高粱醇溶蛋白對濃香型白酒窖泥味的消減機(jī)制

朱 琳, 李良好, 李 晴, 耿曉杰, 鄭福平, 李賀賀, 孫金沅, 黃明泉, 孫寶國

(北京工商大學(xué) 食品質(zhì)量與安全北京實驗室/中國輕工業(yè)釀酒分子工程重點實驗室/中國輕工業(yè)酒類品質(zhì)與安全重點實驗室, 北京100048)

濃香型白酒占中國白酒總產(chǎn)量的70%,是十二大香型白酒中產(chǎn)量最多的品種,也是中國最重要的傳統(tǒng)蒸餾酒之一[1]。 瀘州老窖、古井貢、五糧液、洋河等廣受歡迎的品牌白酒都是濃香型的。 與其他香型白酒的生產(chǎn)不同,濃香型白酒的窖池以黃泥筑成,頂上覆蓋窖泥[2]。 窖泥中富含腐殖質(zhì)、氨基酸、有機(jī)酸以及鐵、鋁、鈣等微量成分,并且含有長期在特定環(huán)境中馴養(yǎng)的窖泥功能菌,如己酸菌、丁酸菌、2,3-丁二醇菌等[3-4]。 這樣的窖池賦予了濃香型白酒以己酸乙酯為主體香的復(fù)合香氣。 但因為窖泥的使用,也向酒中引入了窖泥味[5]。 通常窖泥味在濃香型白酒中被視為一種異臭味,需要在生產(chǎn)過程中控制其產(chǎn)生。

4-甲基苯酚和3-甲基吲哚被發(fā)現(xiàn)是造成濃香型白酒中窖泥味的關(guān)鍵氣味物質(zhì),這兩種物質(zhì)都帶有類似馬廄和動物糞便的味道。 其中3-甲基吲哚的產(chǎn)生被認(rèn)為與乳酸菌對釀酒原料中色氨酸的降解有關(guān)[6],4-甲基苯酚由窖泥中的丁酸梭菌(Clostridium butyricum)代謝產(chǎn)生[7]。 2017年,Du 等[7]在濃香型白酒中發(fā)現(xiàn)一些酚類物質(zhì),如4-甲基苯酚等,呈現(xiàn)馬糞味和藥香味混合的氣味,與窖泥味十分相近。2018年,Dong 等[5]使用液液微萃取結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜-嗅味儀分析了瀘州老窖酒中窖泥味的來源,發(fā)現(xiàn)3-甲基吲哚也是造成白酒窖泥味的重要氣味物質(zhì),4-甲基苯酚和3-甲基吲哚的OAV 值分別為20和8。 因此,控制3-甲基吲哚和4-甲基苯酚的產(chǎn)生和揮發(fā)是改善濃香型白酒中窖泥臭味的關(guān)鍵。

對于白酒生產(chǎn)來說,改進(jìn)發(fā)酵方式是減少成品酒中窖泥味的根本方法,但發(fā)酵方式的改變往往涉及大量的工藝調(diào)整環(huán)節(jié),需要資金和場地支撐。 因此,嘗試探索以非揮發(fā)性成分減弱異味不失為一種好方法[8]。 “內(nèi)尋外加,自然強(qiáng)化”,從白酒釀酒原料或者酒糟中提取非揮發(fā)性成分加入白酒中是比尋找非白酒相關(guān)材料更為可靠的方法[9-10]。 濃香型白酒的釀酒原料主要以高粱為主,根據(jù)白酒品種的不同也含有玉米、小麥、大米、糯米等其他材料[11],這些材料中存在著豐富的谷物醇溶蛋白,如高粱醇溶蛋白(kafirin)、玉米醇溶蛋白(zein)、小麥醇溶蛋白(gliadin)等[12]。 研究表明,蛋白質(zhì)和多肽類化合物有結(jié)合小分子氣味化合物、從而降低其揮發(fā)度的作用。 Huang 等[13]在模擬酒樣中加入200 μg/L 四肽Ala-Lys-Arg-Ala 后,發(fā)現(xiàn)4-甲基苯酚的頂空濃度減少了47.56%。 大豆蛋白[14]、乳球蛋白[15]和乳清蛋白[16]等也被證明可以吸附揮發(fā)性成分,但到目前為止,還沒有在白酒中應(yīng)用蛋白質(zhì)吸附異臭味化合物的相關(guān)研究。

本研究探索了添加高粱醇溶蛋白對濃香型白酒中窖泥味的消減作用。 首先探究高粱醇溶蛋白對帶窖泥異味的典型酒樣的香氣輪廓的影響；然后以3-甲基吲哚和4-甲基苯酚作為窖泥味的典型代表化合物,結(jié)合固相微萃取探究高粱醇溶蛋白對其揮發(fā)性的影響；再探究高粱醇溶蛋白對3-甲基吲哚和4-甲基苯酚氣味閾值改變的影響；結(jié)合紫外-可見分光光度法研究高粱醇溶蛋白對其結(jié)合常數(shù)、熱力學(xué)參數(shù)的影響；最后結(jié)合分子對接模型探討高粱醇溶蛋白與3-甲基吲哚、4-甲基苯酚之間的親和能和對接位點。 希望本研究結(jié)果可為降低濃香型白酒中的異臭味提供解決方案,為食品中異臭味成分的消減研究提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 實驗材料

高粱醇溶蛋白。 高粱醇溶蛋白依據(jù)前人方法從酒糟(由河北衡水老白干有限公司提供)中自提[17]。凱氏定氮法測得其蛋白質(zhì)純度為98.36%,聚丙烯酰胺凝膠電泳實驗顯示高粱醇溶蛋白由α-高粱醇溶蛋白和β-醇溶蛋白構(gòu)成。

高粱醇溶蛋白儲備液。 將高粱醇溶蛋白粉末在55 ℃水浴,pH 值為3 的條件下分散在體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇水溶液中,轉(zhuǎn)速300 r/min 不間斷攪拌2 h。8000 r/min 離心30 min,去除不溶物。 最終高粱醇溶蛋白質(zhì)量濃度由Bradford 法測得,為10.0 mg/mL[18]。

帶窖泥味的濃香型白酒樣品。 國家級評酒師評出的帶有明顯窖泥味的濃香型酒樣。

1.1.2 實驗試劑

3-甲基吲哚、4-甲基苯酚標(biāo)準(zhǔn)品,阿拉丁試劑有限公司。 鄰二氯苯,百靈威試劑有限公司。 乙醇和氯化鈉,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。 超純水由GenPure UV-TOC Xcad plus 超純水儀制得。 實驗所用試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

全二維氣相色譜/氮化學(xué)發(fā)光檢測器(comprehensive two-dimensional gas chromatography-nitrogen chemiluminescence detector,GC ×GC-NCD)聯(lián)用儀,美國力可公司,具體配置如下:氣相色譜儀部分為Agilent 7890B 型,氮化學(xué)發(fā)光檢測器為Agilent 255型,四噴口液氮型調(diào)制器為Pegasus Ⅲ型；UV-3600型紫外可見光譜儀,日本Shimadzu 公司；DF-101S型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器,河南予華儀器有限責(zé)任公司；VORTEX2 型渦旋儀,德國IKA 公司；50/30 μm DVB/CAR/PDMS 萃取頭,美國Supelco 公司；固相微萃取手動進(jìn)樣器,美國Supelco 公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 濃香型白酒風(fēng)味輪廓分析法

測定添加高粱醇溶蛋白前后兩種濃香型白酒樣品風(fēng)味輪廓的變化。 向帶有窖泥異味的濃香型白酒樣品中加入高粱醇溶蛋白,使高粱醇溶蛋白的最終質(zhì)量濃度為30 mg/L。

感官品評實驗室溫度24 ～26 ℃,濕度33% ～36%。 感官品評小組由10 位來自中國輕工業(yè)釀酒分子工程重點實驗室的工作人員組成(4 位男士、6位女士),均有兩年以上感官分析的經(jīng)驗。 為了呈現(xiàn)最佳的香氣,使用郁金香形狀的白酒品評杯盛放樣品,每杯盛放25 mL 樣品。

品評小組成員對添加高粱醇溶蛋白前后兩種濃香型白酒樣品中以下8 種香氣屬性的強(qiáng)度進(jìn)行0 ～3 分的打分:果香、花香、甜香、酸味、醇香、烤香、青香、窖泥味。 由50 倍閾值濃度的乙酸乙酯(果香)、苯乙醇(花香)、γ-壬內(nèi)酯(甜香)、丁酸(酸味)、φ=52%的乙醇水溶液(醇香)、2,3,5-三甲基吡嗪(烤香)、癸醇(青香)和3-甲基吲哚(窖泥味)作為氣味參考標(biāo)準(zhǔn)溶液。 最終結(jié)果由Origin 2021 進(jìn)行可視化處理。

1.3.2 窖泥味物質(zhì)揮發(fā)度的測定

濃香型白酒中窖泥味主要是由3-甲基吲哚和4-甲基苯酚造成的。 以頂空固相微萃取法(headspace solidphase microextraction,HS-SPME)為揮發(fā)性物質(zhì)的前處理方法,測定高粱醇溶蛋白添加至白酒模擬體系(體積分?jǐn)?shù)為52%的乙醇水溶液)前后,3-甲基吲哚和4-甲基苯酚的揮發(fā)度變化。 其中,3-甲基吲哚的揮發(fā)度由HSSPME 結(jié)合GC×GC-NCD 測定,4-甲基苯酚的揮發(fā)度由HS-SPME 結(jié)合GC-MS 測得。

1.3.2.1 頂空固相微萃取法

HS-SPME 實驗設(shè)置對照組和實驗組,對照組為3-甲基吲哚或4-甲基苯酚的體積分?jǐn)?shù)為52%乙醇水溶液,實驗組在對照組的基礎(chǔ)上增加了質(zhì)量濃度200 mg/L高粱醇溶蛋白。 3-甲基吲哚和4-甲基苯酚的最終濃度由表1 所示。 3-甲基吲哚溶液中添加70 μL 100 mg/L 的正戊基吡嗪作為內(nèi)標(biāo),4-甲基苯酚溶液中添加10 μL 200 μg/L 的鄰二氯苯溶液作為內(nèi)標(biāo)。

HS-SPME 參數(shù)采用前人工作中的方法,并根據(jù)實際情況進(jìn)行了調(diào)整[13]。 萃取纖維型號為50/30 μm DVB/CAR/PDMS,平衡和萃取溫度均為35 ℃,平衡10 min,萃取45 min,攪拌速度為300 r/min。萃取完成后,萃取頭轉(zhuǎn)移到GC 進(jìn)樣口解析5 min。

采用標(biāo)準(zhǔn)品保留時間比對和譜庫質(zhì)譜比對進(jìn)行定性,采用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行定量。

1.3.2.2 全二維氣相色譜-氮化學(xué)發(fā)光檢測法

3-甲基吲哚的頂空濃度由HS-SPME 結(jié)合GC ×GC-NCD 測得。 全二維氣相色譜條件在前人基礎(chǔ)上進(jìn)行了調(diào)整[19]:配置第二柱溫箱,第一二維柱分別為DB-WAX (30 m ×0.25 mm ×0.25 μm)和DB-5(0.1 m×0.15 mm ×0.25 μm),兩根色譜柱以串聯(lián)方式連接；載氣為氦氣,純度為99.999%,流速為1 mL/min；進(jìn)樣口溫度為250 ℃,不分流。 主柱溫箱升溫程序:初始溫度50 ℃,保持2 min,以3 ℃/min升至120 ℃,以2 ℃/min 升至150 ℃,以5 ℃/min 升至230 ℃,保持10 min。 第二柱溫箱升溫程序高于主柱溫箱5 ℃,調(diào)制器溫度高于主柱溫箱15 ℃。 調(diào)制周期5 s；熱吹時間0.7 s,冷吹時間1.8 s。

氮化學(xué)發(fā)光檢測器條件:檢測器溫度為250 ℃,雙等離子體控制器溫度為900 ℃。 氫氣和氧氣流速分別為5、11 mL/min。

1.3.2.3 氣相色譜-質(zhì)譜檢測法

4-甲基苯酚的頂空濃度由HS-SPME 結(jié)合GCMS 測得。 色 譜 柱 為PerkinElmer DB-5 (30 m×0.25 mm×0.25 μm)。 升溫程序:40 ℃保持5 min,以10 ℃/min 升至240 ℃,保持5 min。 載氣為He氣,流速1.0 mL/min,進(jìn)樣口溫度250 ℃,壓力49.6 kPa,進(jìn)樣量1 μL,不分流進(jìn)樣。

電子轟擊(EI)離子源；電子能量70 eV；傳輸線溫度250 ℃；離子源溫度230 ℃；激活電壓1.9 V；質(zhì)量掃描范圍m/z35 ～500 u。

1.3.3 窖泥味物質(zhì)閾值的測定

感官品評實驗室溫度24 ～26 ℃,濕度33% ～36%。 感官品評小組由10 位來自中國輕工業(yè)釀酒分子工程重點實驗室的工作人員組成(4 位男士,6位女士),均有兩年以上感官分析的經(jīng)驗。 為了呈現(xiàn)最佳的香氣,使用郁金香形狀的白酒品評杯盛放樣品,每杯盛放25 mL。

高粱醇溶蛋白對3-甲基吲哚和4-甲基苯酚氣味閾值的影響由十杯法測得[20]。 閾值測定實驗平行進(jìn)行3 次,并根據(jù)以下順序進(jìn)行:1)3-甲基吲哚的閾值；2)加入200 mg/L 高粱醇溶蛋白的3-甲基吲哚的閾值；3)4-甲基苯酚的閾值；4)加入200 mg/L 高粱醇溶蛋白的4-甲基苯酚的閾值。 所有實驗采用體積分?jǐn)?shù)為52%的乙醇水溶液作為背景。

十杯法具體操作方法。 每組實驗由以下3 部分組成:已知空白、標(biāo)準(zhǔn)樣品、待測樣。 空白樣品為體積分?jǐn)?shù)為52%的乙醇水溶液,標(biāo)準(zhǔn)樣品為100 倍閾值的3-甲基吲哚、4-甲基苯酚溶液。 待測樣品由2個空白溶液和6 個不同濃度的3-甲基吲哚、4-甲基苯酚溶液組成,濃度以3 的倍數(shù)遞增。 感官品評小組成員對不同溶液的氣味進(jìn)行描述和打分,要求分辨出待測樣中與空白不同的樣品。 數(shù)據(jù)采用曲線擬合法處理,識別正確的人數(shù)達(dá)到總?cè)藬?shù)50%的質(zhì)量濃度為最終閾值。

1.3.4 高粱醇溶蛋白與窖泥味物質(zhì)絡(luò)合結(jié)構(gòu)及絡(luò)合熱力學(xué)模型的測定

1.3.4.1 絡(luò)合結(jié)構(gòu)的測定

采用紫外-可見分光光度法考察高粱醇溶蛋白與3-甲基吲哚、4-甲基苯酚的結(jié)合機(jī)理,對高粱醇溶蛋白-3-甲基吲哚、4-甲基苯酚混合溶液的紫光-可見光譜進(jìn)行了全波長掃描。 其中高粱醇溶蛋白質(zhì)量濃度為200 mg/L,3-甲基吲哚和4-甲基苯酚系列梯度濃度為25、50、75、100 mg/L,溶劑為體積分?jǐn)?shù)為52%的乙醇水溶液。 采集波長范圍為220 ～800 nm,采集速度為100 nm/min。

1.3.4.2 絡(luò)合熱力學(xué)模型的測定

1.3.4.1 節(jié)中的紫外-可見光光譜圖分別在25、45、65 ℃重復(fù)測定3 次,結(jié)合常數(shù)和熱力學(xué)參數(shù)通過Lineweave-Burk 雙倒數(shù)方程和Van't Hoff 方程得到[21]。

式(1)中,A和A0分別為高粱醇溶蛋白在添加3-甲基吲哚、4-甲基苯酚絡(luò)合前后的最大吸收值,c為3-甲基吲哚、4-甲基苯酚的摩爾濃度(mol/L),K為高粱醇溶蛋白和3-甲基吲哚、4-甲基苯酚絡(luò)合前后的結(jié)合常數(shù)。

式(2)與式(3)中,ΔG,ΔH和ΔS分別為吉布斯自由能變、焓變和熵變；K為結(jié)合常數(shù)；R為理想氣體常數(shù)[8.314 J/(mol·K)]。

1.3.5 高粱醇溶蛋白與窖泥味物質(zhì)的分子對接模型實驗方法

高粱醇溶蛋白和3-甲基吲哚、4-甲基苯酚的對接構(gòu)象和親和能由分子對接軟件AutoDock Vina(v 1.1.2)計算得到[22]。 蛋白-配體間的分子間作用力由Ligplot (v 1.4.5)分析得到。 由于本研究中所用的高粱醇溶蛋白由α-和β-高粱醇溶蛋白組成,因此α-和β-高粱醇溶蛋白的PDB 模型被用作對接受體。 受體的PDB 模型采用前人文獻(xiàn)結(jié)果[23],3-甲基吲哚和4-甲基苯酚的SDF 文件從PubChem 數(shù)據(jù)庫(https:∥pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)中得到,并由PyMOL 轉(zhuǎn)為PDB 格式。

受體和配體文件在AutoDock (v 1.5.6)中加氫,計算Gasteiger 電荷,選擇旋轉(zhuǎn)鍵后導(dǎo)出為PDBQT(Protein Data Bank, Partial Charge & Atom Type)文件。 采用盲對接篩選所有可能的對接位點,Exhaustiveness 設(shè)置為200,產(chǎn)生20 個對接構(gòu)象。 最后,根據(jù)親和能最低原則和空間位置吻合程度篩選出最優(yōu)的對接構(gòu)象。 對接構(gòu)象和分子間相互作用力的可視化由PyMOL 和Ligplot (v 1.4.5)繪制。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)重復(fù)測量3 次,計算其平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。 采用SPSS 22 軟件進(jìn)行方差分析,應(yīng)用Origin 2021軟件繪圖。 采用配對樣本t檢驗來考察高粱醇溶蛋白對3-甲基吲哚、4-甲基苯酚揮發(fā)性和閾值的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 高粱醇溶蛋白對濃香型白酒風(fēng)味輪廓的影響

高粱醇溶蛋白對濃香型白酒風(fēng)味輪廓的影響見圖1。 為驗證高粱醇溶蛋白對窖泥味的影響,選擇了窖泥味特征較明顯的濃香型酒樣進(jìn)行香氣輪廓實驗。 在窖泥味濃香型白酒中添加30 mg/L 高粱醇溶蛋白后與原酒樣進(jìn)行對比。 實驗結(jié)果顯示,原始濃香型白酒的香氣輪廓評分為窖泥味(2.50 分)、糠味(1.97 分)、醇味(1.80 分)、酸味(1.50 分)、果香(1.48 分)、甜香(1.45 分)、烤香(1.23 分)、花香(1.05 分)和青香(0.87 分)。 在加入30 mg/L 高粱醇溶蛋白后,窖泥味顯著降低(1.98 分)(P＜0.001),糠味(1.75 分)、醇味(1.68 分)、甜香(1.33 分)、烤香(1.1 分)也被減弱,但趨勢不明顯(P＞0.05)。 酸味(1.57 分)、果香(1.55 分)、花香(1.15 分)和青香(1.15 分)微微增強(qiáng),同樣趨勢不明顯(P＞0.05)。從整體風(fēng)味質(zhì)量上來說,因為窖泥味的顯著減弱,帶有窖泥味的濃香型白酒樣品整體的風(fēng)味質(zhì)量得到了提高。 高粱醇溶蛋白的添加量為30 mg/L,在此濃度時,窖泥味得到了明顯的抑制,但不影響酒樣的整體風(fēng)味輪廓。 當(dāng)濃度繼續(xù)增大,酒樣的整體風(fēng)味輪廓出現(xiàn)了失衡,使得酒樣失去了原有的風(fēng)格。

圖1 高粱醇溶蛋白對窖泥味濃香型酒樣香氣輪廓的影響Fig.1 Effects of kafirin on aroma profile of strong flavor Baijiu sample with pit mud-like odor

2.2 高粱醇溶蛋白對窖泥味物質(zhì)揮發(fā)度的影響

從高粱醇溶蛋白對濃香型白酒風(fēng)味輪廓的影響可以推斷出,高粱醇溶蛋白對窖泥味風(fēng)味化合物(如3-甲基吲哚和4-甲基苯酚)的揮發(fā)度有影響。因此,采用HS-SPME 結(jié)合GC ×GC-NCD 和GC-MS對加入高粱醇溶蛋白前后的3-甲基吲哚和4-甲基苯酚溶液的頂空氣體濃度進(jìn)行測定。 為了消除其他化合物的影響,實驗在體積分?jǐn)?shù)為52%的乙醇水溶液和3-甲基吲哚、4-甲基苯酚組成的模擬體系中進(jìn)行。 3-甲基吲哚和4-甲基苯酚的原始濃度分別為963.07 μg/L 和63.09 μg/L。 添加200 mg/L 高粱醇溶蛋白后,3-甲基吲哚的頂空濃度減少了38.99%(P＜0.05),而4-甲基苯酚的頂空濃度減少了46.39%(P＜0.01)(見表1)。 這種蛋白質(zhì)對氣味化合物揮發(fā)度的抑制作用在以前的研究中已經(jīng)被多次證明,其原理通常與蛋白質(zhì)通過分子間作用力束縛了氣味小分子的揮發(fā)有關(guān)[24-25]。

表1 高粱醇溶蛋白對模擬白酒體系中3-甲基吲哚和4-甲基苯酚揮發(fā)性的影響Tab.1 Effect of kafirin on volatility of 3-methylindole and p-cresol in simulated Baijiu

2.3 高粱醇溶蛋白對窖泥味物質(zhì)閾值的影響

閾值是評估氣味化合物在混合體系中呈味能力的重要參數(shù)之一,通常來說閾值低的化合物有更強(qiáng)的呈味能力[26]。 因此,采用十杯法對加入高粱醇溶蛋白前后3-甲基吲哚和4-甲基苯酚52%乙醇溶液的閾值進(jìn)行了測定。 純品高粱醇溶蛋白本身無味,本研究中的用到的高粱醇溶蛋白純度達(dá)到了98.36%,因此其本身的氣味不會影響閾值的測定。 但在預(yù)實驗中發(fā)現(xiàn),高粱醇溶蛋白添加量低于1 mg/L 時,3-甲基吲哚和4-甲基苯酚的揮發(fā)度會有所下降,但對其閾值和香氣輪廓都不會產(chǎn)生很大的影響。 在高粱醇溶蛋白添加量超過1000 mg/L 時,溶液的長期穩(wěn)定性會變?nèi)?；但?000 mg/L以下不容易產(chǎn)生渾濁和沉淀,并且對異味有顯著影響。 因此,高粱醇溶蛋白添加量在1 ～1000 mg/L 根據(jù)異味強(qiáng)度和異味物質(zhì)揮發(fā)度的調(diào)整比較合適。 在閾值實驗中,高粱醇溶蛋白添加量為200 mg/L。 品評結(jié)果通過曲線擬合法進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,閾值最終計算結(jié)果見圖2、表2。 3-甲基吲哚和4-甲基苯酚在模擬白酒中的氣味閾值分別為0.33 μg/L 和0.18 μg/L。 而添加200 mg/L 高粱醇溶蛋白后,二者氣味閾值分別提高到了1.50 μg/L(P＜0.01)和0.31 μg/L(P＜0.05),分別增加了3.59 倍和0.73 倍。 因此,高粱醇溶蛋白可以顯著提高濃香型白酒中的窖泥味物質(zhì)的氣味閾值,從而達(dá)到減弱其呈味能力的效果。

圖2 加入高粱醇溶蛋白前后模擬白酒中3-甲基吲哚與4-甲基苯酚的閾值擬合曲線Fig.2 Fitting curves of threshold of 3-methylindol and p-cresol with and without kafirin in simulated Baijiu

表2 高粱醇溶蛋白對模擬白酒中3-甲基吲哚和4-甲基苯酚氣味閾值的影響Tab.2 Influence of kafirin on odor thresholds of 3-methylindole and p-cresol in simulated Baijiu

2.4 高粱醇溶蛋白與窖泥味物質(zhì)的絡(luò)合結(jié)構(gòu)及絡(luò)合熱力學(xué)模型分析

為了驗證高粱醇溶蛋白結(jié)合窖泥臭味物質(zhì)的能力,使用紫外-可見分光光度法對高粱醇溶蛋白結(jié)合3-甲基吲哚、4-甲基苯酚前后在280 nm 附近的紫外吸收峰進(jìn)行了研究,見圖3。

圖3 高粱醇溶蛋白與3-甲基吲哚和4-甲基苯酚絡(luò)合體系的紫外-可見光光譜和熱力學(xué)參數(shù)分析Fig.3 UV-Vis spectra and thermodynamic parameters analysis of mixture of kafirin-3-methylindol and p-cresol

2.4.1 絡(luò)合結(jié)構(gòu)

圖3(a)和3(b)為高粱醇溶蛋白、3-甲基吲哚、4-甲基苯酚和兩者混合體系的紫外-可見光光譜。由于含有酪氨酸和苯丙氨酸,高粱醇溶蛋白在279 nm 處有明顯的吸收峰[27]。 3-甲基吲哚和4-甲基苯酚的最大吸收波長為282 nm 和279 nm,即在加入3-甲基吲哚后,高粱醇溶蛋白的最大吸收峰出現(xiàn)紅移,而加入4-甲基苯酚對高粱醇溶蛋白的最大吸收峰影響不大。 蛋白質(zhì)的最大吸收峰位置改變可能由產(chǎn)生紫外吸收的酪氨酸和苯丙氨酸微環(huán)境的變化引起,也說明了3-甲基吲哚造成了高粱醇溶蛋白的結(jié)構(gòu)變化,這種變化可能由兩者之間結(jié)合形成了復(fù)合物有關(guān)[28]。

加入3-甲基吲哚和4-甲基苯酚后,對高粱醇溶蛋白的紫外吸收強(qiáng)度也造成了影響,并且這種影響不符合Lambert-Beer 定律。 在282 nm 處,高粱醇溶蛋白的紫外吸收強(qiáng)度為0.223,3-甲基吲哚的紫外吸收強(qiáng)度為1.912,而高粱醇溶蛋白和3-甲基吲哚混合體系的紫外吸收強(qiáng)度為3.173,遠(yuǎn)大于兩者單獨存在時的紫外吸收強(qiáng)度之和。 同樣的,在279 nm處,高粱醇溶蛋白、4-甲基苯酚、高粱醇溶蛋白和4-甲基苯酚的混合體系紫外吸收強(qiáng)度分別為0.226、1.142 和1.205。 當(dāng)混合物紫外吸收強(qiáng)度與單質(zhì)紫外吸收強(qiáng)度之和不一致時,表示混合體系偏離了Lambert-Beer 定律的紫外吸收強(qiáng)度,這就預(yù)示混合體系中有絡(luò)合物的形成[28]。 本研究發(fā)現(xiàn),高粱醇溶蛋白與4-甲基苯酚混合體系的紫外吸收強(qiáng)度與兩種單質(zhì)紫外吸收強(qiáng)度之和不一致,即偏離了Lambert-Beer 定律的紫外吸收強(qiáng)度,可以推知體系中生成了高粱醇溶蛋白-4-甲基苯酚絡(luò)合物。

2.4.2 絡(luò)合熱力學(xué)模型

圖3(c)和3(d)為高粱醇溶蛋白和窖泥臭味物質(zhì)混合體系的紫外-可見光光譜圖。 隨著3-甲基吲哚、4-甲基苯酚質(zhì)量濃度的增加(25 ～100 mg/L),混合體系的紫外吸收強(qiáng)度逐漸增加。 高粱醇溶蛋白與3-甲基吲哚和4-甲基苯酚的結(jié)合常數(shù)由Lineweave-Burk 方程的截距與斜率之比得到,見圖3(e)和3(f)。高粱醇溶蛋白與3-甲基吲哚和4-甲基苯酚絡(luò)合的熱力學(xué)方程見表3。 高粱醇溶蛋白和3-甲基吲哚的結(jié)合常數(shù)隨著溫度增加而降低,而與4-甲基苯酚的結(jié)合常數(shù)隨溫度增加而增加。 當(dāng)結(jié)合常數(shù)隨溫度增加而增加時,化合物之間的相互作用為吸熱反應(yīng),反之則為放熱反應(yīng)[29],因此,高粱醇溶蛋白與3-甲基吲哚之間的相互作用為放熱反應(yīng),而與4-甲基苯酚之間的相互作用為吸熱反應(yīng)。 反應(yīng)的ΔH,ΔG和ΔS由Van't Hoff 方程計算得到,結(jié)果見表3。 高粱醇溶蛋白與3-甲基吲哚、4-甲基苯酚的ΔG均為負(fù)值(25 ℃時為-13.46 kJ/mol 和-14.42 kJ/mol,45 ℃時為-12.77 kJ/mol 和-15.83 kJ/mol,65 ℃時為-12.08 和-17.24 kJ/mol),說明高粱醇溶蛋白對窖泥臭味氣味物質(zhì)的結(jié)合在3 個不同溫度下均為自發(fā)進(jìn)行[30]。 另外,高粱醇溶蛋白與3-甲基吲哚相互作用的ΔH值為負(fù)值( -23.75 kJ/mol),表明兩者的反應(yīng)為焓變驅(qū)動。 而高粱醇溶蛋白與4-甲基苯酚相互作用的ΔH為正值( -6.55 kJ/mol),表明兩者的反應(yīng)為吉布斯自由能驅(qū)動[31]。

表3 高粱醇溶蛋白對3-甲基吲哚和4-甲基苯酚絡(luò)合的熱力學(xué)參數(shù)Tab.3 Thermodynamic parameters of binding process of kafirin to 3-methylindole and p-cresol

2.5 高粱醇溶蛋白與窖泥味物質(zhì)分子對接親和能、作用力和對接位點分析

采用 Autodock Vina ( v 1.1.2) 和 Ligplot(v 1.4.5)對高粱醇溶蛋白與窖泥味氣味物質(zhì)分子之間的親和能、分子間作用力和對接位點進(jìn)行分析[32]。 本研究使用的高粱醇溶蛋白含有α-和β-高粱醇溶蛋白,因此這兩種蛋白質(zhì)被用來當(dāng)做受體。利用分子對接軟件Autodock Vina 在可能的對接構(gòu)象中篩選出親和能最低、空間匹配程度最高的一個作為最優(yōu)對接構(gòu)象,最終結(jié)果見圖4。 高粱醇溶蛋白和窖泥臭味異臭味物質(zhì)之間的親和能較高,顯示出較強(qiáng)的結(jié)合傾向。 其中,α-高粱醇溶蛋白、β-高粱醇溶蛋白與3-甲基吲哚的親和能( -26.79 kJ/mol和-23.02 kJ/mol)微強(qiáng)于其與4-甲基苯酚的親和能( -21.77 kJ/mol 和-20.09 kJ/mol)(見圖5)。作為配體的3-甲基吲哚和4-甲基苯酚通過氫鍵和疏水作用被包裹在高粱醇溶蛋白的疏水口袋中。 疏水口袋為蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)表面的凹陷或孔洞結(jié)構(gòu),可以為配體提供疏水環(huán)境或者氫鍵對接位點[32]。由于α-高粱醇溶蛋白為在高粱醇溶蛋白中含量更多(77%),因此其對配體的影響占有主要地位。 3-甲基吲哚與α-高粱醇溶蛋白通過疏水作用相互吸引,參與的氨基酸殘基包括Thr1、Leu105、Phe101、Val251、Phe267、Phe4 和Ile3；而4-甲基苯酚與α-高粱醇溶蛋白主要通過氫鍵連接,鍵長為3.20 ?。 而在與β-高粱醇溶蛋白的相互作用中,3-甲基吲哚主要表現(xiàn)為氫鍵和疏水作用,氫鍵鍵長為3.00 ?,而4-甲基苯酚表現(xiàn)為疏水作用,參與的氨基酸殘基包括Gln102、Gly42、Thr39、Ser99、Met38、Ala103 和Gln102。

圖4 高粱醇溶蛋白與3-甲基吲哚和4-甲基苯酚的對接構(gòu)象和對接位點Fig.4 Docking conformations and binding sites of kafirin with 3-methylindol and kafirin with p-cresol

圖5 高粱醇溶蛋白與3-甲基吲哚和4-甲基苯酚相互作用的親和能Fig.5 Affinities of interactions of kafirin with 3-methylindol and kafirin with p-cresol

3 結(jié)論

高粱醇溶蛋白對濃香型白酒風(fēng)味輪廓中的窖泥味有消減作用,這種消減作用主要通過高粱醇溶蛋白對窖泥味物質(zhì)分子的結(jié)合作用產(chǎn)生。 香氣輪廓實驗表明,高粱醇溶蛋白的加入可顯著降低濃香型白酒中的窖泥味,而對其他風(fēng)味無顯著影響。 采用頂空固相微萃取法分析發(fā)現(xiàn),高粱醇溶蛋白可使模擬酒樣中的3-甲基吲哚和4-甲基苯酚的揮發(fā)度分別降低38.99%和46.39%。 且當(dāng)添加200 mg/L 高粱醇溶蛋白后,兩者閾值分別為添加高粱醇溶蛋白前的4.59 和1.73 倍。 分別于25、45、65 ℃下進(jìn)行紫外-可見分光光度法分析,發(fā)現(xiàn)高粱醇溶蛋白與3-甲基吲哚、4-甲基苯酚可自發(fā)絡(luò)合形成復(fù)合物。 分子對接模型實驗表明,高粱醇溶蛋白分子表面的疏水口袋通過空間匹配和分子間作用力將3-甲基吲哚和4-甲基苯酚包裹或連接在內(nèi),主要的分子間相互作用力為氫鍵和疏水作用。 前人對非揮發(fā)性成分與食品體系中氣味化合物的作用主要集中在研究氣味化合物頂空濃度變化和熱力學(xué)參數(shù)計算上,本研究在前人工作的基礎(chǔ)上首次考察了高粱醇溶蛋白對窖泥味物質(zhì)氣味閾值的影響,并采用分子對接的手段考察了高粱醇溶蛋白與窖泥味物質(zhì)的親和能、對接位點和分子間相互作用力類型。 另外,本研究將從白酒糟中的高粱醇溶蛋白提取出來再應(yīng)用到白酒中以消除異味,這也為很多食品工藝副產(chǎn)物的處理提供了新的思路。但高粱醇溶蛋白在白酒體系中的穩(wěn)定性和高粱醇溶蛋白對白酒體系中的其它揮發(fā)性成分的選擇性吸附未來需要進(jìn)一步考察。 希望本研究結(jié)果可為降低濃香型白酒中的異臭味提供解決方案,為食品中異臭味成分的消減研究提供新思路。