廖潔深 何杰珩 劉廣超 馬驛 丁月霞 周鴻凱

摘要 [目的]研究鹽濃度對水稻土壤固氮微生物nifH基因多樣性的影響。[方法]在不同鹽濃度的土壤區(qū)域采集樣品，提取土壤總DNA，采用末端限制性片段長度多樣性分析技術(shù)（T-RFLP）對土壤固氮微生物nifH基因進(jìn)行多樣性分析。[結(jié)果]隨著水稻土壤鹽度上升，土壤有機質(zhì)、全氮和堿解氮含量也呈現(xiàn)一定程度的上升趨勢;水稻土壤nifH基因的分類操作單元（OTU）總數(shù)在土壤鹽度最高時達(dá)最大值，各組優(yōu)勢細(xì)菌數(shù)量在2.5種左右，樣本豐度主要集中在4個片段內(nèi)，各組相對豐度差異不顯著（P>0.05）;水稻組土壤與富貴竹土壤相比，多樣性和均勻度均差異顯著（P<0.05），水稻各組間微生物多樣性呈現(xiàn)鹽度依賴效應(yīng)，但差異不顯著（P>0.05）。[結(jié)論]土壤鹽度影響土壤性質(zhì)及固氮微生物，微生物多樣性呈現(xiàn)一定鹽度依賴效應(yīng)。

關(guān)鍵詞 固氮微生物;鹽度;水稻土壤;nifH基因;多樣性

中圖分類號 S154.3? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A? 文章編號 0517-6611（2022）12-0001-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2022.12.001

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）：

Effects of Salt Concentration on nifH Gene Diversity of Nitrogen-fixing Microorganisms in Rice Soil

LIAO Jie-shen， HE Jie-heng， LIU Guang-chao et al

（College of Coastal Agricultural Sciences， Guangdong Ocean University， Zhanjiang，Guangdong 524088）

Abstract [Objective] To study the effect of salt concentration on the nifH gene diversity of nitrogen-fixing microorganisms in rice soil.[Method]Soil samples were collected from different salt concentrations parts and extracted soil total DNA to investigate effects of salt concentration on nifH gene diversity of rice soil nitrogen-fixing microorganisms by using the terminal restriction fragment length polymorphism （T-RFLP） methods.[Result]The content of organic matter， total nitrogen and alkali-hydrolyzable nitrogen also showed a certain upward trend with the increase of soil salinity.The total number of operational taxonomic units （OTUs） of nifH gene in rice soil reached the maximum value at the highest soil salinity， the number of dominant bacteria was about 2.5 in each group， and the sample abundance was mainly concentrated in 4 fragments.There was no significant difference in relative abundance among the groups （P>0.05）The diversity and evenness of rice soil were significantly different from those of Fugui Bamboo， there was a salinity-dependent effect on microbial diversity among rice groups， but the differences were not significant（P>0.05）. [Conclusion]Soil salinity affected properties and nitrogen-fixing microorganisms， and microbial diversity showed a salinity-dependent effect.

Key words Nitrogen-fixing microorganisms;Salinity;Rice soil;nifH gene;Diversity

近年來，由于我國對海水稻方面的研究越來越深入，鹽度對土壤微生物的影響成為研究的熱門課題。土壤的營養(yǎng)價值體現(xiàn)在很多方面，在農(nóng)業(yè)系統(tǒng)中，氮元素顯得尤其重要，因為氮元素通常是作物生長的限制養(yǎng)分，也使大氣氮還原為生物可用銨成為氮輸入的重要來源[1]。已有研究證明，固氮微生物的豐度和群落結(jié)構(gòu)與土壤有機質(zhì)有一定的相關(guān)性[2]。也有研究表明，鹽度對土壤微生物的多樣性有一定的影響[3]，但鹽度對水稻土壤的nifH基因多樣性影響的研究相對較少。由于固氮微生物驅(qū)動的固氮作用是土壤有效氮的重要來源之一[4-5]，可以通過研究固氮微生物的豐度和群落結(jié)構(gòu)，進(jìn)一步研究土壤有機質(zhì)的變化與鹽度的關(guān)系。nifH基因是固氮微生物固氮酶重要的結(jié)構(gòu)基因，常被用來作為檢測固氮菌的一個分子指標(biāo)[6]。有研究表明，nifH基因是nif操縱子研究最深入的基因，從多個環(huán)境中分離出的培養(yǎng)和未培養(yǎng)的微生物中獲得了廣泛的序列[7]。該試驗通過檢測不同鹽度區(qū)域中水稻土壤的nifH基因多樣性，探討鹽度對土壤固氮微生物固氮能力的影響，以期為海水稻種植提供試驗依據(jù)。83F82672-524C-4726-961C-C7B8E1E62CB2

1 材料與方法

1.1 土壤采集與處理

土壤采于湛江市遂溪縣建新鎮(zhèn)卜巢村海水稻種植基地（110°07′E，21°08′N），在鹽度不同的5個區(qū)域采集樣本，采樣深度為10～20 cm，陰干后剔除植物根莖等雜物，研磨過4 mm篩后檢測土壤理化性質(zhì)。

1.2 nifH基因擴增

使用OMEGA試劑盒提取土壤樣品總DNA，-20 ℃保存。土壤總DNA采用PCR技術(shù)對目的基因進(jìn)行擴增。nifH-F：5′-AAAGG（C/T）GG（A/T）ATCGG（C/T）AA（A/G）TCCACCAC -3′（5′端羧基熒光素標(biāo)記）;nifH-R：5′-TTGTT（G/C）G C（A/G）TACAT（G/C）GCCAT-CAT-3′[8]。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性2 min，94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min（36個循環(huán)），72 ℃終延伸10 min后4 ℃保存。PCR產(chǎn)物采用1%凝膠電泳，110 V，30 min。

1.3 PCR產(chǎn)物限制性酶切以及毛細(xì)管電泳掃描

nifH基因擴增的PCR產(chǎn)物進(jìn)行限制性酶切。反應(yīng)體系為PCR產(chǎn)物30 μL、Hae Ⅲ? 2 μL、10×Buffer 2 μL、ddH2O 6 μL。反應(yīng)條件為37 ℃，4 h。將30 μL酶切產(chǎn)物送到上海生工技術(shù)有限公司進(jìn)行毛細(xì)管電泳掃描。

1.4 數(shù)據(jù)分析與統(tǒng)計

數(shù)據(jù)處理采用GeneMarker軟件分析電泳結(jié)果，除去相對熒光單位小于100的峰，并選取各組5個重復(fù)中都出現(xiàn)的峰進(jìn)行統(tǒng)計[9]?？梢哉J(rèn)為每一個限制性片段是一個分延伸類操作單元，對應(yīng)的峰面積的大小反映每一限制性片段的相對數(shù)量[10]。使用Bio-Dap軟件對酶切圖譜進(jìn)行多樣性指數(shù)分析，采用SPSS 6.12軟件進(jìn)行多樣性指數(shù)的方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤的理化性質(zhì)

從不同區(qū)域土壤的理化性質(zhì)（表1）可以看出，除Ⅴ樣地種植植物為富貴竹外，其余水稻土壤呈現(xiàn)鹽度由高到低順序，最高達(dá)1 394.0 μS/cm。隨著鹽度的逐漸上升，土壤中全氮、堿解氮和有機質(zhì)含量均出現(xiàn)了一定程度的上升趨勢，但Ⅱ組土壤有機質(zhì)、全氮和堿解氮含量并沒有呈現(xiàn)這種隨鹽度上升的趨勢。其中，Ⅰ組土壤鹽度高于其他區(qū)域，其有機質(zhì)、全氮和堿解氮含量均極顯著增加（P<0.01）。速效磷的含量則隨著鹽度的逐漸上升而出現(xiàn)了一定程度的下降，Ⅲ組樣本速效磷的含量與其他4個樣本相比極顯著減少（P<001）。速效鉀的含量在水稻組土壤無顯著變化，與富貴竹土壤差異極顯著。

2.2 nifH基因電泳圖譜分析

固氮功能基因nifH的PCR擴增片段大小約為490 bp（圖1）。nifH基因酶切產(chǎn)物的毛細(xì)電泳掃描圖譜（部分）如圖2所示。

2.3 固氮功能基因電泳圖譜分析

2.3.1 nifH基因T-RFLP圖譜OTU個數(shù)和片段豐度。

使用Gememarker軟件分析毛細(xì)管電泳結(jié)果，每個限制性片段可以被認(rèn)為是一個分類操作單元（operational taxonomic units，OTU），對應(yīng)的峰面積反映該片段的相對數(shù)量[11]。計算OTU相對豐度時舍去小于50 pb的片段，并且OTU相對豐度小于1%的小片段也舍去，定義OTU相對豐度>4%為優(yōu)勢菌群，OTU≤4%為非優(yōu)勢菌種[8]。不同鹽濃度的OTU數(shù)量與優(yōu)勢菌種數(shù)見表2。

根據(jù)表2可以分析Ⅱ、Ⅲ、Ⅴ區(qū)域土壤平均總OTU數(shù)量相差不大，Ⅰ 樣本的平均總OTU數(shù)量較高（17.20個），Ⅰ 組樣本的優(yōu)勢菌種數(shù)量（5.60種）相對其他組較多，差異顯著（P<005）。水稻土壤nifH基因的OTU總數(shù)在土壤鹽度最高（樣本Ⅰ）時達(dá)最大值，各組優(yōu)勢細(xì)菌數(shù)量在2.5種左右。各組的優(yōu)勢菌種的相對豐度如圖3所示，基因片段大小主要集中在52、123、127、268 bp。

2.4 nifH基因多樣性指數(shù)分析

一般情況下，Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)反映土壤微生物的多樣性，Simpson指數(shù)和Shannon指數(shù)越大，表明土壤微生物群落多樣性越高。由表4可知，Shannon指數(shù)第Ⅴ組相較于其他組差異極顯著（P<001），Simpson指數(shù)第Ⅴ組較其他組差異極顯著（P<0.01）;Pielou指數(shù)反映樣本均勻度，第Ⅴ組較其他組差異極顯著（P<0.01）;Brillouin指數(shù)反映物種數(shù)目，Brillouin指數(shù)第Ⅱ組與第Ⅴ組差異極顯著（P<0.01），其他各組之間差異不顯著。Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)種植富貴竹土壤與種植水稻土壤差異極顯著（P<0.01）。在所有的水稻土壤中，海紅11號水稻Brillouin指數(shù)有所降低，但與其他水稻土壤差異不顯著（P<0.05）。綜合以上數(shù)值分析，種植富貴竹的土壤微生物多樣性較低，種植水稻土壤的微生物多樣性隨土壤鹽度上升而增多，但各組間差異不顯著（P>0.05）。

3 討論與結(jié)論

通過該試驗可以發(fā)現(xiàn)水稻土壤鹽濃度對固氮功能基因nifH豐度有顯著的影響，影響固氮功能基因nifH豐度的因素還包括土壤酸堿度、氮氧含量、其他微生物的相互影響作用等[12]。 因此該研究不僅設(shè)置了不同品種水稻土壤之間的比較，也設(shè)置了對富貴竹土壤固氮微生物豐度的對照。但是根據(jù)最近的一項分析發(fā)現(xiàn)，鹽度對土壤微生物組成的影響遠(yuǎn)大于其他土壤理化性質(zhì)、極端天氣的影響[13]。該研究表明，富貴竹的土壤相對于其他土壤樣品土壤微生物多樣性較低，而其他土壤樣品微生物多樣性差異不大，則可以排除其他微生物對此次水稻土壤樣品的影響。水稻土壤處于200 μS/cm左右鹽度（樣本Ⅱ～Ⅳ）時，微生物種群種類數(shù)量大致相同;土壤鹽度為1 394.0 μS/cm（樣本Ⅰ）時，微生物種類數(shù)量是最多的，土壤中堿解氮、全氮和有機質(zhì)的含量均最高。一般認(rèn)為微生物種類越多，各物種的數(shù)量越多，則功能基因的拷貝數(shù)越多[14]。水稻土壤nifH基因的OTU總數(shù)在土壤鹽度最高（樣本Ⅰ）時達(dá)最大值，各組優(yōu)勢細(xì)菌數(shù)量在2.5種左右。nifH基因的相對豐度比絕對數(shù)量更具說服力[15]。這說明當(dāng)土壤處于樣本Ⅰ的鹽度時，應(yīng)該擁有較高的nifH基因拷貝數(shù)，根據(jù)定量分析的結(jié)果判定結(jié)果符合以上推論[16]。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)土壤鹽度越高時，nifH基因的豐度越高，土壤中的堿解氮、全氮和有機質(zhì)含量也越高。表明當(dāng)土壤處于此鹽濃度時營養(yǎng)狀況更好[17]，固氮微生物的固氮功能也更加活躍。根據(jù)nifH基因多樣性指數(shù)的分析與這一論點相吻合。83F82672-524C-4726-961C-C7B8E1E62CB2

綜合以上分析，該研究支持土壤固氮細(xì)菌的nifH基因豐度高的理由可能有兩方面：一是鹽度，樣本Ⅰ（長毛谷水稻）的鹽濃度明顯高于其他4個樣品。不論是從固氮微生物的生物多樣性和群落結(jié)構(gòu)來說，還是nifH基因的相對豐度來說，樣本Ⅰ（長毛谷水稻）土壤的nifH基因多樣性是最高的;二是pH，從對樣本Ⅳ（其他品種水稻）的土壤理化性質(zhì)分析，可以得知除了鹽度對nifH基因具有決定性的影響外，pH對土壤中的固氮微生物也存在影響，這說明大部分的土壤固氮細(xì)菌活性受土壤pH的影響較大，土壤固氮微生物都有其生存的最適pH范圍[17-18]。隨著鹽度的逐漸上升，全氮、堿解氮和有機質(zhì)含量出現(xiàn)了一定程度的上升趨勢。樣本Ⅱ（長毛谷水稻）土壤有機質(zhì)、全氮和堿解氮含量沒有隨著鹽度的上升而變化的原因可能是受到了pH的干擾。這也在一定程度上說明了pH對nifH基因豐度有一定的影響。不同鹽度條件的土壤固氮微生物的區(qū)系組成，是被土壤各種理化性質(zhì)的共同作用所影響，并非僅受到單一條件影響的[19]。

一般認(rèn)為，鹽漬化土壤中微生物會因為受到鹽的脅迫導(dǎo)致多樣性下降[20-21]。陳瑞蕊等[22]研究顯示，土壤鹽分對細(xì)菌群落豐富度和多樣性均沒有顯著影響，且高鹽土壤在不同分類水平上的細(xì)菌種類與非鹽和輕鹽土壤相比沒有降低。Walsh 等[23]研究也報道了類似的結(jié)果。在意大利濱海的高鹽土壤中，細(xì)菌多樣性高于正常土壤[24]。在我國河西走廊地區(qū)也發(fā)現(xiàn)鹽堿土壤的細(xì)菌非常豐富，存在大量的細(xì)菌類群，尤其是在次生鹽堿土壤中，且次生鹽堿土與農(nóng)田土微生物群落差異較小[25]。該試驗中，水稻組土壤與富貴竹土壤相比，多樣性和均勻度均差異顯著（P<0.05）;水稻土壤鹽度越高，水稻土壤nifH基因的豐度越高。水稻各組間微生物多樣性呈現(xiàn)鹽度依賴效應(yīng)，但差異不顯著（P>0.05）。土壤鹽度影響土壤性質(zhì)及固氮微生物，微生物多樣性呈現(xiàn)一定鹽度依賴效應(yīng)。但固氮微生物在什么鹽濃度中的存活率最高暫時還沒結(jié)果，目前僅發(fā)現(xiàn)微生物生物量在中鹽時最高[26]，也有研究表明，高鹽會降低微生物的生物活性，微生物的群落結(jié)構(gòu)會遭到一定程度的破壞[27]。nifH基因的多樣性是在土壤多大鹽度中呈現(xiàn)最佳仍需要進(jìn)一步研究。

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