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      超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法快速檢測麥類中典型鏈格孢霉毒素

      2022-07-07 03:05:16邢家溧鄭睿行張愛芝毛玲燕徐曉蓉婁永江穆應(yīng)花
      食品科學(xué) 2022年12期
      關(guān)鍵詞:三氯甲烷甲酸乙腈

      吳 希,邢家溧,鄭睿行,張愛芝,毛玲燕,徐曉蓉,婁永江,穆應(yīng)花

      (1.寧波大學(xué)食品與藥學(xué)學(xué)院,浙江 寧波 315211;2.寧波市產(chǎn)品食品質(zhì)量檢驗研究院(寧波市纖維檢驗所),浙江 寧波 315048)

      鏈格孢霉毒素(toxins,ATs)是鏈格孢霉菌產(chǎn)生的次級代謝物,最為典型的有鏈格孢酚(alternariol,AOH)、交鏈格孢酚單甲醚(alternariol monomethyl ether,AME)、交鏈孢烯(altenuene,ALT)、細(xì)交鏈格孢菌酮酸(tenuazonic acid,TeA)、交鏈孢毒素I(altertoxin I,ATX-I)、騰毒素(tentoxin,Ten)和細(xì)格菌素(altenusin,ALS)。這些毒素在自然界中廣泛存在,會侵染谷物導(dǎo)致作物減產(chǎn),還能污染后續(xù)的加工產(chǎn)品造成經(jīng)濟損失。ATs具有急慢性毒性以及三致效應(yīng)(致癌、致畸、致突變),對人體健康構(gòu)成嚴(yán)重威脅。

      麥類作物易受ATs污染,Siegel等在蕎麥粉中檢出TeA含量高達(dá)851 μg/kg;何玲等在調(diào)查四川省市售小麥及其制品中ATs污染情況時,在小麥及其制品檢出AOH、AME、TeA和Ten含量分別為0.75、0.57、27.2 μg/kg和4.78 μg/kg;Asam等在調(diào)查嬰兒谷物產(chǎn)品中的ATs污染情況時,在小麥、燕麥、黑麥產(chǎn)品中檢出TeA含量為8~30 μg/kg。隨著ATs危害逐漸明晰,人們的風(fēng)險防范意識也逐步加強,但因缺乏準(zhǔn)確的檢測分析方法和系統(tǒng)性的風(fēng)險評估數(shù)據(jù),鮮見ATs的相關(guān)法規(guī)與限量標(biāo)準(zhǔn),目前我國僅有1 項ATs的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn),但應(yīng)用范圍只限于部分果蔬。因此,要盡快建立簡單、快速、高效、靈敏的ATs檢測方法,推動我國麥類中ATs殘留水平的控制、檢測標(biāo)準(zhǔn)的制定和管理措施的采取。

      目前,ATs的主要檢測技術(shù)有薄層色譜(thin layer chromatography,TLC)法、酶聯(lián)免疫檢測(enzymelinked immunosorbent assay,ELISA)法、氣相色譜(gas chromatography,GC)和氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(gas chromatography-tandem mass spectrometry,GC-MS/MS)法、高效液相色譜(high performance liquid chromatography,HPLC)法和超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(ultra-high performance liquid chromatographytandem mass spectrometry,UPLC-MS/MS)法等。TLC與ELISA法操作繁瑣且靈敏度低,ATs穩(wěn)定性好而揮發(fā)性差在GC和GC-MS/MS檢測方法中受到限制。UPLC-MS/MS具有高靈敏度及高選擇性等優(yōu)點,近年來對ATs的分析主要集中在UPLC-MS/MS的研究和應(yīng)用方面。但目前麥類中ATs的研究大多集中于單一或幾種毒素的檢測,如Siegel等利用UPLC-MS/MS檢測蕎麥粉中TeA,檢出限為10 μg/kg;何玲等利用HPLC結(jié)合熒光檢測器同時檢測小麥中的AOH、AME、TeA、Ten毒素,檢出限為0.2~1.0 μg/kg;Asam等用UPLC-MS/MS法測定小麥、燕麥、黑麥中的TeA,檢出限為1 μg/kg。另外,為了進(jìn)一步提高檢測效果,目前報道了多種ATs的提取和富集方法,包括QuEChERS法和固相萃取方法。但這些方法雖然前處理簡單,靈敏度高,但檢出限高,只能同時檢測少數(shù)幾種ATs。

      基于以上研究現(xiàn)狀,本研究擬采用具有操作簡單、富集倍數(shù)高、有機溶劑用量少、成本低廉等優(yōu)點的分散液-液微萃取(dispersive liquid-liquid microextraction,DLLME)方法,快速富集和凈化麥類中7種ATs,再結(jié)合UPLC-MS/MS技術(shù),實現(xiàn)麥類中7種ATs的快速定性和定量測定。這將為麥類中ATs的污染狀況研究提供方法依據(jù),也為我國食品中ATs限量標(biāo)準(zhǔn)的制定提供技術(shù)支持。

      1 材料與方法

      1.1 材料與試劑

      麥類樣品購于當(dāng)?shù)爻?,磨碎?00 r/min,5 min),過篩(40 目),于0 ℃條件下保存。

      甲醇、乙腈、甲酸、乙酸乙酯、氯苯、二氯甲烷、三氯甲烷(均為色譜純) 美國Sigma公司;無水硫酸鎂、氯化鈉(均為分析純) 國藥集團化學(xué)試劑有限公司;毒素標(biāo)準(zhǔn)品:AOH、AME、ALT、TeA、ATX-I、Ten和ALS(純度均≥98%) 上海安譜實驗科技股份有限公司。

      1.2 儀器與設(shè)備

      Xevo TQ-XS三重四極桿質(zhì)譜儀、BEH C色譜柱(50 mm×2.1 mm,1.7 μm)、HSS T色譜柱(50 mm×2.1 mm,1.8 μm) 美國Waters公司;X1R高速離心機 美國賽默飛世爾科技公司;TGL-20M高速臺式冷凍離心機 上海盧湘儀離心機儀器有限公司;TurboVap? LV多功能全自動樣品濃縮儀 上海Biotage有限公司;Milli-Q型超純水機(電阻率為18.2 MΩ·cm)美國Millipore公司;IKA-Vortexd2旋渦混合器 德國IKA(艾卡)儀器設(shè)備有限公司;Multi Reax-Heidolph多管漩渦振蕩器 德國海道夫儀器設(shè)備有限公司;ME-204電子分析天平(精度為0.000 1 g) 梅特勒-托利多儀器有限公司;KS-300EI超聲波清洗機 寧波科生設(shè)備有限公司。

      1.3 方法

      1.3.1 溶液配制

      標(biāo)準(zhǔn)儲備液:分別準(zhǔn)確稱取AOH、AME、ALT、TeA、ATX-I、Ten和ALS標(biāo)準(zhǔn)品0.001 g(精確至0.000 1 g)溶于10 mL乙腈中,配制成質(zhì)量濃度為100 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)混合液,取100 μL標(biāo)準(zhǔn)混合液(100 mg/L),并用乙腈溶解定容至10 mL棕色進(jìn)樣瓶中,得到質(zhì)量濃度為1 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲備液,密封后置于-20 ℃保存、備用。

      標(biāo)準(zhǔn)工作液:用乙腈-水(1∶1,/)將標(biāo)準(zhǔn)儲備液逐級配制成質(zhì)量濃度分別為0.5、1、2、5、10、20、50、100 μg/L的7種ATs的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

      基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作液:用空白基質(zhì)溶液逐漸稀釋1 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液,制備成10 μg/L的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作液。

      1.3.2 提取和凈化

      準(zhǔn)確稱取1 g樣品(精確至0.01 g),置于50 mL的螺口尖底離心管中,加入3 mL一級水、10 mL1.5%甲酸乙腈-甲醇(4∶1,/)提取劑,渦旋3 min。加入2 g無水MgSO、1 g NaCl在40 ℃下超聲5 min、振蕩提取15 min,9 500 r/min、4 ℃離心10 min,取1 mL上清液。

      加入100 μL三氯甲烷萃取劑、5 mL的1.5 g/L氯化鈉溶液、0.4%甲酸溶液(/),4 500 r/min離心5 min,取下清液,氮吹濃縮至干,用甲醇溶液復(fù)溶至1 mL,過0.22 μm有機濾膜,待UPLC-MS/MS分析。

      1.3.3 分析條件

      BEH C色譜柱(50 mm×2.1 mm,1.7 μm);柱溫為40 ℃;流動相:A為0.1%甲酸溶液(/),B為乙腈;流速0.40 mL/min;進(jìn)樣體積5 μL;梯度洗脫程序:0~5.0 min,90%~5% A、10%~95% B;5.0~7.0 min,5% A、95% B;7.0~7.5 min,5%~90% A、95%~10% B;7.5~10.0 min,90% A、10% B。

      電噴霧離子源(electrospray ionization,ESI),正負(fù)離子模式掃描;毛細(xì)管電壓1.08 kV;錐孔電壓25 V;射頻透鏡1和射頻透鏡2的電壓均為15.0 V;離子源溫度150 ℃;脫溶劑溫度600 ℃;脫溶劑氣流量1 000 L/h;錐孔反吹氣流量150 L/h;多反應(yīng)監(jiān)測(multiple reaction monitoring,MRM)模式。7種ATs的保留時間和質(zhì)譜參數(shù)見表1。

      表1 MRM模式下7種ATs的保留時間和質(zhì)譜測定參數(shù)Table 1 Retention time and mass spectral parameters for the seven ATs in MRM mode

      2 結(jié)果與分析

      2.1 儀器條件的優(yōu)化

      2.1.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

      取7種目標(biāo)物的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(100 μg/L),分別以自動進(jìn)樣的方式在全掃檢測模式下進(jìn)行質(zhì)譜條件優(yōu)化。結(jié)果顯示ATX-I在ESI模式掃描下不成峰,而在ESI模式掃描時響應(yīng)值較高(圖1),且峰形尖銳,剩下6種ATs在ESI模式得到的離子峰的響應(yīng)值更佳。通過子離子掃描得到目標(biāo)物碎片化離子信息,選擇最強的產(chǎn)物離子和次強的產(chǎn)物離子分別作為7種ATs的定性和定量離子,并對錐孔電壓、碰撞電壓、離子源溫度、脫溶劑氣體溫度、碰撞氣體流量質(zhì)譜參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。實驗優(yōu)化的質(zhì)譜條件,使每種靶物質(zhì)得到最佳電離效率(表1)。

      圖1ATX-I毒素的離子對質(zhì)譜圖Fig. 1 Ion pair mass spectra of ATX-I

      2.1.2 色譜條件的優(yōu)化

      分別選擇純水-乙腈和0.1%甲酸-乙腈溶液(/)作為流動相,比較2個流動相體系對分離效果的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn),在純水流動相中TeA毒素會出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象,而純水加入0.1%甲酸溶液(/)有利于抑制真菌毒素與色譜柱的靜電作用,避免拖尾現(xiàn)象,TeA毒素峰形對稱性明顯得到改善。因此本實驗最終選擇0.1%甲酸-乙腈溶液作為流動相。

      取質(zhì)量濃度為100 μg/L的7種目標(biāo)物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,以0.1%甲酸-乙腈溶液作為流動相,按表1進(jìn)行梯度洗脫,在保持濃度、流速、進(jìn)樣量等參數(shù)一致的條件下,考察HSS T(50 mm×2.1 mm,1.8 μm)和BEH C(50 mm×2.1 mm,1.7 μm)這2種色譜柱對7種ATs的分離效果以及每種毒素的峰形、保留時間。結(jié)果顯示BEH C分離效果優(yōu)于HSS T,7種ATs在BEH C柱上能獲得更好的峰形和檢測靈敏度,且BEH C具有廣譜性、次級相互作用較低,pH值耐受范圍寬(pH 1~12),柱效更高,峰形尖銳等優(yōu)點,故選擇BEH C作為分析柱。

      同時對流速、柱溫及梯度洗脫程序進(jìn)行優(yōu)化,確定流速為0.4 mL/min;柱溫為40 ℃;由于7種ATs具有不同的極性,ALT的極性較強,AME的極性較弱,為了兼顧7種ATs能同時出現(xiàn)良好峰形,需要對流動相進(jìn)行較大的梯度變化,通過不斷調(diào)整,確定的洗脫程序見1.3.3節(jié)。在最優(yōu)條件下得到的7種ATs色譜圖見圖2,可以看出7種ATs在5 min內(nèi)可較好分離。

      圖2 優(yōu)化條件下6種ATs的正離子圖(A)和ATX-I的負(fù)離子圖(B)Fig. 2 Positive ion chromatograms of six ATs (A) and negative ion chromatogram of ATX-I under the optimized conditions (B)

      2.2 提取液的優(yōu)化

      ATs易溶于甲醇與乙腈,其中TeA的酸性和極性較強,需在提取劑中加入適量的酸,1.5%甲酸最有利于TeA的提取。研究比較1.5%甲酸-乙腈(/)、1.5%甲酸乙腈-甲醇的不同比例對7種ATs提取效果的影響,結(jié)果表明,添加甲醇對ATX-I的提取效果影響明顯,對比1.5%甲酸-乙腈(/)提取體系,ATX-I的回收率在1.5%甲酸乙腈-甲醇(4∶1,/)體系中提升10%,這也與暢彤等研究適量的甲醇有利于ATX-I提取一致;甲酸的添加有利于TeA的提取,在1.5%甲酸-乙腈(/)提取體系中回收率高達(dá)92%;1.5%甲酸乙腈-甲醇比例從1∶4到4∶1,小麥樣品的提取液顏色由深黃色變?yōu)闇\黃色,猜測色素這一干擾物對實驗的干擾在減小。1.5%甲酸乙腈-甲醇(4∶1,/)提取體系中7種ATs的回收率最佳,在78.7%~100%之間(圖3),故選擇1.5%甲酸乙腈-甲醇(4∶1,/)提取體系。

      圖3 提取溶劑體系對小麥樣品中7種ATs回收率的影響(n=5)Fig. 3 Effect of extraction solvent systems on the recoveries of seven ATs in wheat samples (n = 5)

      2.3 萃取條件的優(yōu)化

      2.3.1 萃取劑的優(yōu)化

      小麥樣品經(jīng)提取、鹽析分層后,蛋白質(zhì)、油脂、色素以及糖組分等會被萃取出來,為減小雜質(zhì)的影響,對萃取條件進(jìn)行考察。以1.5%甲酸乙腈-甲醇(4∶1,/)提取液作為分散劑,分別考察乙酸乙酯、氯苯、二氯甲烷、三氯甲烷作為萃取劑時對各目標(biāo)組分的萃取效率,以7種ATs含量計算回收率。使用乙酸乙酯作為萃取試劑時沒有觀察到沉積相,因此不適合作為萃取試劑。使用其他3種萃取劑所得回收率見圖4,三氯甲烷回收率(83.1%~94%)比氯苯(75.1%~88.7%)和二氯甲烷(62.7%~72.7%)較優(yōu),當(dāng)以三氯甲烷作為萃取劑時,各個目標(biāo)物質(zhì)的萃取效率較好,對目標(biāo)組分無干擾,且三氯甲烷在水中的溶解度較小,可以減少萃取劑的損失,故選擇三氯甲烷作為本實驗的萃取溶劑。

      圖4 萃取劑種類對7種ATs回收率的影響(n=5)Fig. 4 Effect of extractant type on the recoveries of seven ATs in wheat samples (n = 5)

      2.3.2 萃取體積的優(yōu)化

      由于使用三氯甲烷溶劑進(jìn)行DLLME時,小麥樣品基質(zhì)中某些成分會沉淀在離心管底部,影響萃取試劑的吸取。因此,使用更大體積的萃取試劑可以更方便吸取離心后的萃取試劑。在分散劑體積為1 mL的條件下,分別用50、100、150 μL的三氯甲烷進(jìn)行萃取,考察不同體積萃取劑對萃取回收率的影響。結(jié)果如圖5所示,隨著三氯甲烷體積增大,回收率也增大,而當(dāng)體積大于100 μL時,回收率增加不明顯,而且三氯甲烷的使用體積越大,實驗更耗時,最終萃取劑中三氯甲烷的占比也越大,對于含有甲酸的流動相體系,容易造成溶劑效應(yīng),使峰形變差。因此,最終確定三氯甲烷100 μL為最佳萃取體積。

      圖5 萃取劑體積對7種ATs回收率的影響(n=5)Fig. 5 Effect of extractant volume on the recoveries of seven ATs in wheat samples (n = 5)

      2.4 方法學(xué)驗證

      2.4.1 方法的線性范圍、檢出限、定量限

      以乙腈為溶劑,配制7種ATs系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液直接進(jìn)樣分析。以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(,μg/L),以峰面積為縱坐標(biāo)(,AU),繪制目標(biāo)分析物的基質(zhì)加標(biāo)校正曲線(表2)。結(jié)果顯示,7種ATs在各自范圍內(nèi)均能獲得良好的線性關(guān)系,均大于0.987 277,以信噪比3和信噪比10確定方法的檢出限和定量限。7種ATs的檢出限和定量限分別為0.11~0.16 μg/kg和0.42~0.49 μg/kg。

      表2 7種ATs的線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限Table 2 Linear ranges, correlation coefficients, detection limits, and quantification limits of seven ATs

      2.4.2 加標(biāo)回收率以及精密度

      按1.3.2節(jié)處理小麥樣品,分別以1、2 倍和10 倍定量限進(jìn)行三水平加標(biāo)實驗。每個水平在1 d內(nèi)重復(fù)測定5 次,計算平均回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation,RSD)。如表3所示,7種ATs的平均加標(biāo)回收率為70.7%~101.3%,RSD為1.22%~4.11%,均小于10%,說明該方法性能良好。本方法對小麥樣品的不同含量的7種ATs均具有較高的回收率和精密度,滿足檢測要求。

      表3 7種ATs在小麥樣品中的加標(biāo)回收率和精密度(n= 5)Table 3 Recoveries and precision of seven ATs spiked in wheat samples (n = 5)

      2.4.3 基質(zhì)效應(yīng)

      取質(zhì)量濃度為10 μg/L的7種目標(biāo)物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,比較基質(zhì)提取液和純?nèi)軇┲?種ATs響應(yīng)值,以評估基質(zhì)效應(yīng)(matrix effect,ME)。ME<85%或ME>115%,存在基質(zhì)抑制或增強作用,85%≤ME≤115%,基質(zhì)對分析物的分析過程無顯著的干擾。

      如表4所示,小麥樣品中7種ATs的ME在90.7%~115%之間,基質(zhì)對分析物的分析過程無顯著干擾,保證了檢測結(jié)果的準(zhǔn)確度與可靠性。

      表4 7種ATs在小麥樣品基質(zhì)的ME(n=5)Table 4 Matrix effect of seven ATs in wheat samples (n = 5)

      2.4.4 與其他方法比較

      如表5所示,本研究與QuEChERS方法相比回收率高,比固相萃取處理步驟簡單、試劑用量少、成本低廉等,且本研究涉及的ATs種類廣、數(shù)量多,結(jié)合UPLC-MS/MS具有檢測靈敏度高、抗干擾能力強、定性準(zhǔn)確等優(yōu)點,能用于麥類樣品中7種ATs的快速(5 min內(nèi))定性、定量分析測定。

      表5 本實驗方法與其他文獻(xiàn)方法的比較Table 5 Comparison of the UPLC-MS/MS method and other existing methods present in the literature

      2.4.5 實際樣品測定

      使用本實驗建立的方法對市購黑麥、蕎麥、莜麥、青稞、燕麥、小麥6種麥類樣品(各20個)進(jìn)行7種ATs的檢測分析,結(jié)果見表6。結(jié)果顯示這6種麥類中7種ATs均有不同程度的檢出,黑麥樣品檢出Ten、AOH、ALT、TeA、ALS;蕎麥樣品中檢出Ten、ALT、TeA、ALS、ATX-I;莜麥樣品中檢出7種ATs;青稞樣品中檢出Ten、ALT、TeA、ALS、ATX-I;燕麥樣品中檢出Ten、AOH、TeA、ALS、ATX-I;小麥樣品中檢出Ten、AOH、AME、ALT、TeA、ALS。Ten和TeA是6種麥類中都檢出的毒素,含量分別是0.6~10.7 μg/kg和未檢出~31 μg/kg;ALS雖檢出率低于Ten和TeA,但最高含量37.3 μg/kg與TeA相當(dāng)。實際樣品測定結(jié)果表明Ten、TeA廣泛存在于麥類中,這一研究結(jié)果與之前研究報道的結(jié)果基本一致。

      表6 麥類樣品中7種ATs的含量統(tǒng)計Table 6 Statistical analysis of results obtained for the determination of seven ATs in rye, buckwheat, naked oat, barley, oat, and wheat

      續(xù)表6

      3 結(jié) 論

      采用DLLME前處理結(jié)合UPLC-MS/MS同時檢測麥類中7種ATs的分析方法。該方法具有操作簡單、快速(7種ATs在5 min內(nèi)完成色譜分離分析)、回收率高、靈敏度高、檢出限低等優(yōu)點,能滿足麥類中真菌毒素的檢測要求,具有實際應(yīng)用價值。將該方法應(yīng)用于麥類樣品中的實際測定,結(jié)果顯示Ten和TeA是6種麥類中都檢出的毒素,含量分別為0.6~10.7 μg/kg和未檢出~31 μg/kg;ALS雖檢出率低于Ten和TeA,但最高含量37.3 μg/kg與TeA相當(dāng),這些結(jié)果將為糧食中ATs殘留水平的控制、檢測標(biāo)準(zhǔn)的制定和管理措施的采取,都具有重要的理論和現(xiàn)實意義。

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