姜 珊， 劉洪濤, 田文華， 李文燕

(1.河北師范大學 化學與材料科學學院，河北省有機功能分子重點實驗室,河北 石家莊 050024;2.河北省人民醫(yī)院 藥學部，河北 石家莊 050051)

Vonafexor(EYP001)是非膽酸類法尼醇X受體選擇性激動劑，法尼醇X受體(famesod X receptor，FXR)是核受體超家族中的一員[1].FXR可以調控膽汁酸、脂質和糖類的代謝，影響膽淤積、糖尿病、高血脂、動脈粥樣硬化和肥胖癥等病理過程[2]，對腎上腺、腸、腎和肝臟也有重要影響[3].有研究發(fā)現，FXR與乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)的復制有關.HBV感染是全球性的健康問題，中國的境況更為嚴峻，現有臨床藥物難以徹底治愈慢性乙肝.共價閉合環(huán)狀DNA(covalently closed circular DNA，cccDNA)是HBV感染初期能最先檢測到的復制中間體，也是嗜肝DNA病毒、病毒基因和前基因組RNA的合成模板[4].在HBV的復制過程中[5]，cccDNA起到了非常關鍵的作用，它是病毒復制的中介，在宿主肝細胞核內以微染色體的形式存在，半衰期可持續(xù)數十年，目前的治療手段均難以將其徹底清除，導致慢性乙肝無法徹底治愈[6-7].因此，只有直接作用于共價閉合環(huán)狀DNA、抑制它的形成，轉錄或直接封閉和降解cccDNA才能徹底清除HBV[8].目前，在進入臨床的新型抗HBV的藥物中，只有FXR激動劑可以有效地抑制或清除共價閉合環(huán)狀DNA[9-10].非酒精性脂肪性肝炎[11-13](national association of specimeen hunters，NASH)是一種嚴重的非酒精性脂肪性肝病，發(fā)病率高，可發(fā)展為肝纖維化、肝硬化、肝衰竭和肝細胞癌.中國非酒精性脂肪性肝病患病率為20.1 %，已成為慢性肝病以及肝移植的主要病因.FXR激動劑可以減緩非酒精性脂肪性肝病的肝細胞脂肪變性和脂質沉積，對肝臟起到保護作用[14].Vonafexor(EYP001)是法國Eyno公司研發(fā)的一種非膽酸類選擇性FXR激動劑，目前正用于慢性乙型肝炎和NASH的II期臨床研究中[15].為進一步研究該化合物，本文中，筆者以5-溴水楊醛為起始原料，通過2步反應生成5-溴苯并呋喃-2-甲酸乙酯中間體1，然后1與1-Boc哌嗪反應生成中間體2，2通過氯原子取代反應得到中間體3，將3進行脫Boc反應后得到中間體4，再與2,6-二氯苯磺酰氯反應，得到中間體5，最后通過水解反應得到最終產物EYP001.目標產物總收率為58.3 %(按5-溴水楊醛計).合成路線見圖1.其中，a為溴乙酸乙酯,K2CO3,NMP,65 ℃;b為DBU,EtOH,回流;c為Pd(OAc)2,BINAP,Cs2CO3,甲苯,100 ℃;d為濃H2SO4,THF,40 ℃;e為TAF,CH2Cl2;f為吡啶,THF,室溫;g為THF,10 %NaOH,EtOH.

圖1 目標化合物的合成路線Fig.1 Synthetic Route of Target Compound

1 實驗部分

1.1 儀器及試劑

薄層監(jiān)測用2F-20D暗箱式紫外分析儀(鞏義市予華儀器有限責任公司)；質譜用3200 QTRAP 1200 infinity series質譜儀(美國 AB Sciesx 公司)；高分辨質譜用AB Sciesx TripleTOF 5600+(美國 AB Sciesx 公司)；核磁共振用WIPM-NMR-400核磁共振波譜儀(中科牛津波譜技術有限公司)，四甲基硅烷(TMS)為內標.

化學試劑均為市售、分析純.

1.2 實驗步驟

1.2.1 5-溴苯并呋喃-2-甲酸乙酯(1)的制備

取干燥的50 mL茄形瓶，加入5-溴-2-羥基苯甲醛2.00 g(10.00 mmol)，加入20 mL的N-甲基吡咯烷酮溶解，再向反應瓶中加入K2CO32.76 g(20.00 mmol)，室溫下攪拌 20 min后向反應瓶中滴加溴乙酸乙酯1.60 mL(14.00 mmol)，升溫至65 ℃，TLC監(jiān)測反應進程,30 min后反應完全.向反應液中加入20 mL水，用乙酸乙酯萃取3次，合并有機相,用飽和食鹽水洗滌，無水硫酸鎂干燥.濾除干燥劑，濾液減壓濃縮，得到黃色油狀中間體的粗產品2.50 g;用20 mL無水乙醇溶解，在室溫攪拌下緩慢向反應瓶中滴加1，8-二氮雜二環(huán)十一碳-7-烯(DBU) 2.0 mL(13.38 mmol)，滴加完畢后，100 ℃加熱回流，TLC監(jiān)測反應進程,約1 h 后反應完全.將反應液冷卻至室溫，除去大部分溶劑，冰水浴下向25 mL冰水中滴加濃縮的反應液，攪拌，有固體析出，減壓抽濾，用蒸餾水洗滌濾餅.真空干燥后得到中間體1(淡黃色固體)2.41 g，收率為 90 %.1HNMR(400 MHz，CDCl3)δ:7.80(d，J=1.3 Hz，1H)，7.55～7.49(m，1H)，7.46(s，1H)，7.44(s，1H)，4.44(q，J=7.1 Hz，2H)，1.42(t，J=7.1 Hz，3H).13CNMR(101 MHz，CDCl3)δ:159.18，154.34，146.83，130.59，128.86，125.33，116.89，113.90，112.85，61.80，14.34.ESI-MS，m/z：269.0[M+H]+，291.2[M+Na]+.

1.2.2 5-(4-叔丁氧羰基哌嗪)苯并呋喃-2-甲酸乙酯(2)的制備

將30 mL甲苯置于三頸瓶中，在室溫條件下，用流動的氮氣做保護，加入40 mg醋酸鈀，攪拌溶解后加入0.11 g BINAP，6.26 g(19.27 mmol)碳酸銫，攪拌20 min，再加入2.40 g(9.64 mmol)中間體1和3.13 g(10.60 mmol)1-Boc哌嗪，攪拌10 min 后升溫至100 ℃.TLC監(jiān)測反應進程，7 h后反應結束.將反應液冷卻至室溫，向反應液中加入50 mL水，用乙酸乙酯萃取3次，合并有機相，依次用水、飽和食鹽水洗滌，無水硫酸鈉干燥;次日減壓抽濾，濾液減壓濃縮后進行柱層析分離(V(石油醚)∶V(乙酸乙酯)=10∶1)，得到中間體2(淡黃色固體)2.85 g，收率為85 %.1HNMR(400 MHz，CDCl3)δ:7.45(d，J=9.1Hz，1H)，7.41(s，1H)，7.13(d，J=9.1Hz，1H)，7.07(s，1H)，4.40(q，J=7.1 Hz，2H)，3.62～3.54(m，4H)，3.07(s，4H)，1.46(s，9H)，1.39(t，J= 7.1 Hz，3H).13CNMR(101 MHz，CDCl3)δ:159.51，154.68，151.27，148.73，146.24，127.57，120.41，113.73，112.67，109.04，79.86，61.36，51.07，28.44，14.31.ESI-MS，m/z：375.1[M+H]+，397.2[M+Na]+.

1.2.3 4-氯-5-(4-叔丁氧羰基哌嗪)苯并呋喃-2-甲酸乙酯(3)的制備

將2.80 g(10.78 mmol)中間體2加入到30 mL四氫呋喃中，攪拌溶解后加入2.80 mL濃硫酸，將1.54 g(11.48 mmol)N-氯代丁二酰亞胺(NCS)溶于四氫呋喃中，25 ℃下緩慢滴入反應液中，滴加完畢后，40 ℃加熱反應，TLC監(jiān)測反應進程，1 h后反應完全.冷卻至室溫后，蒸除溶劑，加水，用乙酸乙酯萃取3次，依次用水、飽和食鹽水洗滌.有機相用無水硫酸鎂干燥，2 h后抽濾，濾液減壓濃縮后得到中間體3(白色固體)3.03 g，收率為89 %.1HNMR(400 MHz，CDCl3)δ：7.59(s，1H)，7.46(d，J=8.8 Hz，1H)，7.21(d，J=8.6 Hz，1H)，4.44(q，J=7.1 Hz，2H)，3.67～3.60(m，4H)，3.01(s，4H)，1.49(s，9H)，1.43(t,J=7.2 Hz，3H).13CNMR(101 MHz，CDCl3)δ：159.06，154.80，152.01，146.60，145.21，128.07，121.62，120.59，112.42，110.97，79.77，61.63，51.78，28.43，14.26.

ESI-MS，m/z：408.7[M+H]+，430.9[M+Na]+.

1.2.4 4-氯-5-(哌嗪基)苯并呋喃-2-甲酸乙酯(4)的制備

將3.00 g中間體3溶于15 mL二氯甲烷中，向反應瓶中滴加三氟乙酸(15 mL)，室溫攪拌，TLC監(jiān)測反應進程,20 min后反應完全.冰水浴攪拌下，用飽和碳酸鈉水溶液將反應液pH調成中性.隨后用二氯甲烷萃取反應液，有機相用無水硫酸鎂干燥后，減壓抽濾，濾液減壓濃縮得到粗產品中間體4(白色固體)2.10 g，收率為93 %.此步反應未經純化直接投入下步反應.

1.2.5 4-氯-5-[4-(2,6-二氯苯磺酰基)-1-哌嗪基]苯并呋喃-2-甲酸乙酯(5)的制備

將2.00 g中間體4粗產品加入50 mL茄形瓶中，用重蒸的四氫呋喃(25 mL)溶解，將5.76 mL(71.28 mmol)吡啶分3次加入反應瓶，每間隔1 h加入1次，每次加完吡啶后，加入1.75 g(7.12 mmol)2，6-二氯苯磺酰氯，也分3次加入.室溫攪拌反應，TLC監(jiān)測反應進程,7 h后反應完全.將反應液減壓蒸餾除去溶劑，向反應液中加入20 mL水，用乙酸乙酯萃取3次，合并有機相依次用水、飽和食鹽水洗滌.有機相用無水硫酸鎂干燥后抽濾，濾液減壓濃縮后進行重結晶(V(石油醚)∶V(乙酸乙酯)=4∶1)，得到中間體5(白色固體)3.09 g，收率為92 %.熔點212～214 ℃.1HNMR(400 MHz，CDCl3)δ：7.57(s，1H)，7.48(dd，J=13.2，8.2 Hz，3H)，7.38～7.31(m，1H)，7.21(d，J=8.9 Hz，1H)，4.44(q，J=7.1 Hz，2H)，3.68～3.60(m，4H)，3.17～3.10(m，4H)，1.42(t，J=7.1 Hz，3H).13CNMR(101 MHz，CDCl3)δ：159.10，152.17，146.68，144.45，135.74，134.72，131.92，131.63，128.07，121.68，111.35，111.06，61.82，51.78，51.70，51.63，14.38，14.25.ESI-MS，m/z：518.8[M+H]+，540.8[M+Na]+.

1.2.6 Vonafexor(EYP001)的合成

向50 mL 茄形瓶中加入3.00 g中間體5，四氫呋喃(50 mL)為溶劑，加入50 mL 10 % NaOH(質量分數)水溶液，室溫攪拌反應，TLC監(jiān)測反應進程，2 h后反應完全.減壓除去反應液中大部分溶劑，冰水浴下，1 mol/L HCl溶液將反應液調至酸性，有大量的白色固體析出，減壓抽濾，蒸餾水洗滌濾餅，濾餅經重結晶(V(石油醚)∶V(乙酸乙酯)=4∶1)純化，真空干燥后得到純品2.52 g，收率為89 %，熔點288～290 ℃.1HNMR(400 MHz，DMSO)δ:7.81～7.74(m，2H)，7.68(dd，J=8.8，7.2 Hz，1H)，7.61(d，J=8.8 Hz，1H)，7.30(d，J=8.9 Hz，1H)，7.18(s，1H)，3.53(s，4H)，3.15～3.04(m，4H).13CNMR(101 MHz，DMSO)δ:161.45，155.04，144.22，135.06，134.62，133.95，132.72，128.71，119.98，119.47，111.37，107.08，51.75，46.30.高分辨質譜HR-MS：C19H15Cl3N2O5SH for[M+H]+，理論計算值為488.976 7，測試數值為488.955 8.

2 反應條件的優(yōu)化

碳氮偶聯(lián)反應見式(1).在實驗過程中，碳氮偶聯(lián)反應比較難發(fā)生，反應條件苛刻.為了促進反應發(fā)生，加入催化劑膦配體.膦配體、堿、溶劑等反應條件的優(yōu)化結果見表1.

(1)

表1 苯并呋喃環(huán)碳氮偶聯(lián)反應條件Tab.1 C-N Coupling Reaction Conditions of Benzofuran Ring

苯并呋喃環(huán)碳氮偶聯(lián)反應條件比較苛刻，該反應以醋酸鈀作催化劑，加入有機膦配體，在堿性條件和氮氣保護下進行反應.為了提高反應收率，對膦配體、堿、溫度和溶劑等條件進行了優(yōu)化.嘗試了Ph3P/NaH,Ph3P/t-BuONa等組合，發(fā)現反應不能發(fā)生.換用(t-Bu)3P/t-BuONa并用甲苯作溶劑,升高反應溫度后能夠發(fā)生反應，但產物雜亂，沒有目標產物生成.隨后降低反應體系堿性，用(t-Bu)3P/Cs2CO3催化，能夠得到目標產物但是轉化率較低.將配體換為BINAP后，產率有所提高，分別用t-BuONa,K2CO3,Cs2CO3催化，發(fā)現Cs2CO3對反應最為有利，產率可達85 %.因此，此步反應條件最終確定為氮氣保護，Pd(OAc)2/BINAP/Cs2CO3催化，100 ℃，在甲苯中反應.

3 結 論

以5-溴水楊醛為起始原料，通過環(huán)合、取代、脫保護、磺?；?、水解5步合成了EYP001，總收率為58.3 %(按5-溴水楊醛計算)，并對關鍵反應步驟進行了優(yōu)化.此路線反應時間短、操作簡單且每步都有較高的收率，為化合物EYP001的進一步開發(fā)及其衍生物的合成奠定了基礎.