楊詩雨，施泓如，王曉東，劉瑞妍，倪志翔，佟英偉，劉 成，李 翔，何長久

（華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院動(dòng)物醫(yī)學(xué)院／農(nóng)業(yè)動(dòng)物遺傳育種與繁殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室／國家級(jí)國際聯(lián)合研究中心，武漢 430070）

胚胎體外生產(chǎn)（IVP）既是人類輔助生殖的技術(shù)基礎(chǔ)，也是畜牧業(yè)中提高母畜繁殖潛力、加快品種改良及種質(zhì)資源保存的重要手段。胚胎發(fā)育效率是制約IVP技術(shù)推廣的核心因素。早期胚胎比較脆弱，極易受培養(yǎng)環(huán)境的影響，如滲透壓、溫度、pH值的微小改變都會(huì)影響胚胎質(zhì)量，甚至造成胚胎發(fā)育阻滯。因此，改進(jìn)培養(yǎng)液配方是優(yōu)化IVP技術(shù)的主要手段。無論是在生殖醫(yī)學(xué)還是畜牧生產(chǎn)中，被移植的大多是在體外發(fā)育至囊胚階段的胚胎，因?yàn)橄啾雀珉A段的胚胎，囊胚移植妊娠率較高。正因?yàn)槿绱?，囊胚發(fā)育率、囊胚孵化率及囊胚細(xì)胞數(shù)是評(píng)價(jià)IVP技術(shù)先進(jìn)性的核心指標(biāo)。近20年以來，科學(xué)家們一直在致力于改進(jìn)胚胎培養(yǎng)液的成分以提高胚胎存活率和囊胚發(fā)育率。

囊胚腔的形成是胚胎主動(dòng)攝入水分并儲(chǔ)存在內(nèi)部的結(jié)果。研究表明，桑椹胚細(xì)胞膜上的Na／K泵所營造的內(nèi)外滲透壓梯度差是胚胎攝入水分的主要?jiǎng)恿?。水分子通過自由擴(kuò)散或水通道蛋白介導(dǎo)的被動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)方式不斷進(jìn)入胚胎內(nèi)部，導(dǎo)致囊胚腔的形成與擴(kuò)張。c-型鈉鈦（CNP）是鈉鈦家族的主要成員，與心房鈉鈦和腦鈉肽具有相似的化學(xué)結(jié)構(gòu)。研究表明，CNP不僅參與泌尿系統(tǒng)與循環(huán)系統(tǒng)的水鈉轉(zhuǎn)運(yùn)，而且還能影響神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中水通道蛋白的表達(dá)。越來越多的證據(jù)表明，CNP還作為局部信號(hào)直接調(diào)控哺乳動(dòng)物生殖活動(dòng)。在雌性哺乳動(dòng)物中，CNP不僅可以維持卵母細(xì)胞減數(shù)分裂阻滯，而且還能促進(jìn)小鼠早期卵泡的發(fā)育。在雄性動(dòng)物中，CNP已被證實(shí)可以調(diào)節(jié)生精作用、精子運(yùn)動(dòng)和睪酮合成。有研究報(bào)道，CNP處理的牛卵母細(xì)胞，經(jīng)過體外受精或者孤雌激活，胚胎的囊胚率和質(zhì)量均得到了顯著提高。

鑒于CNP在生殖活動(dòng)中廣泛的調(diào)節(jié)作用，研究者在體外成熟液中添加CNP，顯著提高了卵母細(xì)胞的質(zhì)量。然而，CNP對(duì)胚胎體外發(fā)育的影響鮮有報(bào)道。研究表明，在胚胎和胎盤中均能檢測(cè)到CNP信號(hào)，并且妊娠期子宮中CNP基因表達(dá)水平比孕前會(huì)升高7倍左右。據(jù)此推測(cè)CNP可能參與了胚胎發(fā)育調(diào)控。為了驗(yàn)證這一推測(cè)，本試驗(yàn)以小鼠為模型，分別在2細(xì)胞胚胎和囊胚腔形成階段添加CNP，統(tǒng)計(jì)CNP對(duì)4細(xì)胞率、囊胚率、囊胚成腔率、囊胚腔擴(kuò)張率、囊胚孵化率、囊胚腔直徑、囊胚腔面積占比及囊胚總細(xì)胞數(shù)的影響，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

3周齡雌性昆明近交系小鼠40只，購自華中農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，飼養(yǎng)期間保持12 h／12 h的明暗周期變化（08：00—20：00光照），動(dòng)物房溫度保持22～26℃，自由飲水，自由采食。

1.2 主要試劑

孕馬血清促性腺激素（PMSG）、人絨毛膜促性腺激素（hCG），購自寧波第二激素廠；透明質(zhì)酸酶、KSOM培養(yǎng)液與石蠟油，購自Sigma-Aldrich（上海）貿(mào)易有限公司；DAPI、磷酸鹽緩沖液（PBS）、4%多聚甲醛與防熒光淬滅劑（DABCO），購自武漢塞維爾生物科技有限公司；CNP，購自Med Chem Express公司；卵母細(xì)胞操作液（M2液），購自北京邁晨科技公司。

1.3 主要儀器、設(shè)備

體視顯微鏡，NIKON公司產(chǎn)品；熒光正置顯微鏡，Olympus公司產(chǎn)品；CO細(xì)胞培養(yǎng)箱，Thermo Fisher Scientific公司產(chǎn)品；超凈工作臺(tái)，北京亞泰科隆儀器技術(shù)公司產(chǎn)品。以上儀器、設(shè)備均由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)動(dòng)物遺傳育種與繁殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

2 方法

2.1 小鼠超數(shù)排卵及配種

雌性小鼠腹腔注射PMSG 5 IU以促進(jìn)卵泡發(fā)育，46 h后再注射hCG 5 IU。隨后將其與性成熟雄性小鼠進(jìn)行1∶1合籠，并于次日檢查陰道栓以確定交配情況，檢查發(fā)現(xiàn)見栓30只，將其隨機(jī)分成兩批，其中15只小鼠用于2細(xì)胞／4細(xì)胞轉(zhuǎn)變階段添加CNP試驗(yàn)，另外15只用于桑椹胚階段添加CNP試驗(yàn)。

2.2 體內(nèi)受精卵的獲取與處理

在hCG注射22 h后，采用頸椎脫臼法處死見栓小鼠并分離輸卵管，在M2操作液中用注射器針頭扎破輸卵管膨大部以釋放受精卵。隨后使用0.3%透明質(zhì)酸酶溶液去除胚胎周圍多余卵丘細(xì)胞，將清洗完畢的受精卵轉(zhuǎn)移至KSOM 培養(yǎng)液中，并置于5%CO、37℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

2.3 胚胎培養(yǎng)

將CNP濃儲(chǔ)液按不同體積分別加到KSOM培養(yǎng)液中，最終CNP濃度為0（對(duì)照組）、100μg／L（1組）、200μg／L（2組）。采用微滴法進(jìn)行胚胎培養(yǎng)，每滴培養(yǎng)液50μL，用石蠟油封閉。當(dāng)胚胎發(fā)育至2細(xì)胞階段時(shí)，將2細(xì)胞隨機(jī)分配到對(duì)照組（17枚）、1組（20枚）、2組（21枚）微滴中繼續(xù)培養(yǎng)，隨后統(tǒng)計(jì)4細(xì)胞率與囊胚率。當(dāng)胚胎發(fā)育至致密桑椹胚階段時(shí)，將桑椹胚隨機(jī)分配到對(duì)照組（40枚）、1組（38枚）、2組（37枚）微滴中繼續(xù)培養(yǎng)，隨后統(tǒng)計(jì)囊胚成腔率、擴(kuò)張率、孵化率以及囊胚細(xì)胞數(shù)等指標(biāo)。

2.4 DAPI染色

使用多聚甲醛固定囊胚，將固定后的囊胚轉(zhuǎn)移到DAPI染色液中，室溫孵育10 min。用PBS清洗3次后將囊胚轉(zhuǎn)移至含防熒光猝滅劑的載玻片上，并于熒光顯微鏡下觀察拍照。

2.5 測(cè)定項(xiàng)目及數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析

為研究CNP對(duì)囊胚總細(xì)胞數(shù)的影響，對(duì)含不同濃度CNP的培養(yǎng)液中發(fā)育24 h的囊胚進(jìn)行DAPI染色，并拍照統(tǒng)計(jì)各組囊胚總細(xì)胞數(shù)。

將2細(xì)胞在不同濃度CNP的培養(yǎng)液中培養(yǎng)，24 h后統(tǒng)計(jì)4細(xì)胞率（4細(xì)胞數(shù)／2細(xì)胞數(shù)×100%）；72 h后統(tǒng)計(jì)囊胚率（囊胚數(shù)／2細(xì)胞數(shù)×100%］。桑椹胚在不同濃度CNP的培養(yǎng)液中培養(yǎng)24 h后統(tǒng)計(jì)囊胚成腔率（囊胚數(shù)／桑椹胚數(shù)）×100%］、囊胚擴(kuò)張率（擴(kuò)張囊胚數(shù)／桑椹胚數(shù)×100%）、囊胚腔面積占比（囊胚腔面積／囊胚總面積×100%）和囊胚腔直徑；48 h后統(tǒng)計(jì)孵化率（孵化囊胚數(shù)／桑葚胚數(shù)×100%）。

采用Image J軟件測(cè)量擴(kuò)張囊胚的直徑和囊胚腔面積，用IBM SPSSStatistics 24軟件對(duì)所得的數(shù)據(jù)進(jìn)行差異分析，用GraphPad Prism 8.0.2軟件作圖。多組數(shù)據(jù)間的顯著性比較采用單因素方差分析，百分率數(shù)據(jù)采用卡方檢驗(yàn)及Bonferroni方法進(jìn)行分析，＜0.05視為兩個(gè)數(shù)據(jù)間差異顯著。

3 結(jié)果與分析

試驗(yàn)首先確定了胚胎發(fā)育至各階段所需的時(shí)間。受精卵在體外培養(yǎng)24 h后發(fā)育至2細(xì)胞（見圖1A）；48 h后發(fā)育至4細(xì)胞（見圖1B）；72 h后發(fā)育至桑椹胚（見圖1C）；96 h后發(fā)育至囊胚（見圖1D），此刻可觀察到擴(kuò)張囊胚，即囊胚腔擴(kuò)張至囊胚總面積的1／2以上；120 h后發(fā)育至孵化囊胚（見圖1E）。

圖1 早期胚胎發(fā)育不同階段代表性圖片F(xiàn)ig.1 Representative images of different stages of early embryonic development

3.1 早期胚胎體外發(fā)育各階段的觀察

3.2 2／4細(xì)胞轉(zhuǎn)變階段添加CNP對(duì)胚胎發(fā)育的影響

將2細(xì)胞隨機(jī)分配到含CNP濃度為0，100，200μg／L的微滴中培養(yǎng)，24 h后統(tǒng)計(jì)4細(xì)胞發(fā)育率（2細(xì)胞在不同濃度CNP的培養(yǎng)液中培養(yǎng)24 h后的代表性圖片見圖2），72 h后統(tǒng)計(jì)囊胚率。結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，1組4細(xì)胞率無顯著差異（52.50% vs 68.42%，＞0.05），2組4細(xì) 胞 率 顯 著 降 低（33.3% vs 68.42%，＜0.05），見圖3A。1組和2組的胚胎均無法繼續(xù)發(fā)育至囊胚階段，見圖3B。

圖2 2細(xì)胞在不同濃度CNP的培養(yǎng)液中培養(yǎng)24 h后的代表性圖片F(xiàn)ig.2 Representative images of 2-cell cultured in different doses of CNP medium for 24 hours

圖3 2細(xì)胞／4細(xì)胞轉(zhuǎn)變階段添加CNP對(duì)胚胎發(fā)育的影響Fig.3 Effects of adding CNP on embryonic development at the transition stage from 2-cell to 4-cell

3.3 CNP對(duì)小鼠囊胚的成腔與擴(kuò)張的影響

桑椹胚在不同濃度CNP的培養(yǎng)液中培養(yǎng)的代表性圖片見圖4。與對(duì)照組相比，1組囊胚成腔率（83.10% vs 90.28%）、囊胚腔擴(kuò)張率（56.34% vs 66.67%）、孵化率（15.49% vs 15.28%）、囊胚腔面積占比（50.77% vs 51.99%）和囊胚腔直徑［（86.42±2.76）μm vs（95.29±4.13）μm］均無顯著差異（＞0.05）；而2組囊胚成腔率（43.78% vs 90.28%）、囊胚腔擴(kuò)張率（17.91% vs 66.67%）、孵化 率（4.48% vs 15.28%）、囊 胚 腔 面 積 占 比（38.15% vs 51.99%）和囊胚腔直徑［（73.30±3.22）μm vs（95.29±4.13）μm］均顯著降低（＜0.05），見圖5。

圖4 桑椹胚在不同濃度CNP的培養(yǎng)液中培養(yǎng)的代表性圖片F(xiàn)ig.4 Representative images of morula cultured in different doses of CNP medium

圖5 CNP對(duì)小鼠囊胚成腔與擴(kuò)張的影響Fig.5 Effects of CNP on the cavity formation and expansion of blastocysts in mouse

3.4 CNP對(duì)囊胚總細(xì)胞數(shù)的影響

DAPI染色代表性圖片見圖6。經(jīng)統(tǒng)計(jì)，1組（41.38±2.71 vs 55.12±3.06）和2組（38.29±2.47 vs 55.12±3.06）囊胚總細(xì)胞數(shù)與對(duì)照組相比均顯著下降（＜0.05），見圖7。

圖6 DAPI染色代表性圖片（標(biāo)尺＝50μm）Fig.6 Representative images of DAPI staining（scale bar＝50μm）

圖7 桑椹胚在CNP培養(yǎng)液中培養(yǎng)24 h時(shí)囊胚總細(xì)胞數(shù)Fig.7 The total number of blastocyst cells of morula cultured in CNP medium for 24 hours

4 討論與結(jié)論

小鼠胚胎早期發(fā)育過程中，合子基因組激活發(fā)生在2細(xì)胞階段，若合子基因組激活失敗，就會(huì)出現(xiàn)胚胎發(fā)育阻滯的現(xiàn)象。本試驗(yàn)中，CNP的添加導(dǎo)致2細(xì)胞向4細(xì)胞胚胎轉(zhuǎn)變的效率顯著下降，并且CNP組少數(shù)發(fā)育至4細(xì)胞的胚胎也無法完成后續(xù)發(fā)育。說明CNP對(duì)早期胚胎的卵裂可能具有廣泛的抑制作用，但CNP發(fā)揮上述抑制作用的機(jī)制尚不清楚。

囊胚腔形成的關(guān)鍵在于水分在胚胎內(nèi)部的積累，水分積累效率越高囊胚發(fā)育越快。因此，囊胚率、囊胚腔擴(kuò)張率、囊胚擴(kuò)張等級(jí)及囊胚孵化率可以作為囊胚質(zhì)量評(píng)估的形態(tài)學(xué)指標(biāo)。當(dāng)CNP濃度為100μg／L時(shí)，與CNP濃度為0相比，囊胚成腔率、囊胚腔擴(kuò)張率、囊胚腔面積占比和直徑均呈下降的趨勢(shì)，但是差異不顯著（＞0.05）；當(dāng)CNP濃度繼續(xù)升高至200μg／L時(shí)，囊胚成腔率、囊胚擴(kuò)張率、孵化率、囊胚腔直徑和囊胚腔面積占比繼續(xù)明顯下降，與CNP濃度為0相比差異顯著（＜0.05）。這說明在胚胎培養(yǎng)液中添加CNP對(duì)囊胚腔的形成也有抑制作用。相比于體外囊胚，體內(nèi)囊胚的總細(xì)胞數(shù)明顯更多。細(xì)胞數(shù)是評(píng)價(jià)胚胎細(xì)胞周期進(jìn)展能力和發(fā)育潛能的關(guān)鍵指標(biāo)，研究表明，發(fā)育潛能、著床率、活產(chǎn)率都隨著細(xì)胞數(shù)的增加而增加。細(xì)胞數(shù)降低的原因之一可能是發(fā)育停滯或遲緩導(dǎo)致細(xì)胞周期延長的結(jié)果。本試驗(yàn)中，添加CNP顯著降低囊胚總細(xì)胞數(shù)，這說明CNP對(duì)早期胚胎發(fā)育潛力具有抑制作用。

50年前，用于胚胎體外培養(yǎng)的培養(yǎng)基問世，經(jīng)過幾十年的探究，目前已經(jīng)具有比較成熟的胚胎培養(yǎng)系統(tǒng)，培養(yǎng)液能夠提供胚胎生長所必需的碳水化合物、氨基酸、無機(jī)鹽等營養(yǎng)物質(zhì)和滲透壓維持因子。有研究發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)液中添加生長因子或多肽有助于提高胚胎發(fā)育的質(zhì)量，比如添加表皮生長因子、類胰島素一號(hào)生長因子等能夠增加囊胚的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)數(shù)量，提高囊胚率。CNP不僅具有調(diào)節(jié)水鈉轉(zhuǎn)運(yùn)的功能，而且還能調(diào)控中樞神經(jīng)系統(tǒng)中水通道蛋白的表達(dá)。在小鼠妊娠過程中，在子宮中能檢測(cè)到CNP特異性的高表達(dá)。鑒于囊胚形成依賴于水分轉(zhuǎn)運(yùn)，因此筆者推測(cè)CNP可能影響囊胚腔的形成。最終的試驗(yàn)結(jié)果顯示CNP對(duì)胚胎體外發(fā)育表現(xiàn)為廣泛的抑制作用，并且主要體現(xiàn)在對(duì)卵裂的抑制上。但本研究尚不能排除CNP具有促進(jìn)囊胚成腔的可能性，因?yàn)镃NP對(duì)卵裂的抑制作用足以掩蓋CNP對(duì)囊胚腔形成的促進(jìn)作用。盡管CNP不具有提高胚胎體外發(fā)育效率的潛力，但本研究的意義在于闡明了CNP在早期胚胎發(fā)育過程中的作用，它可以作為一種有效的胚胎發(fā)育抑制劑。需要指出的是，本研究是采用外源添加的方式來評(píng)估CNP對(duì)體外胚胎發(fā)育的影響，并不清楚CNP信號(hào)缺失后胚胎所受到的影響。這一問題有待在未來的研究中借助基因編輯技術(shù)進(jìn)行深入探討。

本研究證實(shí)CNP不僅阻礙小鼠2細(xì)胞向4細(xì)胞胚胎的轉(zhuǎn)變，還抑制囊胚腔的形成與擴(kuò)張，降低囊胚質(zhì)量。說明CNP是一種早期胚胎發(fā)育的有效抑制分子。