王國(guó)艷 范建強(qiáng) 黨文慶 何敏 王志宇
摘要 [目的]調(diào)查山西省某肉牛場(chǎng)犢牛腹瀉源大腸桿菌耐藥基因的流行情況。[方法]采用Kirby-Bauer紙片法和PCR法,對(duì)分離出的8株腹瀉大腸桿菌進(jìn)行了7種臨床常用藥物的藥物敏感試驗(yàn)及相關(guān)耐藥基因的檢測(cè)。[結(jié)果]耐3種藥物的菌株有1株,耐2種藥物的菌株有6株,僅有1株菌對(duì)1種藥物耐受;分離的8株?duì)倥T创竽c桿菌菌株對(duì)四環(huán)素、慶大霉素高度耐藥,耐藥率分別為100%、87.5%;對(duì)氧氟沙星、阿米卡星、卡那霉素敏感性較高。分離的8株?duì)倥T创竽c桿菌菌株的 aph3′-Ⅱ、TetD和TetB基因檢出率分別為75.0%、62.5%和37.5%。[結(jié)論]該肉牛場(chǎng)犢牛源腹瀉大腸桿菌存在一定程度的耐藥性。
關(guān)鍵詞 大腸桿菌;牛腹瀉;耐藥基因
中圖分類號(hào) S 852.61? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A
文章編號(hào) 0517-6611(2022)12-0079-03
doi:10.3969/j.issn.0517-6611.2022.12.020
開(kāi)放科學(xué)(資源服務(wù))標(biāo)識(shí)碼(OSID):
Drug Resistance Gene Analysis of Escherichia coli from Diarrhea of Calves in Shanxi
WANG Guo-yan1,F(xiàn)AN Jian-qiang2, DANG Wen-qing1 et al
(1.Longcheng Campus, College of Animal Medicine, Shanxi Agricultural University, Taiyuan, Shanxi 030032;2.Loufan Wanshunyuan Agriculture and Animal Husbandry Development Co.,Ltd.,Taiyuan, Shanxi 030300)
Abstract [Objective]In order to investigate the prevalence of drug resistance genes of Escherichia coli from diarrhea in calves of a beef cattle farm in Shanxi Province.[Method]8 strains of E.coli isolated by Kirby Bauer method and PCR were tested for drug sensitivity and related drug resistance genes.[Result]The results showed that 1 strain were resistant to 3 drugs, 6 strain were resistant to 2 drugs, and only 1 strain was resistant to 1 drug.Eight strains of E.coli isolated from calves were highly resistant to tetracycline gentamicin, and the resistance rates were 100%, 87.5%, respectively.The sensitivity to ofloxacin amikacin kanamycin was higher.The detection rates of aph3-Ⅱ、TetD and TetB genes of 8 strains of E.coli isolated from calves were 75.0%, 62.5% and 37.5%, respectively.[Conclusion]The study indicates that there was a certain degree of resistance to E.coli from calf diarrhea in this cattle farm.
Key words Escherichia coli;Cattle diarrhea;Drug resistance genes
犢牛腹瀉是一種臨床表現(xiàn)以腹瀉、脫水、發(fā)熱、消瘦為主的疾病,沒(méi)有明顯的季節(jié)性[1-3]。該病是由病毒、細(xì)菌、寄生蟲(chóng)、營(yíng)養(yǎng)、環(huán)境等眾多因素引起[4-6],而由致病性大腸桿菌混合感染引起的占90%[3,7-8]。近幾年,山西太原地區(qū)肉牛養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展較為迅速,犢牛腹瀉越來(lái)越引起人們的重視。筆者于2019—2020年在養(yǎng)殖場(chǎng)共采集分離出8株?duì)倥8篂a大腸桿菌,并進(jìn)行了耐藥表型及耐藥基因的檢測(cè),旨在為養(yǎng)殖場(chǎng)犢牛大腸桿菌腹瀉的防治提供科學(xué)依據(jù)。
1 材料與方法
1.1 材料
1.1.1 菌株來(lái)源。
于2019—2020年共采集山西省太原地區(qū)某肉牛場(chǎng)分離的8株腹瀉大腸桿菌,由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)龍城校區(qū)(原山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所)保存。菌株編號(hào)為1~8號(hào)。
1.1.2 主要試劑。
水解酪蛋白瓊脂(MH瓊脂)培養(yǎng)基、Mueller-Hinton 肉湯(MH肉湯)購(gòu)自青島賓得生物技術(shù)有限公司;細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒、2×Taq MasterMix、marker、瓊脂糖凝膠回收試劑盒,購(gòu)自天根生化科技(北京) 有限公司;藥敏紙片:阿米卡星(10 μg/片)、頭孢曲松(30 μg/片)、氧氟沙星(30 μg/片)、諾氟沙星(30 μg/片)、卡那霉素(30 μg/片)、慶大霉素(10 μg/片)、四環(huán)素(30 μg/片),購(gòu)自北京天壇生物制品有限公司。
1.1.3 引物的設(shè)計(jì)與合成。
參照參考文獻(xiàn)[9-11]合成相關(guān)引物,包括四環(huán)素類耐藥基因(TetA、TetB、TetD)、β-內(nèi)酰胺類耐藥基因(SHV)、氨基糖苷類耐藥基因[aph3′-Ⅱ、aac(6′)-Ib],引物信息見(jiàn)表 1。引物由生工生物工程( 上海) 股份有限公司合成。
1.2 方法
1.2.1 菌株復(fù)蘇。
將保存的菌株分別劃線接種于MH瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基(MAC)、伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基(EMB) ,37? ℃恒溫過(guò)夜培養(yǎng);將EMB培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的單個(gè)菌落接種于MH營(yíng)養(yǎng)肉湯中,37 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)12~16 h。
1.2.2 藥敏試驗(yàn)。
參照美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)[12](NCCLS)推薦的K-B紙片擴(kuò)散法對(duì)復(fù)蘇的8株菌株進(jìn)行藥物敏感性試驗(yàn),并根據(jù)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)[13](CLSI) 標(biāo)準(zhǔn)判定結(jié)果。
1.2.3 大腸桿菌耐藥基因的檢測(cè)。
以大腸桿菌細(xì)菌基因組DNA為模板對(duì)分離的8株大腸桿菌進(jìn)行PCR檢測(cè)。PCR擴(kuò)增體系(20 μL):2×Taq Master Mix 10 μL,上、下引物各1 μL,DNA 模板1μL,ddH2O 7 μL,各PCR擴(kuò)增程序見(jiàn)表2。對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳分析。
2 結(jié)果與分析
2.1 菌株復(fù)蘇
8株菌株在MH上呈灰白色;在MAC上呈磚紅色或粉紅色菌落,在EMB上呈黑綠色金屬光澤菌落。
2.2 藥敏試驗(yàn) 8株大腸桿菌的藥敏試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3、4。
由表 3、4可知,四環(huán)素的耐藥率為 100%;對(duì)氧氟沙星、阿米卡星、卡那霉素的高敏率為均87.5%;經(jīng)過(guò)對(duì)這8株菌株的耐藥譜分析發(fā)現(xiàn),耐3種藥物的菌株有1株,耐2種藥物的菌株有6株,僅有 3號(hào)菌株對(duì)1種藥物耐藥,說(shuō)明該肉牛養(yǎng)殖場(chǎng)腹瀉大腸桿菌有嚴(yán)重的多重耐藥性。
2.3 耐藥基因的PCR檢測(cè)結(jié)果 該研究選取了6種耐藥基因,通過(guò)PCR方法對(duì)8株分離菌株進(jìn)行耐藥基因檢測(cè),結(jié)果見(jiàn)圖1。結(jié)果表明,8株菌株分別攜帶不同的耐藥基因,具體結(jié)果見(jiàn)表5。由表5可知,氨基糖苷類aph3′-Ⅱ基因的檢出率較高,為75.0%;未檢測(cè)到aac(6′)-Ib基因。四環(huán)素類TetD基因的檢出率為62.5%;TetB基因的檢出率較低,為37.5%;未檢測(cè)到TetA基因。也未檢測(cè)到β-內(nèi)酰胺類SHV基因。
3 小結(jié)
隨著人們生活水平的不斷提高,對(duì)牛肉的需求也不斷增加,肉牛規(guī)?;B(yǎng)殖在不斷發(fā)展,抗生素被用于預(yù)防疾病,提高經(jīng)濟(jì)效益的同時(shí),也刺激細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性。細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生對(duì)動(dòng)物疾病的治療有很大的影響,對(duì)健康養(yǎng)殖危害極大。該研究選取2019—2020年從山西省太原地區(qū)某肉牛場(chǎng)分離的8株牛源腹瀉大腸桿菌進(jìn)行敏感藥物篩選試驗(yàn),其中耐3種藥物的菌株有1株,耐2種藥物的菌株有6株,僅1株菌對(duì)1種藥物耐受;所有菌株對(duì)阿米卡星、卡那霉素、氧氟沙星均高度敏感,可以作為該養(yǎng)殖場(chǎng)的優(yōu)先選擇藥物。所有菌株對(duì)四環(huán)素均耐藥,對(duì)氨基糖苷類藥物慶大霉素的耐藥率均為87.5%。李慧等[14]對(duì)寧夏地區(qū)66株牛源大腸桿菌進(jìn)行耐藥性,檢出顯示慶大霉素的耐藥率為15.15%;高?;鄣萚15]研究結(jié)果表明,寧夏地區(qū)164株?duì)倥8篂a源大腸桿菌對(duì)頭孢唑啉的耐藥率達(dá)到95%。這些報(bào)道表明,不同地區(qū)分離的腹瀉大腸桿菌菌株的耐藥性不同,山西省太原地區(qū)某肉牛養(yǎng)殖場(chǎng)的腹瀉大腸桿菌菌株有其耐藥表征。
對(duì)6種耐藥基因檢測(cè)的結(jié)果表明,該養(yǎng)殖場(chǎng)分離的腹瀉大腸桿菌攜帶的耐藥基因主要是氨基糖苷類aph3′-Ⅱ基因,檢出率為75.0%。四環(huán)素類TetD基因,檢出率為62.5%;TetB基因的檢出率為37.5%。吳同壘等[16]對(duì)秦皇島地區(qū)肉牛腹瀉大腸桿菌耐藥基因的檢測(cè)結(jié)果表明,四環(huán)素類TetD基因檢出率較低,為33.3%,說(shuō)明不同地區(qū)肉牛腹瀉大腸桿菌菌株的耐藥基因存在不同。
因此,在預(yù)防和治療犢牛腹瀉大腸桿菌病時(shí),要定期進(jìn)行敏感藥物篩選試驗(yàn),為臨床上合理用藥提供科學(xué)指導(dǎo),避免長(zhǎng)期使用同樣的藥物,探索新的治療方法。
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