何藝賓，郝 華

(1.廈門海洋職業(yè)技術(shù)學(xué)院海洋生物學(xué)院，福建 廈門 361100；2.廈門大學(xué)海洋生物制備技術(shù)國(guó)家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室，福建 廈門 361104)

江蘺屬(Gracilaria)海藻是一種重要的大型海洋經(jīng)濟(jì)藻類，其藻體富含藻膠，是提取工業(yè)用瓊膠的主要原料[1]。細(xì)基江蘺繁枝變種(Gracilariatenuistipitatavar.liui Zhang et Xia)俗稱細(xì)江蘺(Gracilariacrinale)[2]，以其提取的瓊膠經(jīng)濟(jì)價(jià)值大，而被廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)和醫(yī)藥衛(wèi)生等領(lǐng)域[3]。此外，細(xì)基江蘺繁枝變種是鮑魚(yú)的優(yōu)質(zhì)餌料[4]，在福建東山島許多鮑魚(yú)養(yǎng)殖場(chǎng)曾用這一品種喂養(yǎng)鮑魚(yú)，引發(fā)市場(chǎng)供不應(yīng)求，價(jià)格一度走俏，養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)效益顯著。然而在細(xì)江蘺繁枝變種人工養(yǎng)殖過(guò)程中容易出現(xiàn)藻種老化、藻體染病和不耐高溫等問(wèn)題[5]，因此對(duì)細(xì)基江蘺繁枝變種進(jìn)行品種改良勢(shì)在必行。

原生質(zhì)體作為受體材料，已被廣泛應(yīng)用于植物基因功能研究和雜交育種等[6-7]。目前研究發(fā)現(xiàn)紅藻的原生質(zhì)體能夠分化再生成新的藻體。Lafontaine N等[8]從帶形蜈蚣藻(Grateloupiaturuturu)分離獲得了原生質(zhì)體，并通過(guò)培養(yǎng)獲得了再生藻體；Yeong H Y等[9]從張氏江蘺(Gracilariachangii)中分離獲得了原生質(zhì)體并通過(guò)培養(yǎng)也獲得了再生江蘺。原生質(zhì)體作為轉(zhuǎn)基因受體材料，其轉(zhuǎn)化率與原生質(zhì)體制備的成功率和質(zhì)量的程度密切相關(guān)[10]。目前關(guān)于細(xì)基江蘺繁枝變種原生質(zhì)體制備條件優(yōu)化的研究尚未見(jiàn)報(bào)道，本研究擬從酶解液組分、酶解溫度和酶解時(shí)間等因素對(duì)細(xì)基江蘺繁枝變種原生質(zhì)體的制備條件進(jìn)行優(yōu)化，旨在分離獲得產(chǎn)量高、活性好的原生質(zhì)體，為該品種的遺傳改良提供一個(gè)有效的技術(shù)途徑。

1 材料與方法

1.1 材料

細(xì)基江蘺繁枝變種：從福建東山島杏陳鎮(zhèn)(23.751 580°N、117.396 210°E)采集。

主要實(shí)驗(yàn)試劑：纖維素酶R-10、離析酶R-10、果膠酶Y-23，均購(gòu)自日本Yakult公司；瓊脂糖酶(Agarase)、FDA染料，均購(gòu)自Sigma公司。

1.2 藻種培養(yǎng)

細(xì)基江蘺繁枝變種從福建東山島采集回實(shí)驗(yàn)室后，于無(wú)菌海水中用軟毛刷清洗藻體[11]，去除藻體表面的沙泥等雜物，用鹽度為25的無(wú)菌海水(含200 mg/L卡那霉素)再清洗3次，然后在25℃、120 μmoL photons·m-2·s-1光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1～2 d。

1.3 方法

1.3.1 藻段選擇與處理

選取新鮮、幼嫩且生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)基江蘺繁枝變種，摘取位于頂端的藻段，將其切成2～3 cm長(zhǎng)的藻段并于含1.5%碘化鉀(KI)的無(wú)菌海水中浸泡10 min后，用無(wú)菌海水沖洗2次，再將藻段切成1～2 mm2小藻塊，用無(wú)菌海水沖洗2次，備用。

1.3.2 不同酶解液組分對(duì)原生質(zhì)體得率的影響

1)酶解液配制

酶解液組分E1：鹽度為25的無(wú)菌海水中加入10 mmol/L CaCl2、0.8 mol/L D-甘露醇、2%纖維素酶R-10、1%離析酶R-10、10 U/mL 瓊酯糖酶，pH 6.3，充分溶解后，12 000 r/min、4℃離心 5 min，將上清液轉(zhuǎn)移到新的50 mL離心管中，置于冰上備用。

酶解液組分E2：鹽度為25的無(wú)菌海水中加入10 mmol/L CaCl2、0.8 mol/L D-甘露醇、2%纖維素酶R-10、1%離析酶R-10、0.5%果膠酶Y-23、10 U/mL 瓊酯糖酶，pH 6.3，充分溶解后，12 000 r/min、4℃離心 5 min，將上清液轉(zhuǎn)移到新的50 mL離心管中，置于冰上備用。

2)原生質(zhì)體制備

取0.2 g藻塊(1～2 mm2)分別加入到上述兩種酶解液(10 mL/g)中，分別置于25、28℃恒溫?fù)u床低速搖動(dòng)(80 r/min)，進(jìn)行黑暗酶解；分別離心收集酶解4、6、8 h的原生質(zhì)體，具體步驟如下：先用40 μm一次性細(xì)胞篩濾去未被酶解的殘留物，往濾出液中加入等體積的提取緩沖液(500 mmol/L NaCl、5 mmol/L KCl、5 mmol/L CaCl2、20 mmol/L Hepes、300 mmol/L 甘露糖醇、300 mmol/L 山梨糖醇，調(diào)pH值至7.2，121℃滅菌20 min)，靜置10 min，800 r/min離心5 min，棄90%上清液，用1 mL提取緩沖液重懸，800 r/min離心5 min，棄除殘余的酶液，再用500 μL提取緩沖液重懸，取10 μL重懸液于血球計(jì)數(shù)板中計(jì)數(shù)，計(jì)算每克組織的原生質(zhì)體得率，確定最佳酶解液組分。

1.3.3 酶解溫度對(duì)原生質(zhì)體得率的影響

取0.2 g藻塊(1～2 mm2)分別加入2 mL酶解液組分E2(提取效果比酶解液組分E1好)，分別置于22、25、28℃恒溫?fù)u床低速搖動(dòng)(80 r/min)，進(jìn)行黑暗酶解；分別離心收集酶解4、6、8 h的原生質(zhì)體，具體步驟同方法1.3.2中“原生質(zhì)體制備”，分別取10 μL重懸液于血球計(jì)數(shù)板中計(jì)數(shù)，計(jì)算每克組織的原生質(zhì)體得率，確定最佳的酶解溫度。

1.3.4 酶解時(shí)間對(duì)原生質(zhì)體得率的影響

取0.2 g藻塊(1～2 mm2)分別加入2 mL酶解液組分E2，置于28℃(提取效果最佳)恒溫?fù)u床低速搖動(dòng)(80 r/min)，進(jìn)行黑暗酶解；分別離心收集酶解4、6、7、8、10 h的原生質(zhì)體，具體步驟同方法1.3.2中“原生質(zhì)體制備”，分別取10 μL重懸液于血球計(jì)數(shù)板中計(jì)數(shù)，計(jì)算每克組織的原生質(zhì)體得率，確定最佳的酶解時(shí)間。

1.3.5 原生質(zhì)體活性檢測(cè)

取100 μL新鮮分離獲得的原生體加入1 μL 二乙酸熒光素(Fluorescein diacetate，F(xiàn)DA)溶液(5 mg/mL)，室溫黑暗放置10 min，800 r/min離心5 min，棄上清液，用100 μL新鮮的提取緩沖液重懸，于熒光顯微鏡(Axio Lab.A1，ZEISS，德國(guó))中觀察FDA綠色熒光，判斷分離獲得的原生質(zhì)體活力。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用GraphPad Prism 5軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理分析，利用column功能生成各組數(shù)據(jù)的柱狀圖；運(yùn)用SPSS軟件分析比較不同處理組間實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的顯著性差異并將分析結(jié)果添加到柱狀圖上。

2 結(jié)果

2.1 不同酶解液組分對(duì)原生質(zhì)體得率的影響

酶解液組分E1和酶解液組分E2分別于25、28℃條件下的原生質(zhì)體提取效果如表1和圖1所示。在25、28℃條件下，酶解液組分E1和酶解液組分E2的原生質(zhì)體得率隨著酶解時(shí)間的增加而增加，酶解8 h的原生質(zhì)體得率最高；28℃條件下酶解4、6、8 h的原生質(zhì)體得率均高于25℃條件下的得率。江蘺細(xì)胞壁富含果膠，在酶解液組分E2中添加0.5%果膠酶Y-23，其在25、28℃條件下酶解8 h的原生質(zhì)體得率均高于酶解液組分E1，且差異顯著(P<0.05)，因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)中使用酶解液組分E2進(jìn)行原生質(zhì)體的提取。

表1 不同酶解液組分在不同時(shí)間和溫度條件下的原生質(zhì)體得率

注：圖1為酶解液組分E1和酶解液組分E2分別在25、28℃條件下酶解8 h的原生質(zhì)體得率差異顯著性分析。1.酶解液組分E1在25℃條件下酶解8 h的原生質(zhì)體得率；2.酶解液組分E2分在25℃條件下酶解8 h的原生質(zhì)體得率；3.酶解液組分E1在28℃條件下酶解8 h的原生質(zhì)體得率；4.酶解液組分E2分在28℃條件下酶解8 h的原生質(zhì)體得率。*表示P<0.05。

2.2 酶解溫度對(duì)原生質(zhì)體得率的影響

分別離心收集22、25、28℃條件下酶解4、6、8 h的原生質(zhì)體，計(jì)算得出原生質(zhì)體得率，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示。22℃條件下酶解4、6、8 h的原生質(zhì)體得率(×105protoplasts/g FW)分別為(2.25±0.21)、(6.84±0.12)、(8.16±0.18)；25℃條件下酶解4、6、8 h的原生質(zhì)體得率(×105protoplasts/g FW)分別為(2.45±0.12)、(7.76±0.23)、(9.35± 0.11)；28℃條件下酶解4、6、8 h的原生質(zhì)體得率(×105protoplasts/g FW)分別為(2.58±0.22)、(8.13±0.12)、(10.67±0.21)。

研究發(fā)現(xiàn)，28℃條件下酶解4、6、8 h的原生質(zhì)體得率均高于22℃和25℃條件下的原生質(zhì)體得率。當(dāng)酶解時(shí)間為4 h時(shí)，22、25、28℃條件下的原生質(zhì)體得率差異不明顯；隨著酶解時(shí)間的增加，原生質(zhì)體得率升高；當(dāng)酶解時(shí)間為8 h時(shí)，28℃條件下的原生質(zhì)體得率為(10.67±0.21)×105protoplasts/g FW，高于22℃和25℃條件下的原生質(zhì)體得率。28℃條件下酶解6 h的原生質(zhì)體得率與22℃條件下酶解8 h的原生質(zhì)體得率相當(dāng)。

2.3 酶解時(shí)間對(duì)原生質(zhì)體得率的影響

分別離心收集28℃條件下酶解4、6、7、8、10 h的原生質(zhì)體，計(jì)算得出的原生質(zhì)體得率如圖3所示。酶解4、6、7、8、10 h的原生質(zhì)體得率(×105protoplasts/g FW)分別為(2.67±0.03)、(8.17±0.11)、(10.67±0.26)、(11±0.22)、(9.17± 0.31)。酶解4～8 h內(nèi)，隨著酶解時(shí)間的增加，原生質(zhì)體得率逐漸增加，然而酶解時(shí)間超過(guò)8 h時(shí)，由于原生質(zhì)體的相互擠壓破膜，導(dǎo)致原生質(zhì)體得率反而減少，故最佳酶解時(shí)間為8 h。

2.4 原生質(zhì)體活性檢測(cè)結(jié)果

FDA進(jìn)入活的細(xì)胞內(nèi)會(huì)被胞內(nèi)脂酶分解，生成有極性、能產(chǎn)生綠色熒光的物質(zhì)——熒光素，該物質(zhì)不能自由透過(guò)活的細(xì)胞膜而積累在細(xì)胞膜內(nèi)，而且只有體膜完整、具有活力的原生質(zhì)體才能在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)綠色熒光。剛分離獲得的原生質(zhì)體經(jīng)FDA染色后，在熒光顯微鏡下能夠觀察到較亮的綠色熒光，表明提取的原生質(zhì)體膜完整、活力較好(圖4)。

注：a為白色光下觀察結(jié)果；b為488 nm激發(fā)光下觀察結(jié)果。

3 討論

3.1 實(shí)驗(yàn)材料對(duì)原生質(zhì)體得率的影響

細(xì)基江蘺繁枝變種的生長(zhǎng)狀態(tài)、細(xì)胞壁厚度等因素都會(huì)影響原生質(zhì)體的得率。Yeong H Y等[9]認(rèn)為江蘺的生長(zhǎng)狀態(tài)、年齡、生長(zhǎng)速度、實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)的時(shí)間和生長(zhǎng)季節(jié)都能影響江蘺原生質(zhì)體的質(zhì)量和產(chǎn)量。Huddy S M等[12]認(rèn)為較嫩的藻段因細(xì)胞壁較薄，從中可提取的原生質(zhì)體質(zhì)量較好，產(chǎn)量較高。本研究選用位于各分支藻體頂端最嫩的新生藻段并用于原生質(zhì)提取，獲得的原生質(zhì)體活力最好，產(chǎn)量最高；在細(xì)江蘺生長(zhǎng)的季節(jié)里，選用3—5月的藻體用于原生質(zhì)體提取，原生質(zhì)體的活力和產(chǎn)量均高于其他月份。這可能與江蘺進(jìn)入春季后開(kāi)始生長(zhǎng)，頂端新生藻段的細(xì)胞壁較薄、生長(zhǎng)狀態(tài)良好有關(guān)。

3.2 酶解條件對(duì)原生質(zhì)體得率的影響

Huddy S M等[12]報(bào)道Gracilariadura和Gracilariaverrucosa的最佳酶解條件為25℃、酶解4～6 h。Yeong H Y等[9]獲得Gracilariachangii的最佳酶解條件為28℃、酶解3 h。本研究得出的細(xì)基江蘺繁枝變種的最佳酶解條件為28℃、酶解7～8 h。由此可見(jiàn)，從不同的江蘺品種中，提取原生質(zhì)體的最佳酶解溫度和酶解時(shí)間不同，這可能與不同江蘺品種的細(xì)胞壁的組成成分不同有關(guān)。果膠物質(zhì)是植物細(xì)胞壁成分之一，存在于相鄰細(xì)胞壁間的胞間層中，起著將細(xì)胞粘在一起的作用，酶解液中添加0.5% 果膠酶Y-23可顯著提高細(xì)基江蘺繁枝變種原生質(zhì)體得率。此外，細(xì)基江蘺繁枝變種富含瓊脂，用于原生質(zhì)體制備的瓊脂糖酶的質(zhì)量也是影響原生質(zhì)體得率的關(guān)鍵因素之一。

4 結(jié)論

研究發(fā)現(xiàn)細(xì)基江蘺繁枝變種原生質(zhì)體制備的最佳酶解條件為：1)酶解液組分：鹽度為25的滅菌天然海水中加入10 mmol/L CaCl2、0.8 mol/L D-甘露醇、2%纖維素酶R-10、1%離析酶R-10、0.5%果膠酶Y-23、10 U/mL 瓊脂糖酶，pH 6.3；2)酶解條件：28℃、80 r/min、黑暗酶解8 h。本研究將為后續(xù)以原生質(zhì)體作為受體材料的江蘺品種的遺傳改良提供一個(gè)有效的技術(shù)途徑。