源性比對(duì)發(fā)現(xiàn),他們之間的序列同源性高達(dá)54%。 此外,結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)他們的三級(jí)結(jié)構(gòu)也高度相似。

1.3 肌質(zhì)鈣結(jié)合蛋白

SCP 屬于EF hand 鈣結(jié)合蛋白家族,含有特征的helix-loop-helix 的Ca2+結(jié)合域,其主要位無(wú)脊椎動(dòng)物肌肉和神經(jīng)組織中,在無(wú)脊椎動(dòng)物體內(nèi)調(diào)節(jié)肌肉收縮中發(fā)揮著重要的作用[圖1(c)]。 同時(shí),SCP也被鑒定為甲殼類水產(chǎn)品的另一種過(guò)敏原,其分子質(zhì)量約為20 kDa,等電點(diǎn)約為4.6。 2008年,Shiomi等[22]首次通過(guò)陰離子交換色譜結(jié)合反相高效液相色譜法從斑節(jié)對(duì)蝦(Penaeus monodon)中純化出SCP蛋白,并通過(guò)蝦過(guò)敏患者血清與斑節(jié)對(duì)蝦SCP 免疫反應(yīng)發(fā)現(xiàn),8/16(50%)的蝦過(guò)敏血清與SCP 有特異性IgE 反應(yīng)。 隨后,國(guó)內(nèi)外研究者分別在北海褐蝦(Crangon crangon)[14]、南美白對(duì)蝦(Litopenaeus van-namei)[4]、擬穴青蟹(Scylla paramamosain)[23]中也分別檢測(cè)到SCP。 值得注意的是,Ayuso 等[4]發(fā)現(xiàn)南美白對(duì)蝦(Litopenaeus vannamei)SCP 對(duì)17/20 例(85%)蝦過(guò)敏兒童血清具有特異性IgE 結(jié)合活性,證明SCP 可能是導(dǎo)致兒童出現(xiàn)蝦過(guò)敏疾病的主要過(guò)敏原。

此外,研究發(fā)現(xiàn)SCP 在同一物種或相似的物種中具有顯著的氨基酸序列同源性,且具有較強(qiáng)的交叉反應(yīng)性,然而不同物種之間氨基酸序列差異性較為顯著。 如在甲殼類水產(chǎn)品中的SCP 序列相似性為80% ～98%,然而甲殼類水產(chǎn)品和軟體類水產(chǎn)品之間的氨基酸序列同源性則僅有15% ～21%[2]。 SCP 是熱穩(wěn)定的鈣結(jié)合蛋白,且具有較強(qiáng)的酸堿穩(wěn)定性(在pH 值1 ～11 穩(wěn)定),包含4 個(gè)EF hand 結(jié)構(gòu)域,其中2 個(gè)或3 個(gè)保留了只結(jié)合Ca2+或混合Ca2+和Mg2+的能力[2,5],其中Ca2+對(duì)SCP 構(gòu)象和IgE 活性的維持扮演著重要作用。 SCP是一類有3 個(gè)亞基(SCP-Ⅰ、SCP-Ⅱ和SCP-Ⅲ)的過(guò)敏原,且所有這些異構(gòu)體都顯示出IgE 結(jié)合能力[2]。

1.4 肌球蛋白輕鏈

MLC 是肌球蛋白大分子復(fù)合物的一部分,構(gòu)成功能型肌肉蛋白結(jié)構(gòu),MLC 在肌肉收縮中起著重要的作用,因?yàn)樗牧姿峄瘯?huì)在收縮過(guò)程中影響肌動(dòng)蛋白-肌球蛋白復(fù)合物[2,5]。 MLC 屬于結(jié)合蛋白樣蛋白家族,通過(guò)EF hand 結(jié)構(gòu)域結(jié)合Ca2+,且具有較強(qiáng)的熱和極端pH 值下的穩(wěn)定性[圖1(d)]。MLC 首先被Ayuso 等[24]確定為南美白對(duì)蝦(Litopenaeus vannamei)的過(guò)敏原,并將其命名為L(zhǎng)it v 3,后來(lái)又在斑節(jié)蝦(Penaeus monodon)[25]、美國(guó)螯龍蝦(Homarus americanus)[26]、 北 海 褐 蝦(Crangon crangon)[14]和擬穴青蟹(Scylla paramamosain)[27]中被再次確認(rèn)。 到目前為止,一些MLC 已被確定為各種甲殼類水產(chǎn)品的過(guò)敏原,對(duì)MLC 呈現(xiàn)致敏性的甲殼類過(guò)敏患者從19% ～55%不等。 血清IgE 結(jié)合研究表明:與兒童相比,成人對(duì)MLC 的識(shí)別率更高,但目前關(guān)于MLC 在甲殼類水產(chǎn)品或其他物種之間的免疫學(xué)交叉反應(yīng)的數(shù)據(jù)仍然缺乏。

1.5 磷酸丙糖異構(gòu)酶

TPI 是一種廣泛存在于甲殼類水產(chǎn)品中的酶蛋白,分子質(zhì)量在26 ～29 kDa,耐熱性差,但耐酸堿性強(qiáng)。 天然狀態(tài)TPI 主要以二聚體的形式存在,其主要功能是參與葡萄糖能量代謝[5][圖1(e)]。 到目前為止,TPI 已在斑節(jié)對(duì)蝦(Penaeus monodon)[28]、北海褐蝦(Crangon crangon)[29]和擬穴青蟹(Scylla paramamosain)[14]中被鑒定為過(guò)敏原。 TPI 被認(rèn)為是一種次要的過(guò)敏原,蝦過(guò)敏血清IgE 結(jié)合測(cè)試發(fā)現(xiàn)特異性結(jié)合率在15% ～23%。 此外,除甲殼類水產(chǎn)品外,TIM 也在某些軟體、蟑螂和植物中被鑒定為過(guò)敏原,但尚未對(duì)這些物種之間由TIM 導(dǎo)致的交叉反應(yīng)性進(jìn)行詳細(xì)研究[5]。

1.6 血藍(lán)蛋白

HC 主要位于節(jié)肢動(dòng)物和軟體動(dòng)物類的頭胸部,在動(dòng)物呼吸及多種生理活動(dòng)中扮演關(guān)鍵作用。天然狀態(tài)下,HC 是以6 個(gè)高度螺旋異源亞基構(gòu)成的六聚體[圖1(f)],且其亞基的數(shù)量具有物種特異性,亞基分子質(zhì)量為72 kDa 或75 kDa,具有良好熱穩(wěn)定性和耐胰酶消化特性[2]。 在2011年,HC 首次被鑒定為羅氏沼蝦(Macrobrachium rosenbergii)的過(guò)敏原[30]。 Piboonpocanun 等[30]經(jīng)離子交換色譜從羅氏沼蝦(Macrobrachium rosenbergii)中提取純化獲得兩個(gè)高分子質(zhì)量的蛋白亞基(72 kDa 和75 kDa),經(jīng)LC-MS/MS 鑒定為HC,通過(guò)蝦過(guò)敏血清IgE 測(cè)試試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)其具有顯著的特異性IgE 反應(yīng)。 蛋白序列比對(duì)發(fā)現(xiàn),72 kDa 和75 kDa 的兩個(gè)蛋白亞基與其他甲殼類水產(chǎn)品的HC 序列同源性在62.5% ～100%。同時(shí),此項(xiàng)研究也顯示在未處理和煮處理后的HC提取物中均檢測(cè)到了一定的IgE 結(jié)合活性,表明HC是又一類甲殼類熱穩(wěn)定的過(guò)敏原。 不同的是,Guillen 等[31]通過(guò)血清IgE 反應(yīng)性發(fā)現(xiàn)只在未處理的蝦提取物中發(fā)現(xiàn)了IgE 結(jié)合,煮處理的蝦提取物IgE 活性完全喪失,可能這種蛋白質(zhì)只是在某種程度上具有熱穩(wěn)定性,還需要進(jìn)行更多的研究來(lái)證實(shí)這個(gè)問(wèn)題。 此外,Guillen 等[31]報(bào)道了3 位在攝入南美白對(duì)蝦(Litopenaeus vannamei)后出現(xiàn)過(guò)敏性休克的患者,血清IgE 測(cè)試發(fā)現(xiàn)均與血藍(lán)蛋白有較強(qiáng)IgE反應(yīng),這也是第一例在南美白對(duì)蝦中發(fā)現(xiàn)HC 為過(guò)敏原的報(bào)告。

1.7 其他過(guò)敏原成分

除了常見(jiàn)甲殼類過(guò)敏原以外,隨著國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)食物過(guò)敏研究的重視,越來(lái)越多過(guò)敏成分陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)。 Lee 等[32]發(fā)現(xiàn)在未處理和蒸處理的南美白對(duì)蝦(Litopenaeus vannamei)提取物中一個(gè)63 kDa 的蛋白條帶可與4/7 名蝦過(guò)敏患者的血清發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng),隨后該蛋白通過(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)質(zhì)譜法被鑒定為丙酮酸激酶。 Yang 等[29]發(fā)現(xiàn)克氏原螯蝦(Pro-cambarus clarkii)肌肉提取物中90 kDa 蛋白具有高的IgE 結(jié)合活性,進(jìn)一步采用硫酸銨分步沉淀及陰離子交換柱層析,提取純化并鑒定其為新型過(guò)敏原細(xì)絲蛋白C(filamin C)。 此外,在甲殼類水產(chǎn)品中發(fā)現(xiàn)的肌球蛋白重鏈、α-肌動(dòng)蛋白、平滑內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+ATP 酶和甘油醛-3-磷酸脫氫酶也被鑒定為過(guò)敏原[2,5]。 然而,它們的分子結(jié)構(gòu)特征和致敏潛力還需要進(jìn)一步研究。 隨著分子生物學(xué)和免疫學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展,對(duì)甲殼類水產(chǎn)品過(guò)敏原成分的研究一定會(huì)更加深入。

由研究報(bào)道可知,甲殼類水產(chǎn)品主要過(guò)敏原見(jiàn)表1[4,7-8,13-19,22-30,33-43]。

表1 甲殼類水產(chǎn)品過(guò)敏原Tab.1 Allergens of crustacean aquatic products

2 甲殼類水產(chǎn)品過(guò)敏原致敏性消減技術(shù)

甲殼類過(guò)敏原主要是水溶性糖蛋白,分子質(zhì)量為10 ～70 kDa,對(duì)常規(guī)加熱和酸處理具有一定耐受性。 過(guò)敏原的免疫活性主要取決于其抗原表位的保留和IgG 或IgE 的識(shí)別。 研究表明:熱加工和非熱加工技術(shù)可能會(huì)導(dǎo)致蛋白的變性、聚集、交聯(lián)、氧化和糖基化等從而掩蓋或破壞過(guò)敏原抗原表位,進(jìn)而改變食品過(guò)敏原致敏性[1-2]。 近年來(lái),國(guó)內(nèi)外研究者系統(tǒng)探究了不同的加工方法對(duì)甲殼水產(chǎn)品過(guò)敏原致敏性的影響,以期制備低敏或無(wú)敏甲殼類食品。根據(jù)原理的不同,可將這些手段分為物理加工消減技術(shù)、化學(xué)修飾消減技術(shù)和生物修飾消減技術(shù)。 表2 總結(jié)了目前常見(jiàn)加工技術(shù)類型及其對(duì)甲殼類水產(chǎn)品過(guò)敏原免疫反應(yīng)性的影響[11-12,33,44-62]。

表2 不同甲殼類水產(chǎn)品過(guò)敏原致敏性消減技術(shù)Tab.2 Summary of different processing technologies for mitigating crustacean allergenicity

2.1 物理加工消減技術(shù)

物理加工是目前應(yīng)用最廣泛的食品加工方式,包括熱處理、高壓處理、超聲處理、微波處理和低溫等離子體處理等。

2.1.1 熱處理消減

傳統(tǒng)熱處理是最常用的物理處理方式,且熱處理的方式較多,如煮處理、蒸處理、高壓蒸汽處理和微波處理等。 一般來(lái)說(shuō),食品的熱處理過(guò)程伴隨著不同的修飾反應(yīng),如蛋白變性、肽鍵的破壞、二硫鍵的重排以及與其他成分包括碳水化合物和脂類的相互作用[2,44]。 Kamath 等[44]發(fā)現(xiàn)煮處理的甲殼類(蝦、龍蝦和螃蟹)過(guò)敏原提取物中僅有兩個(gè)主要過(guò)敏原組分,分別為TM 和SCP,且免疫印跡分析發(fā)現(xiàn)煮處理的TM 具有更高的IgG結(jié)合能力。 Zhao 等[11-12]也發(fā)現(xiàn)不同烹飪處理使南美白對(duì)蝦(Litopenaeus vannamei)提取物的IgG 和IgE結(jié)合能力顯著降低,但不能完全消除其IgG 和IgE反應(yīng)性,其中,熱處理后蝦提取物中的TM 具有更高的IgG 和IgE 反應(yīng)性。 然而,Lasekan 等[45]發(fā)現(xiàn)蒸處理、煮處理、炸處理、烤處理和微波處理的斑節(jié)對(duì)蝦(Penaeus monodon)TM 致敏性無(wú)明顯變化,但高壓蒸汽處理(0.14 MPa、121 ℃、20 min)可顯著降低蝦TM 的IgE 結(jié)合能力。 相似地,Yu 等[46]分析比較熱處理、超聲結(jié)合熱處理及高壓蒸汽處理的擬穴青蟹(Scylla paramamosain)主要過(guò)敏原TM 致敏性和消化性的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn),僅加熱處理后的TM 致敏性和消化性無(wú)明顯變化,然而加熱結(jié)合微波處理與高溫高壓處理(0.14 MPa、121 ℃、20 min)的TM 表現(xiàn)出顯著降低的IgE 結(jié)合能力和消化穩(wěn)定性。 研究表明:熱處理可在一定程度上可以降低甲殼類過(guò)敏原的整體致敏性,但難以完全消除過(guò)敏原致敏性,甚至蝦主要過(guò)敏原組分TM 表現(xiàn)出更高的致敏潛力。熱處理結(jié)合其他非熱加工形式,如高壓和微波處理,具有更好的致敏性消減潛力。 值得注意的是,熱處理對(duì)甲殼類過(guò)敏原影響結(jié)果表現(xiàn)出不一致性,可能與處理樣品、熱處理的條件或過(guò)敏原組分的耐熱性不同有關(guān),未來(lái)仍需要進(jìn)一步研究明確。

2.1.2 超高壓消減

超高壓處理主要通過(guò)破壞蛋白的一些非共價(jià)鍵,如氫鍵、離子鍵和疏水相互作用,從而實(shí)現(xiàn)對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的修飾,但一般不會(huì)涉及蛋白一級(jí)結(jié)構(gòu)的改變[63]。 近年來(lái),人們陸續(xù)探究了高壓處理對(duì)食品致敏性的影響,其可能的機(jī)制包括蛋白質(zhì)變性、構(gòu)象改變、促進(jìn)酶解等,達(dá)到致敏性消減的作用。 此外,高壓處理通過(guò)提取或釋放膜內(nèi)的過(guò)敏原到外部環(huán)境中,從而使這些分子可以被水解酶去除而破壞,達(dá)到間接減輕或消除一些食品的致敏性,但不需要消除致敏蛋白本身[2]。 Long 等[48]對(duì)南美白對(duì)蝦(Litopenaeus vannamei)提取物進(jìn)行高壓和/或熱處理,并通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)ELISA 和BALB/c 小鼠過(guò)敏模型分析了TM的致敏性,與煮處理的TM 相比,當(dāng)樣品在55 ℃、500 MPa 下處理10 min,發(fā)現(xiàn)IgE 結(jié)合能力減少73.59%。 此外,在BALB/c 小鼠過(guò)敏模型中,高壓結(jié)合55 ℃熱處理的TM 喂養(yǎng)的小鼠,其特異性IgE水平明顯降低,同時(shí)血清中的組胺水平也顯著低于陽(yáng)性對(duì)照組。 胡志和等[49]采用不同高壓處理凡納濱對(duì)蝦(Litopenaeus vannamei)TM,結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著處理壓力的增加TM 致敏性出現(xiàn)先減弱后增強(qiáng)的趨勢(shì),在300 MPa 處理40 min 的TM 疏水性殘基暴露程度最小,致敏性最低,然而700 MPa 處理?xiàng)l件的TM 疏水性殘基暴露程度最高,且致敏性最高。Faisal 等[47]利用高壓蒸汽處理(600 MPa、120 ℃、5 min)結(jié)合不同溫度(40、80、120 ℃)熱處理墨吉對(duì)蝦(Penaeus merguiensis)提取物5 min,發(fā)現(xiàn)其致敏性先出現(xiàn)顯著增加,后與未處理樣品無(wú)明顯差異；相同條件處理10 min,發(fā)現(xiàn)蝦提取物其致敏性出現(xiàn)先顯著增加,后顯著降低,結(jié)果的不同可能歸因于加工過(guò)程中IgE 結(jié)合表位的暴露與掩蓋。 研究結(jié)果表明:在高溫條件下,通常會(huì)獲得普遍的致敏性降低的效果,不同的研究結(jié)果可能歸因于樣品和處理?xiàng)l件,如溫度、壓力、處理時(shí)間等的不同。 此外,當(dāng)進(jìn)行某些樣品的處理時(shí),應(yīng)對(duì)處理參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化,并需要進(jìn)行更多的動(dòng)物和人體試驗(yàn)來(lái)確認(rèn)致敏性降低的可行性。

2.1.3 超聲消減

高強(qiáng)度超聲波是一種機(jī)械振蕩頻率高于20 kHz的聲波,其作為一種新型的食品加工技術(shù)被廣泛應(yīng)用于食品加工過(guò)程中的干燥、均質(zhì)、過(guò)濾、提取、酶滅活和肉類嫩化等。 同時(shí),這種含有能量的超聲波振動(dòng)引起的與食品基質(zhì)的相互作用,可產(chǎn)生一系列機(jī)械效應(yīng)、熱效應(yīng)和空化效應(yīng),導(dǎo)致部分蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)發(fā)生改變[63]。 研究表明:超聲處理可導(dǎo)致過(guò)敏原結(jié)構(gòu)改變,從而降低食物過(guò)敏原的致敏性。 Li等[64]利用超聲處理南美白對(duì)蝦(Penaeus vannamei)過(guò)敏原提取物,通過(guò)免疫印跡和ELISA 試驗(yàn)分析發(fā)現(xiàn)超聲處理能夠降低蝦過(guò)敏原蛋白的IgE 結(jié)合能力,并推斷這可能歸因于超聲波的空穴效應(yīng)破壞了蝦過(guò)敏原的IgE 結(jié)合表位。 Zhang 等[33]探究了高強(qiáng)度超聲處理對(duì)秀麗白蝦(Exopalaemon modestus)TM結(jié)構(gòu)、體外消化性和致敏性的影響,發(fā)現(xiàn)超聲處理導(dǎo)致TM α-螺旋含量顯著減少,而β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)則卷曲含量增加。 通過(guò)免疫印跡和ELISA 分析發(fā)現(xiàn)這些結(jié)構(gòu)的變化降低了TM 的致敏性,并有助于TM 消化性的改善。 Dong 等[50]探究了高濃度超聲處理對(duì)南美白對(duì)蝦(Litopenaeus vannamei)理化性質(zhì)和致敏性的影響,超聲處理(20 kHz、400 W)蝦過(guò)敏原含量隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸降低,在20 min 時(shí)具有最低的致敏性,TM 含量減少了76%,且體外消化性顯著提高。 劉光明等[52]發(fā)現(xiàn)超聲處理可顯著降低擬穴青蟹(Scylla paramamosain)TM 的致敏性和消化穩(wěn)定性,并發(fā)現(xiàn)結(jié)合蒸煮處理效果更好,其可能原因是超聲處理使TM 蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生一定改變,進(jìn)一步結(jié)合蒸煮處理可導(dǎo)致TM 結(jié)構(gòu)的進(jìn)一步降解與結(jié)構(gòu)變化,有利于后續(xù)蛋白酶的酶解。 相似的,Yu 等[65]發(fā)現(xiàn)單獨(dú)蒸煮處理對(duì)擬穴青蟹(Scylla paramamosain)TM 致敏性和消化性無(wú)明顯影響,但蒸煮結(jié)合超聲處理可顯著降低TM 致敏性和消化穩(wěn)定性。 高強(qiáng)度超聲作為一種新型的非熱加工技術(shù),在降低食品的致敏性方面表現(xiàn)出巨大的潛力。 與熱加工技術(shù)相比,它消耗的能量更少,傳質(zhì)率更高,而不改變食品的基本特性,但超聲處理也很難消除蝦的過(guò)敏原致敏性,超聲處理協(xié)同其他加工技術(shù),如熱處理、高壓蒸汽處理等,將更具應(yīng)用潛力。

2.1.4 低溫等離子體消減

低溫等離子體技術(shù)是一種新興的食品非熱加工技術(shù),具有食品組分破壞性小、殺菌效率高、作用時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn),并可以改善食品理化特性,已成功應(yīng)用于肉制品保藏和果蔬殺菌保鮮等領(lǐng)域[63]。然而,目前關(guān)于低溫等離子體處理對(duì)于甲殼類水產(chǎn)品過(guò)敏原致敏性消減的影響研究較少,關(guān)于冷等離子體降解過(guò)敏原的確切機(jī)制和詳細(xì)路徑仍有一些不確定性。 研究表明,低溫等離子體處理可造成蛋白質(zhì)肽鍵的斷裂,氨基酸殘基的氧化和蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)交聯(lián)的形成,進(jìn)一步誘發(fā)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的破壞引起過(guò)敏原線性和構(gòu)象表位的變化,從而消減過(guò)敏原的IgE 結(jié)合能力[1]。 最近,Ekezie等[66]探究不同時(shí)間低溫等離子體處理南美白對(duì)蝦(Litopenaeus vannamei),發(fā)現(xiàn)低溫等離子體處理后的蝦提取物pH 值和蛋白質(zhì)溶解度顯著下降,且低溫等離子處理對(duì)蝦的理化和結(jié)構(gòu)特征有相當(dāng)大的影響。 在另一項(xiàng)研究中,Ekezie 等[53]利用低溫等離子體處理南美白對(duì)蝦(Litopenaeus vannamei)TM,發(fā)現(xiàn)蝦TM 的二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生顯著變化,出現(xiàn)α-螺旋含量降低,β-折疊和無(wú)規(guī)則卷曲含量升高,最終使得TM 的IgE 和IgG 結(jié)合能力下降。 Shriver 等[67]發(fā)現(xiàn),南美白對(duì)蝦(Litopenaeus vannamei)經(jīng)30 kV、60 Hz 的等離子體處理5 min,蝦TM 致敏性降低76%。 可見(jiàn),低溫等離子體技術(shù)可以有效降低甲殼類水產(chǎn)品過(guò)敏原致敏性,但還需要更多的研究來(lái)證實(shí)其有效性,并優(yōu)化等離子體處理參數(shù)。

2.1.5 輻照消減

輻照處理是另一種新型的非熱加工技術(shù),可促進(jìn)生物大分子的降解、交聯(lián)和分子構(gòu)象的變化,破壞或改變抗體結(jié)合點(diǎn),使過(guò)敏原的致敏性降低,甚至完全喪失[55-56]。 最近,Muanghorn 等[68]采用γ-輻射處理羅氏沼蝦(Macrobrachium rosenbergii),在免疫印跡分析中發(fā)現(xiàn),γ-輻照處理導(dǎo)致TM 免疫印跡條帶強(qiáng)度顯著降低,這可能歸因于γ-輻照改變了TM結(jié)構(gòu),導(dǎo)致IgG 無(wú)法識(shí)別。 研究表明輻照結(jié)合熱處理可以更好地達(dá)到降低過(guò)敏原致敏性的效果,且輻照劑量在過(guò)敏原的消減中扮演重要作用[54]。 然而,Liu 等[56]研究了輻照處理對(duì)冷凍刀額新對(duì)蝦(Metapenaeus ensis)的影響,發(fā)現(xiàn)在輻照劑量為0 ～3 kGy時(shí),IgE 結(jié)合能力出現(xiàn)明顯增加,隨著進(jìn)一步輻照劑量的增加(3 ～10 kGy),TM IgE 結(jié)合能力出現(xiàn)降低,隨著劑量增加到10 kGy,TM 的IgE 結(jié)合能力僅降低約20%。 這可能是由于輻照的能量無(wú)法穿透冷凍蝦。 此研究與Costa 等[69]報(bào)道結(jié)果一致:高劑量和長(zhǎng)時(shí)間的輻射可造成過(guò)敏原結(jié)構(gòu)變化,降低TM 的IgE 結(jié)合能力,而小劑量的輻射則使其增加。應(yīng)該指出的是,輻照處理似乎并非是控制甲殼水產(chǎn)品過(guò)敏原的理想技術(shù)。 因?yàn)榈蛣┝康妮椪談┝靠赡軙?huì)增加其致敏性,雖然高劑量的輻照可使甲殼類水產(chǎn)品過(guò)敏原的致敏活性下降,但高劑量的輻照可能會(huì)引起劑量殘留,從而對(duì)消費(fèi)者產(chǎn)生不良影響。

2.2 化學(xué)修飾消減技術(shù)

2.2.1 酸處理消減

食物基質(zhì)環(huán)境中酸堿性的變化是加工過(guò)程中的常見(jiàn)環(huán)節(jié),也是目前工業(yè)化以“堿溶酸沉”為主要工藝生產(chǎn)分離蛋白的基本原理之一。 目前,關(guān)于酸處理后甲殼類水產(chǎn)品過(guò)敏原致敏性變化報(bào)道較少。Perez-Macalalag 等[70]發(fā)現(xiàn),經(jīng)煮處理并預(yù)先在醋中浸泡8 h 的蝦提取物表現(xiàn)出更低的致敏性。 然而,Lasekan 等[57]發(fā)現(xiàn)在pH 值為1.0 ～3.5 的醋中腌制的蝦可溶性肌纖維蛋白的可提取性明顯降低,大量的TM 出現(xiàn)在不溶性沉淀中,且可溶性蛋白部分中的TM 表現(xiàn)出IgE 結(jié)合能力的顯著降低。 然而,所有腌制蝦的不溶性蛋白部分的TM 都顯示出更強(qiáng)的IgE 結(jié)合能力。 酸處理對(duì)過(guò)敏原結(jié)構(gòu)修飾進(jìn)而消減其致敏性,主要是通過(guò)蛋白質(zhì)內(nèi)部氨基酸質(zhì)子化實(shí)現(xiàn)的。 在低于蛋白等電點(diǎn)的條件下,溶液中多余的H+將使蛋白質(zhì)分子中的自由氨基和羧基質(zhì)子化,分子內(nèi)部將發(fā)生相同電荷的相互排斥,從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的解折疊,進(jìn)而破壞其構(gòu)象表位,導(dǎo)致致敏性顯著降低。 然而,在存在大量線性表位的情況下,酸性條件可能無(wú)法降低其致敏性。

2.2.2 糖基化消減

糖基化是廣泛存在于食品工業(yè)中蛋白質(zhì)和糖之間的一種非酶褐變,是還原糖的羰基和氨基酸的游離氨基(通常是精氨酸和賴氨酸)在食品熱加工或長(zhǎng)期儲(chǔ)存后發(fā)生的反應(yīng),又稱美拉德反應(yīng)。 研究發(fā)現(xiàn),美拉德反應(yīng)可引起蛋白功能特性、生物利用率、免疫反應(yīng)性和致敏性的改變,其主要機(jī)理是通過(guò)氨基酸和糖相互作用導(dǎo)致蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)的改變,從而改變了它們的構(gòu)象表位。 此外,形成的高分子質(zhì)量和不溶性聚集體的形成有助于掩蓋構(gòu)象和線性表位,從而降低了糖化蛋白的潛在致敏性[58,71]。 國(guó)內(nèi)外眾多學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)糖基化反應(yīng)能夠消減食物過(guò)敏原的致敏性,且消減程度主要取決于所用還原糖的種類。 Zhang 等[58]利用不同分子質(zhì)量糖與秀麗白蝦(Exopalaemon modestus)TM 進(jìn)行糖基化,發(fā)現(xiàn)分子質(zhì)量越小的糖分子越易與TM 發(fā)生糖基化反應(yīng),進(jìn)而產(chǎn)生更多糖基化終產(chǎn)物(advanced glycation endproducts,AGEs)。 此外,動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),與未糖基化的TM 相比,糖基化的TM 能夠顯著降低小鼠脾臟和腸系膜淋巴結(jié)淋巴細(xì)胞內(nèi)Th2 型細(xì)胞因子(IL-4和IL-13)和Th1 型細(xì)胞因子(IL-10 和TGF-β)的分泌,減弱對(duì)小鼠的過(guò)敏反應(yīng)。 此外,Fu 等[72]利用核糖、低聚半乳糖和低聚殼聚糖與中國(guó)對(duì)蝦(Penaeus chinensis)TM 過(guò)敏原進(jìn)行美拉德反應(yīng),發(fā)現(xiàn)不同類型糖糖基化均可顯著降低TM α-螺旋含量,造成TM結(jié)構(gòu)和表位的顯著變化,導(dǎo)致TM 致敏性均顯著降低,致敏性最高可降低60%。 Han 等[71]利用核糖、阿拉伯糖、乳糖、葡萄糖和麥芽糖與擬穴青蟹(Scylla paramamosai)TM 和AK 進(jìn)行美拉德反應(yīng),發(fā)現(xiàn)糖基化后的TM 和AK 致敏性均有不同程度的下降。 值得注意的是,糖基化和交聯(lián)反應(yīng)較難控制,生成的有害伴隨產(chǎn)物(如AGEs)存在潛在安全風(fēng)險(xiǎn)等。

2.3 生物修飾消減技術(shù)

2.3.1 酶處理消減

酶解處理是溫和的,可以破壞蛋白質(zhì)的一級(jí)蛋白序列和原始功能特性,已被認(rèn)為是降低致敏性的有效工具。 常用的水解酶,如胰蛋白酶和木瓜蛋白酶；而其他酶包括酪氨酸酶、多酚氧化酶和漆酶,主要用于蛋白質(zhì)的交聯(lián)[10]。 相應(yīng)的機(jī)制主要分為兩種方式。 1)TM 可以被蛋白酶水解為多肽、氨基酸或其他小分子,從而改變空間構(gòu)象[2]；2)由酶引起的分子間或分子內(nèi)交聯(lián)導(dǎo)致了蛋白質(zhì)構(gòu)象的破壞[59]。 Huang 等[73]分別用胃蛋白酶和胰蛋白酶研究了鋸緣青蟹(Scylla serrata)TM 在模擬胃液(SGF)和模擬腸液(SIF)中的消化穩(wěn)定性,結(jié)果顯示,在SGF 中,肌動(dòng)蛋白和肌球蛋白重鏈被胃蛋白酶迅速降解,而TM 對(duì)胃蛋白酶有一定的抵抗力。 然而,在SIF 系統(tǒng)中,肌球蛋白重鏈被迅速降解,而肌動(dòng)蛋白表現(xiàn)出與TM 同樣的抗胰蛋白酶消化性。 在另一項(xiàng)研究中, Mejrhit 等[74]發(fā)現(xiàn)蝦TM 經(jīng)胃蛋白酶(30 μg/mL)在條件下pH 2 處理2 h,結(jié)果顯示酶解后的TM 與20 種人血清IgE 的識(shí)別度下降89.4%,而與兔IgG 的識(shí)別度下降90.5%。 當(dāng)結(jié)合加熱(90 ℃) 時(shí), IgG 結(jié)合能力的最大下降幅度為85.1%。

2.3.2 發(fā)酵處理消減

利用雙歧桿菌、乳酸桿菌等益生菌發(fā)酵,是當(dāng)前應(yīng)用較多的一種食品加工工藝。 利用益生菌對(duì)食物進(jìn)行發(fā)酵處理,可以使難溶解的大分子物質(zhì)在益生菌分泌物的作用下分解為易溶的小分子物質(zhì),不僅能夠改善質(zhì)地、風(fēng)味、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值,增加穩(wěn)定性,而且還能夠降低過(guò)敏原的致敏性。 目前,關(guān)于發(fā)酵大豆制品、發(fā)酵牛乳制品和發(fā)酵小麥制品相關(guān)研究已有較多報(bào)道,發(fā)現(xiàn)發(fā)酵制品致敏性明顯低于其非發(fā)酵制品[75]。 食物中的過(guò)敏原主要為蛋白質(zhì),通過(guò)發(fā)酵處理可以大分子蛋白分解或變性,破壞其構(gòu)象表位和線性表位,以達(dá)到消除過(guò)敏原或降低致敏性的目的。Park 等[62]發(fā)現(xiàn)采用傳統(tǒng)韓國(guó)泡菜發(fā)酵工藝處理的日本毛蝦(Acetes japonicus)致敏性顯著降低。 李鴻雁等[61]報(bào)道了乳酸菌發(fā)酵可顯著降低海蝦過(guò)敏原致敏性,在采用乳酸菌發(fā)酵溫度為37 ～42 ℃,發(fā)酵時(shí)間48 ～60 h 的蝦肉中已無(wú)IgE 結(jié)合能力。

3 結(jié)論與展望

當(dāng)前,食物過(guò)敏的發(fā)病率逐年攀升,這給社會(huì)、家庭及個(gè)人帶來(lái)了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)及健康負(fù)擔(dān)。雖然,目前對(duì)甲殼類過(guò)敏原鑒定、理化性質(zhì)表征、抗原表位的確認(rèn)及過(guò)敏原消減技術(shù)的研究已經(jīng)取得了一定進(jìn)展,但仍有很多方面值得深入研究。首先,雖然一些甲殼類過(guò)敏原已經(jīng)被鑒定,甚至三維結(jié)構(gòu)晶體已被表征,但抗原表位尚未完全闡明,且仍需采過(guò)敏患者血清進(jìn)一步挖掘新的甲殼類過(guò)敏原,以實(shí)現(xiàn)更好的過(guò)敏診斷和預(yù)防。 其次,目前過(guò)敏原消減技術(shù)機(jī)制研究大多集中在整個(gè)過(guò)敏原,而不是特定的過(guò)敏原表位區(qū)域。 表位是位于蛋白質(zhì)特定區(qū)域的氨基酸序列,通常被受體細(xì)胞識(shí)別,可以激活淋巴細(xì)胞引發(fā)免疫反應(yīng),是過(guò)敏原致敏性的分子基礎(chǔ)。 因此,在隨后的研究中,可以應(yīng)用跨學(xué)科的技術(shù)和生物學(xué)方法,如重疊合成肽、噬菌體展示、表面等離子體共振、蛋白質(zhì)芯片和生物信息學(xué)方法等來(lái)識(shí)別這些特定的表位區(qū)域,更好闡明不同加工技術(shù)對(duì)過(guò)敏原結(jié)構(gòu)和表位修飾的影響機(jī)制,以開發(fā)適合過(guò)敏性患者食用的低致敏甲殼類食品。 此外,多種過(guò)敏原消減技術(shù)被證實(shí)可以降低甲殼類水產(chǎn)品過(guò)敏原致敏性,但目前僅處于研究階段,離實(shí)際應(yīng)用還有一定距離。 并且單一加工技術(shù)手段的應(yīng)用難以徹底消除多種過(guò)敏原致敏性,結(jié)合不同新型加工技術(shù)的優(yōu)勢(shì)可能為過(guò)敏原致敏性完全消除提供一個(gè)可靠解決方案,同時(shí)保持甲殼類水產(chǎn)品的感官和質(zhì)量特性,這些可以成為未來(lái)研究的主題。 最后,國(guó)內(nèi)外研究者還需要進(jìn)行體內(nèi)外毒理學(xué)分析,由于個(gè)體差異過(guò)敏癥患者可能對(duì)加工的甲殼類產(chǎn)品有完全不同的反應(yīng)。 需要更多的動(dòng)物和人體試驗(yàn)來(lái)確認(rèn)這些創(chuàng)新的非熱能技術(shù)的可行性,同時(shí)也應(yīng)認(rèn)真考慮人體試驗(yàn)的倫理問(wèn)題。 總之,未來(lái)研究者有必要繼續(xù)深入系統(tǒng)地研究甲殼類水產(chǎn)品過(guò)敏原及其消減技術(shù),為推進(jìn)過(guò)敏原消減技術(shù)的實(shí)際應(yīng)用,開發(fā)低致敏性甲殼類食品提供依據(jù)。