麻瘋樹油體鈣蛋白JcCale26.8基因克隆及序列分析

蒲芝雨 黃建輝 李國(guó)澤 丁勇

摘要 [目的]克隆麻瘋樹（Jatrapha curcas）油體鈣蛋白基因JcCale26.8全長(zhǎng)cDNA序列，探究麻瘋樹油體鈣蛋白及其基因的結(jié)構(gòu)與功能。[方法]應(yīng)用RNA-seq測(cè)序和PCR技術(shù)，從麻瘋樹種子中克隆獲得1個(gè)油體鈣蛋白家族基因JcCale26.8，并進(jìn)行測(cè)序和序列分析。[結(jié)果]JcCale26.8基因序列含有6個(gè)外顯子和5個(gè)內(nèi)含子，內(nèi)含子剪接位點(diǎn)符合真核生物基因的GT-AG法則。JcCale26.8基因mRNA序列的完整開放閱讀框長(zhǎng)717 bp，推測(cè)編碼由238個(gè)氨基酸組成、相對(duì)分子量為26.8 kD的油體鈣蛋白JcCale26.8。JcCale26.8蛋白主要由α-螺旋和無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)構(gòu)成，并具有油體鈣蛋白典型結(jié)構(gòu)特征，與來自蓖麻、川桑和異色山黃麻等多個(gè)不同物種的Caleosin蛋白具有較高的同源相似性。[結(jié)論]該研究可為麻瘋樹油體鈣蛋白基因的表達(dá)調(diào)控與功能研究奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 種子;油體;麻瘋樹;油體鈣蛋白;基因克隆

中圖分類號(hào) S 794.9? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

文章編號(hào) 0517-6611（2022）12-0086-07

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2022.12.022

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Cloning and Sequence Analysis of Caleosin Gene JcCale26.8 in Jatropha curcas

PU Zhi-yu，HUANG Jian-hui，LI Guo-ze et al

（Key Laboratory of Forest Biotechnology in Yunnan，Southwest Forestry University，Kunming，Yunnan 650224）

Abstract [Objective]To clone the full-length cDNA sequence of JcCale26.8 gene from J.curcas and investigate the structure and function of caleosin and its gene in J.curcas seeds.[Method]This study used RNA-sequencing and PCR technology to clone a caleosin family gene JcCale26.8 from J.curcas seeds.Then the sequence of gene JcCale26.8 were sequenced and analyzed.[Result]The DNA sequence of JcCale26.8 gene contains 6 exons and 5 introns.The splicing sites of introns conform to the GT-AG rule of eukaryotic genes.The full-length mRNA comprised 717 bp nucleotides consisting of an open reading frame encoded a putative JcCale26.8 comprising 238 amino acid residues with molecular weight of 26.8 kD.JcCale26.8 protein is mainly composed of α-helix and random coil structure，and has the typical structural characteristics of caleosin.It has high homology and similarity with caleosin proteins from many different species such as Ricinus communis，Morus notabilis and Trema orientalis.[Conclusion]The? study can lay the experimental foundation for the study of the expression regulation and function of caleosin gene in J.curcas.

Key words Seed;Oil body;Jatropha curcas;Caleosin;Gene cloning

油體是脂質(zhì)（主要是三酰甘油）儲(chǔ)存庫，主要存在于種子和衰老的葉片中[1]。油體不僅在植物生長(zhǎng)發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用，還能參與脅迫響應(yīng)和激素信號(hào)通路等過程[2]。油體由外部完整的磷脂單分子層和圍繞著疏水核心的膜蛋白組成[3]，這些膜蛋白包括油質(zhì)蛋白（Oleosin）、油體鈣蛋白（Caleosin）和油體固醇蛋白（Steroleosin）[4]。Oleosin是植物油體特有，且最為豐富的結(jié)合蛋白[5-6]，與油體大小和種子萌發(fā)率密切相關(guān)，并能增強(qiáng)植物種子的抗凍性[4]。Caleosin作為油體上的微量結(jié)合蛋白，最早發(fā)現(xiàn)于水稻（Oryza sativa）穎果發(fā)育時(shí)期的細(xì)胞膜上[7]，其在植物種子萌發(fā)過程中參與脂質(zhì)降解[8]、油體形成[9]及維持油體的穩(wěn)定[10]，在擬南芥（Arabidopsis thaliana）的非種子組織中，Caleosin還表現(xiàn)出過氧羥基脂肪酸羥化環(huán)氧化酶活性[11]，參與抵抗逆境脅迫[11]和植物開花調(diào)節(jié)[12]等過程。

麻瘋樹（Jatrapha curcas）又名黃腫樹（廣東）、芙蓉樹、假花生（廣西）、高桐（云南）、嗎哄罕（傣名）、桐油樹（臺(tái)灣）、南洋油桐（日本），為大戟科（Euphorbiaceae）麻瘋樹屬（Jatropha）植物，主要分布于熱帶和亞熱帶地區(qū)，在我國(guó)半野生或栽培種植面積較廣，資源豐富[13]。成熟麻瘋樹種子的含油量高達(dá)36%[14]，野生麻瘋樹種仁的最高含油量約60%，超過油菜和大豆等常見的油料作物[15]，因此開展麻瘋樹油體結(jié)合蛋白及其基因結(jié)構(gòu)與功能研究對(duì)于其在油供工業(yè)方面的開發(fā)利用具有重要意義。而基因克隆與序列分析是開展不同生物目標(biāo)基因功能研究的前提[16-18]。目前，Oleosin和Caleosin油體結(jié)合蛋白基因已經(jīng)在水稻[7]、芝麻（Sesamum indicum）[9]、油菜（Brassica napus）[19]、擬南芥[20]和蓖麻（Ricinus communis）[21]等不同植物成熟種子中被克隆獲得。有關(guān)麻瘋樹中Oleosin及其基因序列和結(jié)構(gòu)特征已有研究[22-24]，但關(guān)于麻瘋樹Caleosin及其基因的研究鮮見報(bào)道。筆者以麻瘋樹種子為材料，應(yīng)用RNA-seq和PCR技術(shù)克隆麻瘋樹Caleosin基因序列并進(jìn)行分析，為完善對(duì)麻瘋樹油體膜蛋白的認(rèn)識(shí)及后續(xù)解析Caleosin在麻瘋樹中的基因表達(dá)特征和功能發(fā)揮奠定試驗(yàn)基礎(chǔ)。0D9E048B-6BF5-4DF0-A58B-5397006E25A7

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 試驗(yàn)材料為3年生麻瘋樹植株發(fā)育40 d的麻瘋樹種子，取自西雙版納熱帶植物園，液氮速凍后放置于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

RNA提取Trizol試劑和新型快速植物基因組DNA提取試劑盒為OMEGA公司產(chǎn)品，反轉(zhuǎn)錄（5 × All-In-One RT MasterMix）和PCR（Kodaq 2 × PCR MasterMix with dye）試劑盒為愛必夢(mèng)（abm）公司產(chǎn)品。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 核酸提取與檢測(cè)。

將麻瘋樹種子種殼去除，取種仁于液氮中研磨并用于核酸提取?？俁NA的提取按照Trizol試劑使用說明書進(jìn)行，基因組DNA的提取按照OMEGA公司新型快速植物基因組DNA提取試劑盒使用說明書進(jìn)行;基因組DNA和總RNA的完整性和純度分別用1.0%瓊脂糖凝膠電泳和Nano Photometer分光光度計(jì)（IMPLEN CA USA）檢測(cè)。

1.2.2 麻瘋樹種子RNA-seq測(cè)序及目標(biāo)基因挖掘。

檢測(cè)合格的總RNA樣本送至安諾優(yōu)達(dá)基因科技（北京）有限公司，構(gòu)建文庫后利用Illumina平臺(tái)進(jìn)行RNA-seq測(cè)序，原始下機(jī)序列（Raw Reads）通過去低質(zhì)量序列、去接頭污染等過程完成數(shù)據(jù)處理得到高質(zhì)量的序列（Clean Reads）。對(duì)質(zhì)控后的高質(zhì)量序列進(jìn)行組裝，再基于組裝序列結(jié)果進(jìn)行ORF及功能預(yù)測(cè)分析，從RNA-seq數(shù)據(jù)庫中挖掘具有潛在Caleosin功能結(jié)構(gòu)域的目標(biāo)cDNA序列。

1.2.3 麻瘋樹JcCale26.8基因cDNA序列克隆驗(yàn)證。

在目標(biāo)基因cDNA序列ORF區(qū)兩側(cè)設(shè)計(jì)特異性引物對(duì)F（5′-AGATGGCTACTAGAACGGACG-3′）和R（5′-GCCACCATTGCTTTACATTCT-3′），并委托上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。取總RNA樣品為模板，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行第一鏈cDNA的合成。取反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA 模板2.0 μL，R和F引物（10 μmol/μL）各0.5 μL，Kodaq 2 PCR MasterMix 12.5 μL，Nuclease-free H2O 9.5 μL，建立25 μL PCR反應(yīng)體系。PCR反應(yīng)程序：94 ℃ 預(yù)變性3 min，94 ℃變性30 s，53.3 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，38個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸10 min。

1.2.4 麻瘋樹JcCale26.8基因DNA序列克隆。

取“1.2.1”步驟中提取的高質(zhì)量gDNA樣品3 μL為模板，R和F為引物對(duì)，進(jìn)行JcCale26.8基因DNA序列的PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系和擴(kuò)增條件同“1.2.3”。

1.2.5 PCR產(chǎn)物檢測(cè)回收與克隆測(cè)序。步驟“1.2.3”和“1.2.4”中PCR產(chǎn)物采用1.0%瓊脂凝膠電泳檢測(cè)，目的片段回收后與pMD19-T載體連接，轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)復(fù)蘇后涂布在LB固體培養(yǎng)基上（含Amp、IPTG和X-Gal）培養(yǎng)，藍(lán)白斑篩選陽性克隆，委托上海生工生物技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序。

1.2.6 JcCale26.8基因的生物信息學(xué)分析。應(yīng)用表1顯示的網(wǎng)站對(duì)JcCale26.8基因及推導(dǎo)編碼的蛋白質(zhì)序列進(jìn)行對(duì)應(yīng)項(xiàng)目?jī)?nèi)容的分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 總RNA提取和JcCale26.8基因的cDNA序列克隆分析

植物組織總RNA樣品的純度和完整性是基因克隆等分子生物學(xué)試驗(yàn)成功的關(guān)鍵因素[25-26]。該試驗(yàn)獲得的發(fā)育40 d 麻瘋樹種子總RNA完整性好，顯示28S和18S rRNA條帶清晰，點(diǎn)樣孔無亮斑，無彌散拖尾，且前者條帶的亮度約為后者的2倍（圖1）;總RNA的A260/A280比值在1.8～2.0，說明純度好且無蛋白質(zhì)、多糖和酚類物質(zhì)等雜質(zhì)污染[27]。符合RNA-seq建庫測(cè)序和基因克隆試驗(yàn)要求。試驗(yàn)構(gòu)建的麻瘋樹種子RNA-seq數(shù)據(jù)庫共獲得33 902個(gè)Unigene，GC含量占40.72%，總堿基數(shù)達(dá)33 168 384個(gè)，從中挖掘獲得2條cDNA序列具有潛在Caleosin功能結(jié)構(gòu)域（表2），序列S1和S2均具有完整ORF區(qū)域。以具有較長(zhǎng)ORF區(qū)的序列S1為目標(biāo)進(jìn)行克隆驗(yàn)證分析。按“1.2.3”進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增反應(yīng)，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果（圖2）顯示，在對(duì)應(yīng)DL2000分子量標(biāo)準(zhǔn)的750 bp條帶處出現(xiàn)1條符合預(yù)期大小的主條帶，經(jīng)膠回收T/A克隆測(cè)序，獲得與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫Unigene序列S1引物間完全一致的長(zhǎng)738 bp的cDNA序列。長(zhǎng)1 026 bp的目標(biāo)序列S1推導(dǎo)編碼分子量為26.8 kD的Caleosin蛋白，因此命名為JcCale26.8基因。該試驗(yàn)獲得JcCale26.8基因cDNA序列全長(zhǎng)1 026 bp，1～43 bp為5′UTR，761～1 026 bp為3′UTR，位于826～831 bp的一致性序列AATAAA和2個(gè)U-rich單元（位于957～964 bp和1 016～1 021 bp處）為預(yù)測(cè)的PolyA信號(hào)位點(diǎn);44～760 bp為完整ORF，推測(cè)編碼由238個(gè)氨基酸組成的Caleosin蛋白JcCale26.8。

2.2 JcCale26.8基因DNA序列克隆與分析 該試驗(yàn)提取的麻瘋樹種子基因組DNA完整性好、純度高。DNA樣品條帶清晰單一（圖3），點(diǎn)樣孔無亮斑，無彌散拖尾，其A260/A280值為1.96。以提取的高質(zhì)量DNA樣品為模板，按“1.2.4”進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得大于2 000 bp的DNA條帶（圖4），克隆測(cè)序結(jié)果為2 018 bp的JcCale26.8基因組DNA序列。經(jīng)DNA和mRNA序列比對(duì)分析（圖5）顯示，JcCale26.8基因含有6個(gè)外顯子和5個(gè)內(nèi)含子。內(nèi)含子位于JcCale26.8基因DNA序列116～395、546～1 008、1 095～1 271、1 367～1 464、1 591～1 674 bp，每個(gè)內(nèi)含子序列5′端為GT、3′端為AG，均符合真核生物基因內(nèi)含子剪接位點(diǎn)的GT-AG規(guī)則。0D9E048B-6BF5-4DF0-A58B-5397006E25A7

2.3 JcCale26.8基因序列分析

通過 NCBI 網(wǎng)站 Blast 工具和CD-Search服務(wù)器對(duì)麻瘋樹JcCale26.8基因編碼的238個(gè)氨基酸序列進(jìn)行相似性搜索分析和功能域分析，結(jié)果（圖6）表明，目的基因編碼的麻瘋樹28.6 kD的Caleosin蛋白為Caleosin蛋白超家族成員，具有典型的Caleosin功能結(jié)構(gòu)域。該蛋白序列與NCBI登錄的來自麻瘋樹的未知蛋白JCGZ 02382（KDP40384.1）和過氧羥基脂肪酸羥化環(huán)氧化酶（Peroxygenase，POG） 異構(gòu)體X1 （XP 012069904.1）的氨基酸序列具有100%的一致性，表明該試驗(yàn)成功克隆獲得的麻瘋樹Caleosin蛋白可能具有POG酶活性。

JcCale26.8和其他物種Caleosin蛋白或具有POG酶活性的Caleosin蛋白具有較高的同源性（表3），與來自蓖麻（Ricinus communis）（XP_002528367.1）、川桑（Morus notabilis）（XP_010089211.1）、愛玉子（Ficus pumila var.Awkeotsang）（ABV72237.1）、異色山黃麻（Trema orientalis）（PON94834.1）等17個(gè)不同物種間的Caleosin蛋白同源相似性均達(dá)70%以上，其中與蓖麻的同源相似度最高，達(dá)87.07%?；贛EGA-x軟件構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖7）顯示，愛玉子（ABV72237.1）、楊梅（Myrica rubra）（KAB1219333.1）和川桑（XP_010089211.1）聚為一個(gè)分支，且與JcCale26.8的親緣關(guān)系最遠(yuǎn);JcCale26.8與蓖麻（XP_002528367.1）、野大豆（Glycine soja）（KHN30721.1）的Caleosin蛋白聚為一個(gè)分支，表明JcCale26.8與蓖麻和野大豆中具有POG酶活性的Caleosin蛋白親緣關(guān)系較近。

蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析結(jié)果顯示，JcCale26.8蛋白分子式為C1218H1829N317O350S10，相對(duì)分子量26.83 kD，等電點(diǎn)5.50;JcCale26.8蛋白由除天冬酰胺（Asn，N）外的19種常見氨基酸組成，亮氨酸（Leu，L）含量最高為8.8%，半胱氨酸（Cys，C）含量最低為0.8%，其他氨基酸含量在2.1～8.0%，氨基酸組成差異較小;負(fù)電荷氨基酸殘基（Asp+Glu）有28個(gè)，正電荷氨基酸殘基（Arg+Lys）有22個(gè);摩爾消光系數(shù)（extinction coeffificients）為45 505，不穩(wěn)定系數(shù)（Instability index）為52.01。蛋白信號(hào)肽分析顯示，無信號(hào)肽酶酶切位點(diǎn)（圖8），推測(cè)JcCale26.8屬于不穩(wěn)定的非分泌性酸性蛋白質(zhì)。

疏水作用在維持蛋白質(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定中發(fā)揮著重要作用，較高正值的氨基酸具有較強(qiáng)的疏水性，而較低負(fù)值的氨基酸則具有較強(qiáng)的親水性。通過在線軟件ExPASy對(duì)JcCale26.8進(jìn)行蛋白質(zhì)親疏水性分析，結(jié)果（圖9）顯示，大部分氨基酸為負(fù)值，表現(xiàn)為親水性，尤其是N-末端、127～150位氨基酸殘基和C-末端表現(xiàn)為較明顯的親水區(qū)，第46位氨基酸殘基處親水性最強(qiáng)（-2.144）;87～107位和182～201位氨基酸殘基處表現(xiàn)出較明顯的疏水性，99和100位氨基酸殘基疏水性最強(qiáng)（3.067），推測(cè)JcCale26.8為兩親性蛋白。基于TMHMM在線軟件分析結(jié)果顯示，JcCale26.8蛋白無明顯的跨膜結(jié)構(gòu)域（圖10），推測(cè)該蛋白可能以中間疏水區(qū)域錨定在油體膜表面而發(fā)揮作用。

二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，JcCale26.8主要由無規(guī)卷曲（46.64%）和α-螺旋（35.29%）結(jié)構(gòu)構(gòu)成，還含有少量的延伸鏈（10.92%）和β-轉(zhuǎn)角（7.14%）等二級(jí)結(jié)構(gòu)。無規(guī)卷曲主要位于第3～7、13～27、31～38、42～59、80～83、107～122、128～138、146～149、160～168、179～184、207～210位氨基酸殘基區(qū)域，α-螺旋結(jié)構(gòu)主要位于第8～12、60～67、84～89、94～105、150～159、169～177、185～207、211～218、234～238位氨基酸殘基區(qū)域，延伸鏈主要位于第68～70、77～79、103～104、123～127、139～141、198～202、222～225位氨基酸殘基區(qū)域，β-轉(zhuǎn)角主要位于第72～75、90～91、143～145、205～206、219～220、231～232位氨基酸殘基區(qū)域（圖11）。

蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)（圖12）顯示，JcCale26.8主要由9個(gè)α-螺旋和無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)構(gòu)成，模型置信度為97.7%，符合二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果。根據(jù)三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果，并結(jié)合親疏水性、跨膜結(jié)構(gòu)和二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果，預(yù)測(cè)麻瘋樹JcCale26.8蛋白符合油體鈣蛋白典型結(jié)構(gòu)特征，包括可結(jié)合鈣離子的N端親水區(qū)，中間含有脯氨酸的疏水區(qū)和C端的磷酸化位點(diǎn)[28]，可能在油體的形成及調(diào)動(dòng)中傳遞信號(hào)，在種子萌發(fā)過程中通過信息轉(zhuǎn)運(yùn)來啟動(dòng)分解油體內(nèi)中性脂肪產(chǎn)生能量。

3 結(jié)論與討論

Caleosin是一種與植物油體發(fā)育發(fā)生密切相關(guān)的油體結(jié)合蛋白之一，其編碼基因已從水稻[7]、芝麻[9]和擬南芥等[21]多種植物中克隆得到，不同植物的Caleosin蛋白序列具有較高的同源性，尤其是具有結(jié)合單一鈣離子的EF-hand保守域，并類似主要油體結(jié)合蛋白 Oleosin 能與油體相結(jié)合等特性[29]。該試驗(yàn)通過RNA-seq和PCR技術(shù)從麻瘋樹成熟種子中成功克隆了編碼26.8 kD Caleosin蛋白的JcCale26.8基因mRNA和對(duì)應(yīng)基因組DNA序列，推測(cè)編碼的JcCale26.8蛋白明顯具有Caleosin蛋白結(jié)構(gòu)特征，并與已知多種植物Caleosin蛋白具有較高的序列相似性。0D9E048B-6BF5-4DF0-A58B-5397006E25A7

對(duì)JcCale26.8基因序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，該序列早期在Zhang等[30]對(duì)鹽脅迫下麻瘋樹幼苗葉片的基因組測(cè)序數(shù)據(jù)庫中（PRJNA63485）分析拼接獲得，并被注釋為未知蛋白JCGZ_02382（KDP40384.1），而Jalali等[31]對(duì)麻瘋樹基因組進(jìn)行測(cè)序獲得的數(shù)據(jù)庫（PRJNA673911）進(jìn)行分析拼接獲得了該序列，并根據(jù)同源性自動(dòng)被注釋為POG （XP_012069904.1） 基因蛋白，但并未得到研究。有研究發(fā)現(xiàn)，Caleosin在非種子組織中表現(xiàn)出POG活性[32]，因而目前在NCBI數(shù)據(jù)庫中具有Caleosin功能結(jié)構(gòu)域的Caleosin蛋白序列多數(shù)被注釋為POG蛋白。為了探究麻瘋樹油體鈣蛋白及其基因的結(jié)構(gòu)與功能，筆者從麻瘋樹種子中克隆分離了JcCale26.8基因mRNA和DNA序列，序列特征分析結(jié)果表明JcCale26.8基因表達(dá)產(chǎn)物為植物Caleosin蛋白家族成員，而在麻瘋樹中JcCale26.8基因表達(dá)產(chǎn)物JcCale26.8蛋白是否具有POG酶活性仍需要深入研究。

Caleosin在植物中通常由多基因家族編碼，分子量一般在25～35 kD。目前已至少在15種植物中鑒定出了84個(gè)Caleosin基因[33]，如擬南芥基因組中鑒定出了8個(gè)Caleosin基因[34]，榛子（Corylus avellana L.）基因組中鑒定出5個(gè)Caleosin基因[35]，油菜（Brassica napus）中至少包含25.0、27.0、28.1 kD 的 3 個(gè)Caleosin 蛋白成員[29]。推測(cè)在麻瘋樹中至少存在4個(gè)Caleosin家族異構(gòu)體蛋白。該試驗(yàn)克隆分離了26.8 kD的Caleosin基因序列，同時(shí)該試驗(yàn)麻瘋樹種子轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫結(jié)果中還顯示有另一具有Caleosin功能結(jié)構(gòu)域的119個(gè)氨基酸殘基組成的推測(cè)13.7 kD的Caleosin基因序列;根據(jù)對(duì)NCBI登陸的麻瘋樹基因組數(shù)據(jù)庫PRJNA673911顯示的另外2個(gè)POG酶蛋白序列XP_020534220.1和XP_012072291.2分析顯示， XP_020534220.1（NCBI注釋為peroxygenase isoform X2）序列蛋白為206個(gè)氨基酸殘基組成的22.9 kD的Caleosin，XP_012072291.2（NCBI注釋為probable peroxygenase 4）序列蛋白為249個(gè)氨基酸殘基組成的28.7 kD的Caleosin。因此，推測(cè)以上4個(gè)序列對(duì)應(yīng)的蛋白均屬于Caleosin超家族成員。這可為后期開展麻瘋樹Caleosin家族蛋白的深入研究提供參考。

參考文獻(xiàn)

[1]

SHIMADA T L，HAYASHI M，HARA-NISHIMURA I.Membrane dynamics and multiple functions of oil bodies in seeds and leaves[J].Plant physiology，2018，176（1）：199-207.

[2] CHAPMAN K D，DYER J M，MULLEN R T.Biogenesis and functions of lipid droplets in plants[J].Journal of lipid research，2012，53（2）：215-226.

[3] LAIBACH N，POST J，TWYMAN R M，et al.The characteristics and potential applications of structural lipid droplet proteins in plants[J].Journal of biotechnology，2015，201：15-27.

[4] ITABE H.Intracellular lipid droplet-associated proteins：Unique members and their biological functions[J].Biological and pharmaceutical bulletin，2010，33（3）：341.

[5] CAPUANO F，BEAUDOIN F，NAPIER J A，et al.Properties and exploitation of oleosins[J].Biotechnology advances，2007，25（2）：203-206.

[6] 孫靜，姜宇，陶俊.植物油質(zhì)蛋白的結(jié)構(gòu)、功能及應(yīng)用[J].植物生理學(xué)報(bào)，2018，54（3）：363-369.

[7] FRANDSEN G，MLLER-URI F，NIELSEN M，et al.Novel plant Ca2+-binding protein expressed in response to abscisic acid and osmotic stress[J].The journal of biological chemistry，1996，271（1）：343-348.

[8] POXLEITNER M，ROGERS S W，LACEY SAMUEL A，et al.A role for caleosin in degradation of oil-body storage lipid during seed germination[J].The plant journal，2006，47（6）：917-933.

[9] CHEN J C F，TSAI C C Y，TZEN J T C.Cloning and secondary structure analysis of caleosin，a unique calcium-binding protein in oil bodies of plant seeds[J].Plant and cell physiology，1999，40（10）：1079-1086.0D9E048B-6BF5-4DF0-A58B-5397006E25A7

[10] JIANG P L，TZEN J T C.Caleosin serves as the major structural protein as efficient as oleosin on the surface of seed oil bodies[J].Plant signaling behavior，2010，5（4）：447-449.

[11] PARTRIDGE M，MURPHY D J.Roles of a membrane-bound caleosin and putative peroxygenase in biotic and abiotic stress responses in Arabidopsis[J].Plant physiology and biochemistry，2009，47（9）：796-806.

[12] BLE E，BOACHON B，BURCKLEN M，et al.The reductase activity of the Arabidopsis caleosin RESPONSIVE TO DESSICATION 20 mediates gibberellin-dependent flowering time，abscisic acid sensitivity，and tolerance to oxidative stress[J].Plant physiology，2014，166（1）：109-124.

[13] 韋劍鋒，韋冬萍，吳炫柯，等.麻瘋樹種子特性及其影響因素研究進(jìn)展[J] .種子，2013，32（2）：51-55.

[14] LIU H，WANG C P，KOMATSU S，et al.Proteomic analysis of the seed development in Jatropha curcas：From carbon flux to the lipid accumulation[J].Journal of proteomics，2013，91：23-40.

[15] 鄧志軍，程紅焱，宋松泉.麻瘋樹種子的研究進(jìn)展[J].云南植物研究，2005，27（6）：605-612.

[16] 鄭元，羅婭娜，羅瑪妮婭，等.牛樟芝羊毛甾醇合成酶基因AcLSS的克隆和表達(dá)分析[J].西南林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)），2021，41（3）：94-99.

[17] 陽江華，張希財(cái)，鄒智.橡膠樹捕光葉綠素 a/b 結(jié)合蛋白基因CAB2的克隆與分析[J].西南林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)），2019，39（1）：88-94.

[18] 徐志文，任雪敏，趙滿，等.黃粉甲儲(chǔ)存蛋白hexamerin基因的克隆及表達(dá)分析[J].西南林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)），2019，39（4）：96-102.

[19] NSTED H，F(xiàn)RANDEN G I，JAUH G Y，et al.Caleosins：Ca2+-binding proteins associated with lipid bodies[J].Plant molecular biology，2000，44（4）：463-476.

[20] JOLIVET P，ROUX E，DANDREA S，et al.Protein composition of oil bodies in Arabidopsis thaliana ecotype WS[J].Plant physiology and biochemistry，2004，42（6）：501-509.

[21] HYUN T K，KUMAR D，CHO Y Y，et al.Computational identification and phylogenetic analysis of the oil-body structural proteins，oleosin and caleosin，in castor bean and flax[J].Gene，2013，515（2）：454-460.

[22] 熊宏，陳海濤，宋健，等.麻風(fēng)樹油質(zhì)蛋白JcOle16.6基因克隆及序列分析[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，44（6）：84-89.

[23] 宋健，熊宏，余進(jìn)德，等.麻瘋樹油質(zhì)蛋白JcOle14.3基因克隆及序列分析[J].中南林業(yè)科技大學(xué)學(xué)報(bào)，2016，36（6）：15-22.

[24] 余進(jìn)德，熊宏，宋健，等.麻瘋樹種子發(fā)育過程中JcOle14.3和JcOle16.6基因的表達(dá)模式研究[J].廣西植物，2017，37（9）：1096-1100.

[25] 徐秋紅，章鎮(zhèn)，佟兆國(guó)，等.山梨醇對(duì)李果肉組織總RNA提取的影響[J].江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2010，26（2）：390-394.

[26] 張君堂，陶承光，王志剛，等.Trizol-A+試劑法提取百合總RNA[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009（2）：35-36.

[27] 丁勇，李濤，龔秀會(huì)，等.3種杜仲枝葉總RNA提取方法的比較[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，39（5）：29-31.

[28] 向蘭舟，胡婭晴，謝涵，等.擬南芥油體鈣蛋白基因CALEOSIN 3對(duì)脅迫環(huán)境及ABA誘導(dǎo)的響應(yīng)[J/OL].分子植物育種，2021-01-22[2021-04-27].http：//kns.cnki.net/kcms/detail/46.1068.S.2021，20210122.1218.004.html.

[29] 丁勇，陳慶波，徐春雷，等.油菜油體鈣蛋白基因BnClo1的克隆和表達(dá)[J].作物學(xué)報(bào)，2008，34（11）：1921-1928.0D9E048B-6BF5-4DF0-A58B-5397006E25A7

[30] ZHANG L，ZHANG C，WU P Z，et al.Global analysis of gene expression profiles in physic nut （Jatropha curcas L.） seedlings exposed to salt stress[J].PLoS One，2014，9（5）：1-9.

[31] JALALI K，KANCHARLA N，YEPURI V，et al.Exploitation of Hi-C sequencing for improvement of genome assembly and in-vitro validation of differentially expressing genes in Jatropha curcas L.[J].3 Biotech，2020，10（5）：307-321.

[32] HANANO A，ALKARA M，ALMOUSALLY I，et al.The peroxygenase activity of the Aspergillus flavus caleosin，AfPXG，modulates the biosynthesis of aflatoxins and their trafficking and extracellular secretion via lipid droplets[J].Frontiers in microbiology，2018，9：1-19.

[33] SONG W L，QIN Y J，ZHU Y，et al.Delineation of plant caleosin residues critical for functional divergence，positive selection and coevolution[J].BMC evolutionary biology，2014，14（1）：1-14.

[34] SHEN Y，XIE J，LIU R D，et al.Genomic analysis and expression investigation of caleosin gene family in Arabidopsis[J].Biochemical and biophysical research communications，2014，448（4）：365-371.

[35] LAMBERTI C，NEBBIA S，BALESTRINI R，et al.Identification of a caleosin associated with hazelnut （Corylus avellana L.） oil bodies[J].Plant biology，2020，22（3）：404-409.0D9E048B-6BF5-4DF0-A58B-5397006E25A7