甲魚蛋α-葡萄糖苷酶抑制肽及其納米運(yùn)載體的體外胃腸消化特性

肖 婷，裘樂(lè)蕓，王瑞艷，李 男，鄧澤元，鄭溜豐

（南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330047）

隨著經(jīng)濟(jì)發(fā)展和人們膳食結(jié)構(gòu)的改變，糖尿病發(fā)病率在全球范圍內(nèi)逐年遞增。據(jù)估計(jì)，2045年全球患病人數(shù)將超過(guò)7億。餐后血糖濃度過(guò)高是糖尿病前期患者的主要特征，持續(xù)性高血糖與-葡萄糖苷酶活性密切相關(guān)。-葡萄糖苷酶抑制劑可通過(guò)減緩碳水化合物的消化控制餐后血糖峰值，是臨床中的一線降糖藥物。近年來(lái)，多肽作為安全有效的-葡萄糖苷酶抑制劑備受關(guān)注。Yu Zhipeng等從雞蛋清水解物中分離得到具有-葡萄糖苷酶抑制活性的肽段，并證實(shí)RVPSLM的抑制活性效果最好，半抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC）為23.07 μmol/L。朱作藝等以蜂王漿粗蛋白為肽源制備-葡萄糖苷酶抑制肽，其IC為6.94 mg/mL。史加加用胃蛋白酶和胰蛋白酶水解西藏牦牛奶渣酪蛋白，得到的酶解液對(duì)-葡萄糖苷酶的抑制率達(dá)72%。甲魚蛋是制備-葡萄糖苷酶抑制肽的一種優(yōu)質(zhì)來(lái)源。Qiu Leyun等利用木瓜蛋白酶水解甲魚蛋，酶解液經(jīng)超濾得到的組分（分子質(zhì)量＜2.5 kDa）具有較強(qiáng)的-葡萄糖苷酶抑制能力，并從中鑒定出16種-葡萄糖苷酶抑制肽。

普遍認(rèn)為，生物活性肽在胃中易變性、易被蛋白酶降解，生物利用度被嚴(yán)重降低。因此，通常通過(guò)包埋活性肽，以避免肽在體內(nèi)發(fā)揮活性前被降解，從而延長(zhǎng)保留時(shí)間，提高吸收利用率。利用天然生物大分子的特性和納米技術(shù)聯(lián)合制備運(yùn)載體系對(duì)多肽類物質(zhì)進(jìn)行包埋，對(duì)提高生物活性肽的蛋白酶水解穩(wěn)定性，從而解決生物利用率低的問(wèn)題具有重要指導(dǎo)意義。外泌體是一類直徑在40～100 nm之間的囊泡樣小體，由于獨(dú)特的納米級(jí)結(jié)構(gòu)以及低免疫原性、高穩(wěn)定性、高運(yùn)載效率、靶向性和滲透性等優(yōu)勢(shì)，外泌體作為一種新型運(yùn)載體系已成為眾多研究者關(guān)注的焦點(diǎn)。Sun Dongmei等將姜黃素封裝在外泌體中，外泌體-姜黃素復(fù)合物的形成提高了姜黃素的溶解度、體外穩(wěn)定性、抗炎活性及體內(nèi)生物利用度。Fan Yue等發(fā)現(xiàn)小膠質(zhì)細(xì)胞分泌的外泌體是白藜蘆醇的優(yōu)良載體，包埋2 h后白藜蘆醇的體內(nèi)濃度增加，并且降解率低于30%。Wang Piaopiao等用外泌體作為紫杉醇的載體制備納米復(fù)合物，發(fā)現(xiàn)外泌體-紫杉醇對(duì)4T1荷瘤小鼠表現(xiàn)出較紫杉醇更強(qiáng)的抗腫瘤作用。固體脂質(zhì)納米顆粒（solid lipid nanoparticles，SLN）是20世紀(jì)90年代初發(fā)展的一種新型固體膠粒運(yùn)載體系，粒徑在40～1 000 nm。SLN理化性質(zhì)穩(wěn)定、生物利用度高、安全性高，同時(shí)能夠保護(hù)運(yùn)載物質(zhì)不被降解。Liu Mengyao等成功將葉黃素封裝在不同脂質(zhì)載體中并進(jìn)行體外模擬胃腸消化，發(fā)現(xiàn)SLN-葉黃素的體外生物利用度最高。Sacchetti等用SLN運(yùn)載一種親水性八肽LSCQLYQR，結(jié)果表明該肽在SLN中具有良好穩(wěn)定性且包埋率為23%。SLN可用作天然抗菌肽的良好載體，并保持抗菌活性長(zhǎng)達(dá)20 d。目前對(duì)外泌體的研究大多集中在分離提取、鑒定與表征方面，對(duì)SLN的研究主要為其顆粒特征，而將兩者用于包埋-葡萄糖苷酶抑制肽的研究鮮見報(bào)道。

實(shí)驗(yàn)前期已從甲魚蛋蛋白水解產(chǎn)物中分離鑒定出具有-葡萄糖苷酶抑制特性的潛在抗糖尿病寡肽SGTLLHK，其IC為289 μmol/L。考慮到寡肽進(jìn)入人體后面臨的復(fù)雜體內(nèi)環(huán)境會(huì)導(dǎo)致其生物利用率更低，難以發(fā)揮作用，為解決這一瓶頸問(wèn)題，本研究選用寡肽SGTLLHK作為實(shí)驗(yàn)材料，探究甲魚蛋-葡萄糖苷酶抑制肽的體外胃腸消化特性及其活性變化，并制備SGTLLHK-外泌體顆粒和SGTLLHK-SLN，以Zeta電位、粒徑、多分散性指數(shù)（polymer dispersity index，PDI）、包埋率為指標(biāo)，對(duì)比兩種多肽-納米顆粒包埋效果，并對(duì)其胃腸道穩(wěn)定性進(jìn)行研究，以期為甲魚蛋-葡萄糖苷酶抑制肽的納米化保護(hù)提供一定理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

寡肽SGTLLHK由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，純度達(dá)98%以上。

-葡萄糖苷酶（來(lái)源于酵母，50 U/mg） 上海源葉生物科技有限公司；胰蛋白酶（來(lái)源于豬胰腺，250 U/mg）、胃蛋白酶（來(lái)源于豬胃黏膜，3 000 U/mg）、對(duì)硝基苯基吡喃葡萄糖苷（4-nitrophenyl---glucopyranoside，-NPG）、甲酸（色譜級(jí)） 北京索萊寶科技有限公司；單硬脂酸甘油酯 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；泊洛沙姆188 德國(guó)巴斯夫股份公司；外泌體提取試劑盒（細(xì)胞培養(yǎng)基上清） 上海貝博生物科技公司；乙腈（色譜級(jí)） 美國(guó)Sigma公司；氫氧化鈉、乙醇、碳酸鈉 西隴化工股份有限公司；濃鹽酸 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SHZ-A水浴恒溫振蕩器 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司；JY-86-2-50型-80 ℃冰箱、Neofuge 15R型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) 香港力康發(fā)展有限公司；磁力攪拌器 鄭州亞榮儀器有限公司；SU8010掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope，SEM）日本日立公司；1100型高效液相色譜儀、超高效液相色譜-串聯(lián)四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜（ultra-high performance liquid chromatography-quadrupole time of flight mass spectrometry，UHPLC-QTOF-MS/MS）美國(guó)Agilent公司；AR1140電子分析天平 奧豪斯儀器有限公司；Nano-ZS Zetasizer粒徑分析儀 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；EXL800全自動(dòng)酶標(biāo)儀 美國(guó)BioTek Instruments有限公司。

1.3 方法

1.3.1 體外模擬胃腸消化

參照Minekus等的方法并稍作修改。稱取適量-葡萄糖苷酶抑制肽SGTLLHK用去離子水配成1 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液。取1 mL標(biāo)準(zhǔn)溶液加入1 mL胃蛋白酶溶液，用1 mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)pH值至1.8，混合均勻（體系最終酶活力2 000 U/mL），于37 ℃避光反應(yīng)2 h，收集胃消化液，90 ℃水浴10 min滅活蛋白酶，終止反應(yīng)，冷卻至室溫，將胃消化液于4 ℃、10 000 r/min離心10 min，收集上清液進(jìn)行測(cè)定。

在上述胃消化體系中繼續(xù)加入2 mL胰蛋白酶溶液，用1 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至7.0，充分混勻（體系最終酶活力100 U/mL），37 ℃避光反應(yīng)2 h，收集腸消化液，90 ℃水浴10 min滅酶，冷卻至室溫，將胃腸消化液于4 ℃、10 000 r/min離心10 min，收集上清液，-20 ℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 消化液中肽段的鑒定

參照Wang Xuefeng等的方法并稍作修改。將收集到的消化液通過(guò)Empore? SPE C小柱（6 mL）反相萃取脫鹽，然后冷凍干燥并用體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸溶液重懸，待UHPLC-QTOF-MS/MS進(jìn)行肽段序列的鑒定。

HPLC條件：流動(dòng)相A為體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸溶液，B為體積分?jǐn)?shù)84%乙腈溶液（含0.1%甲酸），Agilent RRHD Eclipse Plus C（2.1 mm×150 mm，1.8 μm）以95%的A相進(jìn)行平衡，流速0.3 mL/min。樣品由自動(dòng)進(jìn)樣器Zorbax 300SB-CPeptide Traps上樣，再經(jīng)過(guò)液相色譜柱分離，梯度洗脫：0～1 min，96% A、4% B；1～30 min，96%～50% A、4%～50% B；30～34 min，50%～0% A、50%～100% B；34～35 min，0% A、100% B；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量1 μL。

MS鑒定：電噴霧離子源；正離子模式；掃描范圍/100～1 800；碰撞能量30 eV；分析時(shí)長(zhǎng)60 min。質(zhì)譜測(cè)試原始文件用MaxQuant 1.5.5.1軟件檢索相應(yīng)數(shù)據(jù)庫(kù)，得到肽段鑒定及定量分析結(jié)果。查庫(kù)相關(guān)參數(shù)：允許最大漏切位點(diǎn)數(shù)2；固定修飾Carbamidomethyl（C）；可變修飾Oxidation（M）；一級(jí)離子質(zhì)量容差2×10；二級(jí)離子質(zhì)量容差0.1 Da；錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率0.01。根據(jù)MaxQuant 中基于強(qiáng)度的絕對(duì)定量對(duì)鑒定的肽豐度進(jìn)行量化。通過(guò)MS鑒定到的-葡萄糖苷酶抑制原肽及其產(chǎn)物的比例確定消化率。

1.3.3 消化液的-葡萄糖苷酶抑制活性測(cè)定

參照Yu Zhipeng等的方法并稍作修改。移取100 μL胃腸消化液與50 mL-葡萄糖苷酶溶液（0.35 U/mL）充分混合均勻，于37.5 ℃孵育20 min后，再加入100 μL 1 mmol/L-NPG，繼續(xù)37.5 ℃孵育20 min，加入1 mol/L NaCO溶液終止反應(yīng)，于410 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。用100 μL去離子水作為對(duì)照，-葡萄糖苷酶抑制率按式（1）計(jì)算：

1.3.4 多肽-SLN的制備

參照Chai Guihong等的方法并稍作修改。稱取50 mg單硬脂酸甘油酯，溶解于50 mL無(wú)水乙醇中，在70 ℃水浴下磁力攪拌至均勻，加入50 mg寡肽SGTLLHK和50 mL 0.1%泊洛沙姆188，70 ℃、400 r/min繼續(xù)攪拌5 min。然后室溫放置使乙醇充分揮發(fā)，調(diào)節(jié)pH值至1.2，4 200 r/min離心20 min，取25 mL離心后的溶液加入50 mL 0.1%泊洛沙姆188中，經(jīng)超聲處理（超聲2 s、間隙3 s，重復(fù)20 次）形成均勻白色乳液。將乳液于4 200 r/min離心20 min，獲得上清液，即為SGTLLHK-SLN。

1.3.5 多肽-外泌體納米顆粒的制備

1.3.5.1 外泌體的提取

參照外泌體提取試劑盒說(shuō)明書提取牛乳外泌體。取-80 ℃貯藏牛乳于25 ℃恒溫水浴鍋解凍，完全解凍后移取10 mL于4 ℃、3 000 r/min離心20 min，去除大部分細(xì)胞和碎片。收集的上清液加入5 mL外泌體提取試劑，渦旋充分混合均勻后于4 ℃放置過(guò)夜。孵育后將提取液于4 ℃、10 000 r/min離心60 min，移去上清液，收集離心管底部的外泌體沉淀，用1 mL磷酸鹽緩沖液重懸，于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.5.2 外泌體的特征分析

用去離子水稀釋外泌體，配成質(zhì)量濃度為1 mg/mL的懸液。取1 mL置于一次性毛細(xì)管中，使用粒徑分析儀測(cè)定外泌體Zeta電位、粒徑、PDI。測(cè)定3 次取平均值。

將外泌體冷凍干燥后用SEM觀察。

取100 μL外泌體懸液，加入20 μL 6×上樣緩沖液，渦旋混勻后沸水浴5 min使蛋白變性，冷卻至室溫。配制12%的分離膠和4%的濃縮膠進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE），上樣量10 μL，在70 V下使條帶分離至濃縮膠與分離膠交界處，再在120 V下電泳至分離膠底部。

1.3.5.3 多肽-外泌體顆粒的制備

取0.2 mL外泌體懸液，加入1 mg寡肽SGTLLHK渦旋混合均勻后，經(jīng)超聲處理（超聲30 s、間隙90 s，重復(fù)6 次），將超聲后溶液于37 ℃下孵育60 min，回收外泌體膜。

1.3.6 多肽-納米顆粒包埋率的測(cè)定

采用HPLC法測(cè)定游離肽含量計(jì)算多肽-納米顆粒包埋率。Waters XBridg BEH SEC色譜柱（7.8 mm×300 mm，3.5 μm），二極管陣列檢測(cè)器，流動(dòng)相A為體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸溶液，流動(dòng)相B為體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸-乙腈，柱溫30 ℃，流速0.8 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)214 nm，進(jìn)樣量10 μL。梯度洗脫條件為：0～3 min，98% A、2% B；3～6 min，98%～97% A、2%～3% B；6～9 min，97% A、3% B；9～15 min，97%～96% A、3%～4% B；15～18 min，96% A、4% B；18～21 min，96%～95% A、4%～5% B。肽包埋率按式（2）計(jì)算：

式中：、分別為包埋前后肽峰面積。

1.3.7 多肽-納米顆粒的特征分析

方法同1.3.5.2節(jié)。

1.3.8 多肽-納米顆粒的消化特性

方法同1.3.1和1.3.2節(jié)。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 α-葡萄糖苷酶抑制肽在體外模擬胃腸消化過(guò)程中的變化

活性肽在消化過(guò)程中會(huì)因pH值的急劇變化活性部分降低或喪失。因此，生物活性肽在模擬胃腸消化過(guò)程中的穩(wěn)定對(duì)其在體內(nèi)發(fā)揮正常的生理作用具有重要意義。通過(guò)分析胃腸道消化過(guò)程中肽段降解情況，從而確定多肽活性降低的具體消化階段，可有針對(duì)性地保護(hù)肽段減少活性損失。如圖1所示，原肽SGTLLHK在8.39 min左右出峰，經(jīng)過(guò)模擬胃消化階段后，胃消化產(chǎn)物在8.42 min左右出峰，經(jīng)腸道消化后，峰右移，出峰時(shí)間為8.46 min。說(shuō)明胃、小腸均對(duì)寡肽SGTLLHK有一定的消化作用且生成新的消化產(chǎn)物。

圖1 SGTLLHK體外模擬胃（A）、腸道（B）消化的液相色譜圖Fig. 1 HPLC profiles of SGTLLHK during in vitro simulated gastric (A) and gastrointestinal (B) digestion

2.2 胃腸消化產(chǎn)物的質(zhì)譜鑒定

如圖2所示，多肽MS/MS碎片離子主要為b離子和y離子。與譜庫(kù)比對(duì)，SGTLLHK的胃消化產(chǎn)物共鑒別出2個(gè)序列，分別為SGTLL（Ser-Gly-Thr-Leu-Leu）和GTLL（Gly-Thr-Leu-Leu）；結(jié)合圖3可知，SGTLLHK在胃消化階段被完全酶解成SGTLL和GTLL，其中SGTLL比例較高（占94.5%），而在腸消化階段后僅存在SGTLL。說(shuō)明-葡萄糖苷酶抑制肽SGTLLHK在胃消化階段已被完全分解，可能是因?yàn)槲傅鞍酌竷?yōu)先切割疏水性氨基酸，而SGTLLHK內(nèi)部含有兩個(gè)Leu，導(dǎo)致其對(duì)胃消化耐受性極低。

圖2 SGTLLHK消化產(chǎn)物SGTLL（A）、GTLL（B）二級(jí)質(zhì)譜圖Fig. 2 ESI-MS/MS spectra of SGTLL (A) and GTLL (B) from the digestion products of SGTLLHK

圖3 SGTLLHK主要消化產(chǎn)物占比Fig. 3 Proportions of major digestion products of SGTLLHK

2.3 消化后SGTLLHK的α-葡萄糖苷酶抑制活性

如圖4所示，胃消化結(jié)束后消化液的-葡萄糖苷酶抑制活性顯著升高，達(dá)到54.05%，而經(jīng)腸消化后顯著降低（＜0.05），且低于未消化時(shí)。說(shuō)明胃消化后肽段具有更好的-葡萄糖苷酶抑制能力，而腸消化產(chǎn)物抑制活性反而較低。氨基酸組成和結(jié)構(gòu)決定多肽的生物活性。-葡萄糖苷酶抑制肽的活性可能與疏水性氨基酸含量有關(guān)，抑制-葡萄糖苷酶的多肽序列中疏水性氨基酸含量較高。Wang Rongchun等分析3種蛋白經(jīng)堿性蛋白酶水解后的氨基酸組成，發(fā)現(xiàn)大豆蛋白酶解液中Pro（4.06%）、Tyr含量（2.59%）明顯高于乳清蛋白和綠豆蛋白酶解液，且具有較高的-葡萄糖苷酶抑制活性（53.79%）。Zong Yafeng等研究-酪啡肽7（YPFPGPI）的降血糖功能，發(fā)現(xiàn)該肽會(huì)抑制小腸對(duì)葡萄糖的吸收，且主要由疏水性氨基酸組成。SGTLLHK受到胃蛋白酶切割，可能導(dǎo)致肽鏈內(nèi)部某些疏水性基團(tuán)暴露，其主要通過(guò)疏水性相互作用與-葡萄糖苷酶結(jié)合，從而產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)性抑制。因此，本研究經(jīng)胃蛋白酶消化后SGTLLHK的-葡萄糖苷酶抑制活性顯著增強(qiáng)，而經(jīng)胰蛋白酶作用后，-葡萄糖苷酶抑制活性顯著下降，推測(cè)可能是由于疏水性氨基酸含量降低，但還需進(jìn)一步研究。綜上，為使原肽SGTLLHK避免被胃液破壞且能到達(dá)小腸發(fā)揮對(duì)-葡萄糖苷酶的抑制作用，本實(shí)驗(yàn)選擇納米顆粒對(duì)該肽進(jìn)行包埋，提高活性肽在胃腸消化過(guò)程中的穩(wěn)定性。

圖4 消化后SGTLLHK的α-葡萄糖苷酶抑制活性Fig. 4 α-Glucosidase inhibitory activity of SGTLLHK after digestion

2.4 牛乳外泌體的特征鑒定

圖5 牛乳-外泌體的SEM（A）、SDS-PAGE（B）和粒徑分布（C）表征Fig. 5 SEM image (A), SDS-PAGE pattern (B) and particle size distribution (C) of milk-derived exosomes

牛乳成分復(fù)雜，含量豐富的脂質(zhì)以脂肪球的形式大量存在，脂肪球與外泌體某些性質(zhì)相似，此外還含有大量酪蛋白，其密度與外泌體密度十分接近。由表1可知，外泌體的Zeta電位為（-18.43±2.16）mV、粒徑為（137.7±3.50）nm，PDI為0.13±0.02，呈較窄的分布范圍。由圖5可知，外泌體納米顆粒表面光滑，形狀呈球狀且尺寸不均一，粒徑在70～400 nm之間，峰值單一。乳源外泌體表征幾乎均呈簡(jiǎn)單球形，且大部分粒徑分布在30～200 nm。從SDS-PAGE圖可以看出外泌體主要有6個(gè)明顯條帶，在76 kDa左右有明顯的乳鐵蛋白條帶，其他條帶可能為外泌體膜表面和外泌體內(nèi)的蛋白質(zhì)。

表1 牛乳外泌體的特性Table 1 Properties of cow milk-derived exosomes

2.5 多肽-納米顆粒的包埋效果及特征

如圖6所示，SLN和外泌體包埋后寡肽峰面積均明顯減小，在SGTLLHK-SLN包埋體系中僅能檢測(cè)到一小部分肽。SGTLLHK-外泌體納米顆粒包埋率為31.98%，而SGTLLHK-SLN包埋率為96.05%。

圖6 SGTLLHK-外泌體（A）和SGTLLHK-SLN（B）的HPLC圖Fig. 6 HPLC profiles of SGTLLHK-exosomes (A) and SGTLLHK-SLN (B)

表2 SLN、SGTLLHK、SGTLLHK-SLN和SGTLLHK-外泌體的特性Table 2 Properties of SLN, SGTLLHK, SGTLLHK-SLN and SGTLLHK-exosomes

如表2所示，SGTLLHK的Zeta電位為（2.43±0.32）mV，SGTLLHK-SLN的Zeta電位降低至（-10.56±0.78）mV，SGTLLHK-外泌體的Zeta電位降低至（-12.03±0.59）mV。Zeta電位是評(píng)價(jià)納米顆粒體系穩(wěn)定性的重要指標(biāo)，反映了顆粒表面的凈電荷數(shù)量，凈電荷多發(fā)生靜電排斥時(shí)不易聚集，說(shuō)明體系越穩(wěn)定。因此，SGTLLHK-外泌體顆粒體系較SGTLLHK-SLN具有較高穩(wěn)定性。

在高于油相熔點(diǎn)的溫度下得到O/W納米乳液（或乳液），隨后進(jìn)行冷卻促進(jìn)脂質(zhì)微滴結(jié)晶生產(chǎn)SLN。據(jù)報(bào)道由單硬脂酸甘油酯制成的SLN粒徑在1 000 nm以內(nèi)，本研究中制備的SLN粒徑為（535.93±16.84）nm。納米顆粒粒徑越小，穩(wěn)定性更好。SGTLLHK-外泌體粒徑僅為（125.87±2.66）nm，遠(yuǎn)小于SGTLLHK-SLN（（558.83±3.33）nm）和SLN（（535.93±16.84）nm），與Zeta電位結(jié)果一致。SGTLLHK-SLN粒徑較大，穩(wěn)定性較低，可能是因?yàn)榈玫降腛/W納米乳液體系在親水性生物活性肽或蛋白包封后容易聚集，可能會(huì)使肽或蛋白質(zhì)逃逸。而SGTLLHK-外泌體粒徑較小，穩(wěn)定性較好，可能是因?yàn)樗苄陨锘钚噪谋话庠谕饷隗w囊泡的親水性核心中。

當(dāng)PDI＜0.4時(shí)，說(shuō)明懸浮液有良好的穩(wěn)定性，而高PDI值會(huì)引起懸浮液中顆粒或液滴聚集、絮凝。本研究中，SLN的PDI值為0.31±0.04，SGTLLHKSLN和SGTLLHK-外泌體的PDI值分別為0.46±0.01和0.17±0.01。

以上結(jié)果表明，寡肽SGTLLHK成功包埋于SLN和外泌體中，并且SGTLLHK-外泌體納米顆粒體系更穩(wěn)定。

如圖7所示，包埋前，-葡萄糖苷酶抑制肽SGTLLHK形狀大多為片狀，而用SLN和外泌體包埋后均呈圓滑的顆粒球狀，此外，明顯觀察到SGTLLHK-SLN顆粒較大，且出現(xiàn)聚集現(xiàn)象，外泌體包埋后體系顆粒較小，極少有聚集。綜上所述，SGTLLHK-外泌體顆粒體系在懸浮液中具有高度穩(wěn)定性。

圖7 SGTLLHK（A）、SGTLLHK-SLN（B）和SGTLLHK-外泌體（C）的SEM圖Fig. 7 SEM images of SGTLLHK (A), SGTLLHK-SLN (B) and SGTLLHK-exosomes (C)

2.6 多肽-外泌體和多肽-SLN體外模擬胃腸道的消化特性

乳液的穩(wěn)定性及其在胃腸道中的消化特性取決于其粒徑大小，盡管SGTLLHK-外泌體和SGTLLHK-SLN納米顆粒在懸浮液中均具有良好的穩(wěn)定性，但對(duì)環(huán)境脅迫（如pH值的急劇變化、鹽離子濃度及各種胃腸道蛋白酶）仍較為敏感。如圖8所示，SGTLLHK-外泌體顆粒有兩個(gè)明顯的峰，其中寡肽SGTLLHK在8.9 min出峰。經(jīng)胃消化階段，肽峰強(qiáng)度沒(méi)有明顯減小，根據(jù)峰面積計(jì)算得出此階段的肽保留率為93.65%，這說(shuō)明SGTLLHK-外泌體能夠在強(qiáng)pH值胃酸環(huán)境下穩(wěn)定存在并保護(hù)寡肽SGTLLHK不被降解。繼續(xù)腸道消化后，在8.9 min處肽峰強(qiáng)度降低，而11.56 min處的峰強(qiáng)度升高，此階段的肽保留率較高，為72.52%，說(shuō)明在腸液中性環(huán)境下，少部分肽從外泌體納米顆粒中逃逸。Sun Dongmei等將姜黃素-外泌體于37 ℃水浴中避光孵育150 min后，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)大部分姜黃素免受降解，保留率達(dá)80%。Fan Yue等發(fā)現(xiàn)經(jīng)外泌體封裝的白藜蘆醇在處理2 h后約70%白藜蘆醇被保留，而游離白藜蘆醇在前25 min內(nèi)迅速被降解。綜上，SGTLLHK-外泌體具有一定的耐胃腸消化特性，這一特性能夠改善-葡萄糖苷酶抑制肽SGTLLHK生物可利用度低的問(wèn)題。

圖8 SGTLLHK-外泌體模擬胃腸消化前后的HPLC圖Fig. 8 HPLC profiles of SGTLLHK-exosomes during in vitro digestion

如圖9所示，SGTLLHK-SLN中寡肽SGTLLHK在9.5 min左右出峰，在模擬胃消化階段，根據(jù)峰面積進(jìn)行計(jì)算得到SGTLLHK-SLN具有較高的肽保留率（88.37%），這一部分損失主要為SLN顆粒表面聚集的肽，一旦與胃液接觸便可引起其降解，說(shuō)明SLN可以有效保護(hù)SGTLLHK免于胃中蛋白酶的降解。然而，SGTLLHK在腸消化階段的保留率僅為48.43%，表明SGTLLHK-SLN納米顆粒能在腸道中存在，但對(duì)寡肽的保留率低于SGTLLHK-外泌體。綜上，外泌體納米顆粒對(duì)-葡萄糖苷酶抑制肽SGTLLHK的保護(hù)作用優(yōu)于SLN納米顆粒。

圖9 SGTLLHK-SLN模擬胃腸消化前后的HPLC圖Fig. 9 HPLC profiles of SGTLLHK-SLN during in vitro digestion

3 結(jié) 論

甲魚蛋-葡萄糖苷酶抑制肽SGTLLHK不耐胃腸道消化，其在胃消化階段就已被完全降解成兩種產(chǎn)物SGTLL和GTLL，胃消化液的-葡萄糖苷酶抑制活性顯著上升。GTLL經(jīng)后續(xù)腸消化完全被降解，而SGTLL耐腸消化，胃腸消化液的-葡萄糖苷酶抑制顯著下降，且低于原肽抑制能力。牛乳外泌體和SLN均能成功包埋SGTLLHK，且SGTLLHK-外泌體在模擬胃腸道消化中的穩(wěn)定性優(yōu)于SGTLLHK-SLN。本研究為甲魚蛋-葡萄糖苷酶抑制肽的保護(hù)提供了理論依據(jù)。