基于G-四鏈體的PCR-RCA雙重?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測(cè)沙門(mén)氏菌

劉健慧，張先舟，張?zhí)N哲，李蘭茹，王紅靜，高 潔，耿鳳珍，檀建新,*

（1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，河北 保定 071000；2.河北旅游職業(yè)學(xué)院，河北 承德 067000；3.河北大學(xué)附屬醫(yī)院，河北 保定 071000）

沙門(mén)氏菌（）是一種革蘭氏陰性食源性病原菌，屬腸桿菌科，常以家畜、家禽作為傳染源。進(jìn)食被沙門(mén)氏菌污染而未煮熟的食品或未消毒的奶制品可誘發(fā)嘔吐、腹瀉等癥狀。在我國(guó)，75%的細(xì)菌性食物中毒事件由沙門(mén)氏菌造成，因此為保障食品安全，急需快速靈敏的檢測(cè)手段對(duì)其監(jiān)控。

目前，食源性病原菌的檢測(cè)手段主要包括傳統(tǒng)的微生物學(xué)檢測(cè)、生理生化鑒定和現(xiàn)代的免疫學(xué)方法、分子生物學(xué)方法等。純培養(yǎng)方法雖作為檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)，但需要在各種選擇性培養(yǎng)基中進(jìn)行分離培養(yǎng)、形態(tài)檢測(cè)、生化鑒定，檢測(cè)耗時(shí)長(zhǎng)，失去了快檢的應(yīng)用意義；免疫學(xué)方法雖不需要復(fù)雜的儀器，檢測(cè)準(zhǔn)確性好，但制備高特異性單克隆抗體相對(duì)困難、成本高，限制了其使用前景；分子生物學(xué)方法主要以核酸檢測(cè)方法為主，常分為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）、多重PCR、實(shí)時(shí)PCR等非等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)和環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增、滾環(huán)擴(kuò)增（rolling circle amplification，RCA）、鏈置換擴(kuò)增等等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)。核酸檢測(cè)技術(shù)雖存在較多弊端，如過(guò)于敏感導(dǎo)致假陽(yáng)性和引物設(shè)計(jì)相對(duì)復(fù)雜、需要大量篩選驗(yàn)證等，但其檢測(cè)周期短、特異性強(qiáng)、可進(jìn)行多種病原菌同時(shí)檢測(cè)，精準(zhǔn)定量，故取得了廣闊的發(fā)展。

核酸信號(hào)輔助放大是快檢有效、直接的策略。生物素-親和素連接、酪酰胺信號(hào)放大、納米顆粒信號(hào)放大、核酸染料信號(hào)放大等技術(shù)均已實(shí)現(xiàn)廣泛應(yīng)用，但需額外在體系中添加或標(biāo)記信號(hào)放大因子，使實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)復(fù)雜，且靈敏度易受到添加量的干擾。而G-四鏈體作為富G的單鏈功能核苷酸，將其自身或互補(bǔ)堿基設(shè)計(jì)到相關(guān)序列中，可開(kāi)發(fā)出多種成本低、有效性強(qiáng)的生物傳感器。如水溶性苯并噻唑染料硫黃素T （thioflavin T，ThT）可特異性識(shí)別并嵌入G-四鏈體凹槽中，導(dǎo)致熒光信號(hào)顯著增強(qiáng)，進(jìn)而通過(guò)檢測(cè)熒光強(qiáng)度實(shí)現(xiàn)信號(hào)放大。

本研究先針對(duì)沙門(mén)氏菌基因設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增引物，并在下游引物的5’端標(biāo)記15個(gè)A堿基（15A），通過(guò)PCR擴(kuò)增積累誘發(fā)RCA反應(yīng)的環(huán)外“引物”。同時(shí)將G-四鏈體互補(bǔ)序列和15個(gè)A堿基設(shè)計(jì)成含有黏性末端的發(fā)卡結(jié)構(gòu)，并連接成啞鈴環(huán)狀DNA，作為RCA擴(kuò)增的模板。以PCR產(chǎn)物為“橋梁”，將PCR與RCA偶聯(lián)，當(dāng)沙門(mén)氏菌基因組DNA存在時(shí)，啟動(dòng)RCA擴(kuò)增，不斷積累富G序列，最終通過(guò)測(cè)量雙重?cái)U(kuò)增產(chǎn)物與ThT混合溶液的熒光強(qiáng)度，實(shí)現(xiàn)對(duì)沙門(mén)氏菌的定量檢測(cè)。該方法在無(wú)靶標(biāo)的擴(kuò)增體系中無(wú)G-四鏈體生成，能夠極大降低背景值，為食品中致病菌的快檢提供新策略。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

志賀氏菌（ATCC 12022）、單核細(xì)胞性李斯特菌（CICC 21633）、金黃色葡萄球菌（CICC 21600）、銅綠假單胞菌（ABCC 0927）、大腸埃希氏菌（CMCC 44752）、甲型副傷寒沙門(mén)氏菌（CICC 21501）、鼠傷寒沙門(mén)氏菌（CICC 21484）、丙型副傷寒沙門(mén)氏菌（CICC 21512）均由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)生物工程實(shí)驗(yàn)室提供；核酸序列由金唯智生物科技有限公司合成；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、DNA純化回收試劑盒 天根生化科技有限公司；2×EsMaster Mix（Dye）、PAGE凝膠制備試劑盒 北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；100 bp DNA ladder、T4 DNA聚合酶 寶生物工程（大連）有限公司；50 bp ladder 北京聚合美生物科技有限公司；2.0 DNA聚合酶 NEB（北京）有限公司；ThT 北京Solarbio公司；其他主要試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

MTH-012型旋渦混合儀 海門(mén)其林貝爾儀器制造有限公司；070-851型PCR儀 德國(guó)Biometra公司；DYY-10 C型電泳儀 北京市六一儀器廠；JY04S-3E型凝膠成像分析系統(tǒng) 北京科普爾科技發(fā)展有限公司；K5500型超微量核酸測(cè)量?jī)x 北京凱奧科技發(fā)展有限公司；FP-750熒光分光熒光計(jì) 日本分光株式會(huì)社。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)菌基因組提取

取1 mL過(guò)夜培養(yǎng)菌液，提取細(xì)菌基因組DNA，具體操作方法見(jiàn)細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)。并用核酸測(cè)量?jī)x對(duì)其DNA濃度及純度進(jìn)行測(cè)定。

1.3.2 引物及啞鈴環(huán)設(shè)計(jì)

通過(guò)Primer Premier 5設(shè)計(jì)了上游引物（HF）序列：5’-GAAAGAGCAACTGGCCAACG-3’，下游引物（TR）序列：5’-AAAAAAAAAAAAAAAATGCTTGAGCTGATTGCGC-3’。通過(guò)DNAMAN設(shè)計(jì)了可在T4 DNA連接酶的作用下連接成穩(wěn)定啞鈴型的發(fā)夾（CP）序列：5’-Phosphate-ATGAACAGG TCTAAAAAAAAAAAAAAACCCAACCCGCCCTA CCCTTTCCTGTTC-3’。并合成了15個(gè)T的環(huán)外引物5’-TTTTTTTTTTTTTTT-3’，驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)的可行性。

1.3.3 PCR條件優(yōu)化

以沙門(mén)氏菌基因組DNA為模板，采用HF與TR通過(guò)PCR擴(kuò)增目標(biāo)序列，獲得PCR產(chǎn)物觸發(fā)后續(xù)RCA擴(kuò)增。為確保得到大量包含15個(gè)堿基T（15T）的PCR產(chǎn)物且控制后續(xù)誘發(fā)RCA反應(yīng)的“引物”量，達(dá)到相對(duì)定量效果，本實(shí)驗(yàn)對(duì)初始引物濃度進(jìn)行優(yōu)化，設(shè)置了1、2、3、4 μmol/L的梯度變化，在相同的濃度添加量及模板濃度下，尋求最佳的引物初始濃度，最終確定PCR體系為：25 μL 2×EsMaster Mix（Dye），2 μL HF（3 μmol/L），2 μL TR（3 μmol/L），2 μL各濃度基因組DNA，ddHO補(bǔ)至50 μL。

本實(shí)驗(yàn)在TR的5’端額外標(biāo)記了15個(gè)A堿基，目的是在PCR結(jié)束后獲得大量包含15個(gè)T的PCR產(chǎn)物。這就造成了引物對(duì)的不等長(zhǎng)，從而設(shè)置了54、56、58、60、62、64 ℃退火溫度梯度優(yōu)化，最終確定PCR程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸10 s，72 ℃延伸5 min，28個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物采用2%的瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證（140 V、40 min），后利用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行觀察分析，并按照DNA純化回收試劑盒步驟純化PCR產(chǎn)物。

1.3.4 啞鈴環(huán)狀DNA的制備

借助T4 DNA連接酶能封閉DNA鏈上切口的作用，將所設(shè)計(jì)的啞鈴環(huán)狀DNA發(fā)夾前體的黏性末端連接。并對(duì)發(fā)夾DNA的反應(yīng)終濃度及T4 DNA連接酶的加入量進(jìn)行優(yōu)化，保障發(fā)夾DNA連接成啞鈴環(huán)的效率。發(fā)夾DNA（10 μmol/L）終濃度梯度設(shè)置為1、0.5、0.25、0.1 μmol/L，T4 DNA連接酶（350 U/μL）用量梯度設(shè)置為0.5、1.0、1.5、2、2.5 μL。最終確定連接反應(yīng)為5 μL發(fā)夾DNA、10 μL 10×T4 DNA連接緩沖液和83 μL ddHO混合均勻后95 ℃保溫5 min后37 ℃孵育30 min，使發(fā)夾DNA變性，充分進(jìn)行堿基互補(bǔ)配對(duì)。后加入2 μL T4 DNA連接酶，37 ℃孵育3 h，65 ℃滅酶10 min，所制得的連接產(chǎn)物可直接使用或-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

將連接后的啞鈴環(huán)狀DNA產(chǎn)物20 μL加入loading buffer染色后在15%的聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE）表征（140 V，1 h），后用3×Gel Red染色液（45 mL蒸餾水，5 mL 1 mol/L的NaCl溶液，15 μL 10 000×Gel Red母液）室溫避光振蕩染色30 min。最終利用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行觀察分析。

1.3.5 RCA擴(kuò)增及G-四鏈體熒光檢測(cè)的條件及優(yōu)化

RCA擴(kuò)增是借助2.0 DNA聚合酶強(qiáng)烈的鏈置換能力實(shí)現(xiàn)的，為達(dá)到快速檢測(cè)的目的，對(duì)啞鈴環(huán)狀DNA用量、RCA反應(yīng)時(shí)間及溫度進(jìn)行優(yōu)化。啞鈴環(huán)狀DNA（0.5 μmol/L）的加入終濃度設(shè)置為50、100、150、200、250、300 nmol/L；反應(yīng)時(shí)間設(shè)置為20、40、60、80、100 min；反應(yīng)溫度梯度設(shè)置為56、59、62、65、68 ℃。因RCA擴(kuò)增產(chǎn)物為冗長(zhǎng)且包含富G序列的ssDNA，為判斷該產(chǎn)物是否在擴(kuò)增結(jié)束后自身形成二級(jí)結(jié)構(gòu)，對(duì)ThT誘導(dǎo)折疊G-四鏈體結(jié)構(gòu)造成干擾，因此將RCA擴(kuò)增產(chǎn)物與ThT混勻后95 ℃變性5 min后4 ℃孵育5 min處理與直接室溫孵育對(duì)比，并對(duì)ThT用量及孵育時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化，將ThT（1 mmol/L）濃度梯度設(shè)置為5、10、20、30、40、50 nmol/L；孵育時(shí)間梯度設(shè)置為30、40、50、60、70 min。

最終確定反應(yīng)條件為20 μL啞鈴環(huán)狀DNA，10 μL PCR純化產(chǎn)物，5 μL 10×2.0 DNA聚合酶緩沖液，4 μL 2.5 mmol/L dNTP Mix溶液，2.5 μL 100 mmol/L MgSO溶液，7.5 μL ddHO混合均勻后95 ℃變性5 min后4 ℃孵育5 min，加入1 μL 10×2.0 DNA聚合酶，59 ℃孵育1 h。在RCA擴(kuò)增產(chǎn)物中加入1.5 μL ThT溶液，95 ℃變性5 min，4 ℃孵育5 min后室溫孵育1 h，最終將50 μL反應(yīng)液轉(zhuǎn)移到狹縫比色皿中，用熒光分光光度計(jì)測(cè)定激發(fā)波長(zhǎng)425 nm、發(fā)射波長(zhǎng)486 nm下的熒光值，選擇最優(yōu)條件用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.6 基于G-四鏈體的RCA反應(yīng)可行性驗(yàn)證

為了排除實(shí)驗(yàn)結(jié)果的假陽(yáng)性和驗(yàn)證啞鈴環(huán)狀DNA的連接效果，以合成的15個(gè)T的靶標(biāo)序列為模板進(jìn)行RCA擴(kuò)增G-四鏈體的可行性驗(yàn)證。根據(jù)1.3.5節(jié)反應(yīng)條件對(duì)2 μL合成靶標(biāo)進(jìn)行陽(yáng)性對(duì)照，無(wú)靶標(biāo)的陰性對(duì)照，無(wú)2.0 DNA聚合酶對(duì)照和無(wú)啞鈴環(huán)狀DNA模板對(duì)照。最終測(cè)量激發(fā)波長(zhǎng)425 nm、發(fā)射波長(zhǎng)450～550 nm的熒光信號(hào)，同時(shí)取5 μL擴(kuò)增產(chǎn)物采用1%的瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證結(jié)果，判定RCA反應(yīng)擴(kuò)增G-四鏈體的信號(hào)放大策略的可行性。

1.3.7 基于G-四鏈體的PCR-RCA方法檢測(cè)沙門(mén)氏菌

1.3.7.1 方法特異性

對(duì)過(guò)夜培養(yǎng)的革蘭氏陰性菌（大腸埃希氏菌、志賀氏菌、銅綠假單胞菌、甲型副傷寒沙門(mén)氏菌、丙型副傷寒沙門(mén)氏菌和鼠傷寒沙門(mén)氏菌）和革蘭氏陽(yáng)性菌（單核細(xì)胞性李斯特菌和金黃色葡萄球菌）的基因組DNA進(jìn)行提取。根據(jù)實(shí)驗(yàn)優(yōu)化的最佳條件進(jìn)行基于G-四鏈體的PCR-RCA方法檢測(cè)，測(cè)定486 nm下的熒光信號(hào)，驗(yàn)證構(gòu)建方法對(duì)沙門(mén)氏菌的特異性。

1.3.7.2 方法靈敏度

取過(guò)夜培養(yǎng)的沙門(mén)氏菌菌液1 mL進(jìn)行基因組DNA提取，并將提取的核酸進(jìn)行梯度稀釋，測(cè)其核酸含量，按照優(yōu)化好的條件進(jìn)行基于G-四鏈體的PCR-RCA方法檢測(cè)，測(cè)量發(fā)射波長(zhǎng)為450～550 nm的熒光信號(hào)，并取486 nm的熒光值，判斷此方法的靈敏度。

1.3.7.3 方法檢出限（limit of detection，LOD）

取培養(yǎng)的沙門(mén)氏菌菌液，用0.85%的生理鹽水進(jìn)行10 倍梯度稀釋，每個(gè)稀釋度取1 mL進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。將上述各稀釋度菌液5 mL接種于45 mL滅菌牛奶中，均質(zhì)后取1 mL提取基因組DNA，對(duì)基于G-四鏈體的PCR-RCA方法進(jìn)行牛奶加標(biāo)樣品中LOD分析。根據(jù)文獻(xiàn)[28]計(jì)算方法：LOD=3/（為空白樣品的標(biāo)準(zhǔn)偏差，為校準(zhǔn)曲線的斜率），確定此方法的LOD。

1.4 數(shù)據(jù)處理

相關(guān)數(shù)據(jù)的處理及標(biāo)準(zhǔn)曲線的計(jì)算采用Microsoft Excel 2010軟件，圖表的繪制采用GraphPad Prism 8軟件，并采用Adobe Photoshop CS5軟件對(duì)圖片進(jìn)行了組合排列。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR條件優(yōu)化

引物與模板相互作用，在相同模板濃度下，PCR產(chǎn)物會(huì)隨著引物濃度的增加而增多，但引物濃度過(guò)大又會(huì)造成模板經(jīng)指數(shù)擴(kuò)增后的產(chǎn)物無(wú)區(qū)別，干擾后續(xù)的定量效果，因此進(jìn)行引物濃度優(yōu)化。圖1顯示，當(dāng)引物濃度達(dá)3 μmol/L后，LOD為0.17 pg/μL，且不隨著引物濃度增加而變化，因此選用引物濃度3 μmol/L用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

因TR的5’端引入15個(gè)堿基A，導(dǎo)致上下游引物不等長(zhǎng)，值相差較大，因此進(jìn)行退火溫度優(yōu)化。圖1E為退火溫度依次為54、56、58、60、62、64 ℃時(shí)的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果，當(dāng)退火溫度為56 ℃時(shí)，產(chǎn)物較亮，且無(wú)非特異擴(kuò)增，因此選取56 ℃用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 PCR條件的優(yōu)化Fig. 1 Optimization of PCR conditions

2.2 發(fā)夾DNA的連接及優(yōu)化

RCA反應(yīng)的關(guān)鍵是構(gòu)建一個(gè)完整的環(huán)狀模板，而本實(shí)驗(yàn)根據(jù)G-四鏈體的反向互補(bǔ)序列及PCR擴(kuò)增3’端的15個(gè)T堿基產(chǎn)物，設(shè)計(jì)出自身可折疊成半啞鈴結(jié)構(gòu)的發(fā)夾DNA，且2個(gè)發(fā)夾DNA的黏性末端又可被T4 DNA連接酶連接成封閉的啞鈴環(huán)。圖2A～D分別是發(fā)夾DNA加入的終濃度1、0.5、0.25、0.1 μmol/L，T4 DNA連接酶添加量0.5、1、1.5、2、2.5 μL的連接產(chǎn)物。不難發(fā)現(xiàn)發(fā)夾探針濃度相對(duì)較低時(shí)，整個(gè)體系的連接效率變高，但也依然存在未連接的原始探針。因此為保障連接的啞鈴環(huán)狀DNA產(chǎn)物量的相對(duì)較多，又避免未連接探針的絕對(duì)浪費(fèi)，選取探針終濃度為0.5 μmol/L，T4 DNA連接酶量為2 μL的連接產(chǎn)物用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖2 發(fā)夾DNA的連接優(yōu)化Fig. 2 Optimization of hairpin DNA ligation

2.3 RCA擴(kuò)增及G-四鏈體熒光檢測(cè)的條件及優(yōu)化

2.3.1 RCA反應(yīng)條件優(yōu)化

RCA反應(yīng)是擴(kuò)增G-四鏈體從而實(shí)現(xiàn)信號(hào)放大的關(guān)鍵因素，對(duì)后續(xù)檢測(cè)的靈敏度起著重要作用，借助2.0 DNA聚合酶具有的5’→3’聚合酶活性和強(qiáng)鏈置換活性，可實(shí)現(xiàn)高效的等溫?cái)U(kuò)增。RCA反應(yīng)時(shí)間及溫度均會(huì)對(duì)2.0 DNA聚合酶的效率造成干擾，從而影響RCA擴(kuò)增的產(chǎn)物量，而啞鈴環(huán)狀DNA用量是決定擴(kuò)增產(chǎn)物多少的關(guān)鍵因素，啞鈴環(huán)較多，會(huì)造成模板浪費(fèi)，反之會(huì)影響實(shí)驗(yàn)的靈敏度。

由圖3A可見(jiàn)，隨著啞鈴環(huán)狀DNA濃度從50 nmol/L增加到200 nmol/L，熒光強(qiáng)度逐漸加強(qiáng)到最大，而超過(guò)200 nmol/L時(shí)，可能因添加的濃度過(guò)大，導(dǎo)致非特異擴(kuò)增增強(qiáng)，從而富G產(chǎn)物積累減少，熒光值降低。因此選擇啞鈴環(huán)狀DNA加入量為200 nmol/L用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。由圖3B可見(jiàn)，隨著反應(yīng)時(shí)間從20 min增加到60 min，熒光信號(hào)逐漸增強(qiáng)，當(dāng)時(shí)間達(dá)到60 min后，熒光值幾乎不發(fā)生變化，推測(cè)此時(shí)已達(dá)到反應(yīng)最大限度，因此選擇該時(shí)間用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。由圖3C可見(jiàn)，隨著溫度在56～68 ℃的變化，熒光值呈現(xiàn)先升高后下降趨勢(shì)，推測(cè)隨著溫度的升高，逐漸接近酶的最適溫度，此時(shí)反應(yīng)效率最大，但當(dāng)溫度持續(xù)上升，使聚合酶在高溫下部分失活，又環(huán)外引物受值影響互補(bǔ)配對(duì)能力下降，故熒光信號(hào)降低，因此選擇59 ℃進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖3 RCA反應(yīng)條件優(yōu)化Fig. 3 Optimization of RCA reaction conditions

2.3.2 G-四鏈體熒光檢測(cè)條件優(yōu)化

ThT的旋轉(zhuǎn)結(jié)構(gòu)致使自身熒光值低，但當(dāng)其特異性識(shí)別G-四鏈體并嵌入其中時(shí)，會(huì)產(chǎn)生強(qiáng)烈的熒光信號(hào)，從而達(dá)到檢測(cè)的目的。因此G-四鏈體結(jié)構(gòu)形成的多少，ThT的用量及二者相互作用的時(shí)間都會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)的靈敏度有較大影響。

圖4G-四鏈體熒光檢測(cè)條件優(yōu)化Fig. 4 Optimization of fluorescence detection conditions for G-quadruplex

圖4A為對(duì)RCA擴(kuò)增的長(zhǎng)鏈ssDNA產(chǎn)物進(jìn)行95 ℃、5 min，4 ℃、5 min處理和直接室溫孵育的檢測(cè)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)RCA產(chǎn)物與ThT經(jīng)過(guò)熱變性處理，熒光信號(hào)得到明顯提升。推測(cè)是長(zhǎng)鏈ssDNA自身折疊成二級(jí)結(jié)構(gòu)，使富G序列被包裹，從而影響了ThT誘導(dǎo)G-四鏈體結(jié)構(gòu)的功能。因此，選擇熱變性處理后再進(jìn)行室溫孵育的方法進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。圖4B為T(mén)hT終濃度由5～50 μmol/L的優(yōu)化結(jié)果，當(dāng)濃度從5～30 μmol/L時(shí)，熒光值逐漸增大且達(dá)到最大，但濃度超過(guò)30 μmol/L，熒光值呈現(xiàn)降低趨勢(shì)，推測(cè)是因溶解ThT粉末的溶液為50%的冰乙酸，自身pH值較低，在過(guò)酸的溶液中G-四鏈體結(jié)構(gòu)形成受到影響所致。因此，選擇30 μmol/L的ThT添加量作為后續(xù)條件。圖4C為RCA產(chǎn)物與ThT室溫孵育時(shí)間優(yōu)化結(jié)果，當(dāng)二者作用60 min時(shí)，熒光信號(hào)達(dá)到最大值，且隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，熒光值基本不再有大幅度的變化，因此選擇60 min孵育時(shí)間作為后續(xù)條件。

2.4 基于G-四鏈體的RCA反應(yīng)可行性驗(yàn)證

通過(guò)通用引物對(duì)沙門(mén)氏菌的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到3’端含有15個(gè)T的PCR產(chǎn)物，將其變性解旋后，再誘發(fā)RCA反應(yīng)和ThT熒光檢測(cè)，因此15個(gè)T堿基能否引發(fā)RCA反應(yīng)是實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵。同時(shí)也針對(duì)RCA反應(yīng)的發(fā)生條件，驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)是否存在假陽(yáng)性和啞鈴環(huán)狀DNA的連接效果，進(jìn)行了如下對(duì)照。

圖5 基于G-四鏈體的RCA反應(yīng)可行性驗(yàn)證Fig. 5 Feasibility verification of G-quadruplex based RCA reaction

對(duì)比瓊脂糖凝膠電泳圖（圖5A）與熒光信號(hào)（圖5B）可知，陰性對(duì)照、無(wú)2.0 DNA聚合酶對(duì)照和無(wú)啞鈴環(huán)狀DNA模板的對(duì)照反應(yīng)體系，均不能誘發(fā)RCA反應(yīng)，故也不能產(chǎn)生強(qiáng)烈的熒光信號(hào)，故本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的基于G-四鏈體的RCA技術(shù)檢測(cè)沙門(mén)氏菌的方法具有良好的可行性。

2.5 基于G-四鏈體的PCR-RCA方法檢測(cè)沙門(mén)氏菌的特異性

為評(píng)價(jià)方法的特異性，對(duì)1.1節(jié)中菌株進(jìn)行基因組DNA提取，根據(jù)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)得到的最佳反應(yīng)條件進(jìn)行基于G-四鏈體的PCR-RCA擴(kuò)增及ThT誘導(dǎo)產(chǎn)物增強(qiáng)自身熒光強(qiáng)度的檢測(cè)。在保證其他菌株的DNA濃度大于沙門(mén)氏菌DNA濃度和其他反應(yīng)條件相同情況下，驗(yàn)證構(gòu)建方法的特異性。由圖6可知，含目標(biāo)DNA的反應(yīng)體系產(chǎn)生了明顯的熒光信號(hào)，而其他非目標(biāo)菌的熒光信號(hào)與空白對(duì)照相差無(wú)幾，證明基于G-四鏈體的PCR-RCA方法對(duì)沙門(mén)氏菌具有高度的特異性。

圖6 基于G-四鏈體的PCR-RCA檢測(cè)方法的特異性Fig. 6 Specificity of G-quadruplex-based PCR-RCA detection method

2.6 基于G-四鏈體的PCR-RCA方法檢測(cè)沙門(mén)氏菌的靈敏度

取1 mL過(guò)夜培養(yǎng)的沙門(mén)氏菌，提取基因組DNA后進(jìn)行10 倍系列稀釋，得到1.7 fg/μL、17 fg/μL、0.17 pg/μL、1.7 pg/μL、17 pg/μL、0.17 ng/μL、1.7 ng/μL、17 ng/μL的靶標(biāo)樣品，在優(yōu)化的反應(yīng)條件下進(jìn)行基于G-四鏈體的PCR-RCA方法的檢測(cè)，以確定該方法的靈敏度。由圖7A可知，在17 fg/μL～1.7 ng/μL的基因組DNA模板下，隨著靶標(biāo)質(zhì)量濃度的逐漸增加，熒光信號(hào)也呈現(xiàn)逐漸增強(qiáng)的趨勢(shì)。且由圖7B可知，基因組DNA濃度對(duì)數(shù)與熒光信號(hào)呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系，線性回歸方程為=2.101+2.872 3（=0.992 5），靈敏度為17 fg/μL，說(shuō)明構(gòu)建的基于G-四鏈體的PCR-RCA檢測(cè)方法可以對(duì)沙門(mén)氏菌進(jìn)行有效的鑒別和定量檢測(cè)。

圖7 基于G-四鏈體的PCR-RCA檢測(cè)方法的靈敏度Fig. 7 Sensitivity of G-quadruplex-based PCR-RCA detection method

2.7 牛奶加標(biāo)樣品中基于G-四鏈體的PCR-RCA方法的LOD

利用PCR-RCA方法擴(kuò)增G-四鏈體熒光檢測(cè)沙門(mén)氏菌的最佳條件，對(duì)沙門(mén)氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株污染的牛奶進(jìn)行檢測(cè)，其中人為污染濃度為10～10CFU/mL，通過(guò)觀察ThT誘導(dǎo)擴(kuò)增產(chǎn)物并特異性結(jié)合G-四鏈體的熒光增強(qiáng)效果及對(duì)比加標(biāo)樣品污染濃度，進(jìn)行檢測(cè)靈敏度計(jì)算。由圖8A可知，熒光信號(hào)隨著樣品污染程度的增加而增加。且由圖8B可知，在10～10CFU/mL樣品污染濃度下，其對(duì)數(shù)與熒光值呈現(xiàn)出良好的梯度變化，計(jì)算檢測(cè)限為4.48 CFU/mL。因此本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的方法在沙門(mén)氏菌實(shí)際檢測(cè)中實(shí)用性良好，在一定范圍內(nèi)可用于沙門(mén)氏菌的定量檢測(cè)。

圖8 基于G-四鏈體的PCR-RCA方法檢測(cè)人工污染沙門(mén)氏菌的牛奶樣品Fig. 8 Detection of Salmonella in artificially contaminated milk samples by the G-quadruplex-based PCR-RCA method

3 結(jié)論與討論

目前，G-四鏈體偶聯(lián)RCA的方法，已實(shí)現(xiàn)單核細(xì)胞性李斯特菌、克氏桿菌屬、microRNA等的檢測(cè)。但其研究或采用較為復(fù)雜的引發(fā)RCA擴(kuò)增的手段，或設(shè)計(jì)更為復(fù)雜的環(huán)狀模板，增加了實(shí)驗(yàn)的難度。本實(shí)驗(yàn)建立的基于G-四鏈體的PCR-RCA雙重?cái)U(kuò)增檢測(cè)沙門(mén)氏菌的方法，特點(diǎn)與優(yōu)勢(shì)在于：1）借助PCR擴(kuò)增，使產(chǎn)物3’端生成的15個(gè)T堿基觸發(fā)后續(xù)實(shí)驗(yàn)，既可確保引物與靶基因片段識(shí)別檢測(cè)的特異性，又可在核酸第1次擴(kuò)增時(shí)積累大量“引物”，確保實(shí)驗(yàn)的靈敏度。該方法實(shí)現(xiàn)了對(duì)低豐度目標(biāo)序列的初步擴(kuò)增，獲得與擴(kuò)增產(chǎn)物等量的“15T”，為后續(xù)含“15A”的頸環(huán)結(jié)構(gòu)提供RCA擴(kuò)增引物，通過(guò)誘發(fā)RCA擴(kuò)增間接完成對(duì)目標(biāo)序列的檢測(cè)，也通過(guò)RCA擴(kuò)增得到巨量G-四鏈體實(shí)現(xiàn)熒光信號(hào)的分析。因此，該方法對(duì)低豐度DNA樣品具有應(yīng)用潛力。2）以“15A”堿基為“橋梁”，可擴(kuò)展到對(duì)不同目標(biāo)核酸序列的檢測(cè)中，即只需要根據(jù)目標(biāo)序列設(shè)計(jì)5’端帶“15A”的引物，無(wú)需重新設(shè)計(jì)啞鈴環(huán)狀DNA模板，就可實(shí)現(xiàn)對(duì)不同目標(biāo)序列的檢測(cè)，使方法具備通用性。3）設(shè)計(jì)帶有“AT”兩個(gè)堿基黏性末端的發(fā)夾結(jié)構(gòu)，在T4 DNA連接酶的作用下可產(chǎn)生類似T-載體的連接效果，巧妙高效地連接成啞鈴環(huán)狀DNA模板。此方法有別于其它連接方式，不需要額外添加成環(huán)引物和核酸外切酶消化未連接的環(huán)，有效減少實(shí)驗(yàn)假陽(yáng)性。4）與熒光定量PCR檢測(cè)中的熒光染料法相比，本實(shí)驗(yàn)方法可彌補(bǔ)由于嵌入核酸的熒光染料無(wú)法區(qū)分特異性產(chǎn)物與非特異產(chǎn)物造成的檢測(cè)結(jié)果誤差大的缺點(diǎn)；與探針?lè)ㄏ啾?，可避免探針設(shè)計(jì)相對(duì)復(fù)雜、標(biāo)記熒光淬滅基團(tuán)成本高的弊端。最終利用ThT對(duì)核酸第2次擴(kuò)增產(chǎn)物中的重復(fù)富G單元特異識(shí)別，將核酸信號(hào)輔助放大為熒光信號(hào)，借助熒光分光光度計(jì)即可實(shí)現(xiàn)檢測(cè)的精準(zhǔn)定量效果，雖然步驟上略顯繁瑣，但是其應(yīng)用范圍較熒光定量PCR更為廣泛。

G-四鏈體作為一種高穩(wěn)定性、廣泛存在的功能核酸，以易于修飾和合成、檢測(cè)方式靈活的優(yōu)異特征，已應(yīng)用到多種核酸檢測(cè)技術(shù)中。但如何巧妙地將G-四鏈體與所檢核酸相偶聯(lián)，積累大量富G序列是其關(guān)鍵。因此進(jìn)行如下改進(jìn)：1）PCR擴(kuò)增的引物濃度是后續(xù)生成誘發(fā)RCA反應(yīng)的前提。通過(guò)PCR擴(kuò)增所得的RCA引物濃度高時(shí)，雖然靈敏度得到顯著提高，但易掩蓋RCA引物間的濃度差，直接影響RCA富G產(chǎn)物檢測(cè)的梯度。因此，本實(shí)驗(yàn)優(yōu)化選擇3 μmol/L的PCR引物，剛好能獲得最佳RCA擴(kuò)增梯度。2）與擴(kuò)增靶標(biāo)得到5’-磷酸化產(chǎn)物并經(jīng)過(guò)核酸外切酶消化和不對(duì)稱拖尾PCR （AT-PCR）獲得ssDNA產(chǎn)物觸發(fā)后續(xù)RCA反應(yīng)的方法相比，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)直接對(duì)PCR純化產(chǎn)物進(jìn)行熱變性處理，使解鏈的3’端15個(gè)T堿基與啞鈴環(huán)狀DNA模板相互識(shí)別配對(duì)，通過(guò)鏈替換擴(kuò)增積累大量RCA產(chǎn)物，使整個(gè)實(shí)驗(yàn)操作變得便捷。3）RCA擴(kuò)增產(chǎn)物為冗長(zhǎng)的ssDNA，其自身二級(jí)結(jié)構(gòu)會(huì)包裹大量重復(fù)的富G序列而影響G-四鏈體結(jié)構(gòu)的形成，因此在進(jìn)行ThT熒光信號(hào)放大檢測(cè)前，將RCA產(chǎn)物進(jìn)行熱變性及冷卻孵育處理，使富G堿基裸露，即可顯著提升檢測(cè)靈敏度。

綜上，通過(guò)一系列的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與優(yōu)化，建立了PCRRCA雙重核酸擴(kuò)增與G-四鏈體核酸輔助檢測(cè)信號(hào)放大聯(lián)合檢測(cè)沙門(mén)氏菌的新方法，該方法有效性強(qiáng)、穩(wěn)定性好、靈敏度高，借助熒光分光光度計(jì)對(duì)所檢樣品的熒光值進(jìn)行分析，即實(shí)現(xiàn)一定范圍內(nèi)的定量檢測(cè)?？蓮V泛用于其他食源性致病菌的檢測(cè)，通用性強(qiáng)，只需改變PCR擴(kuò)增的引物，即可達(dá)到對(duì)靶物質(zhì)的測(cè)定。但相比其他信號(hào)放大技術(shù)，G-四鏈體/ThT的熒光信號(hào)強(qiáng)度易受到緩沖體系中一價(jià)陽(yáng)離子濃度的影響，因此在檢測(cè)復(fù)雜樣品和低濃度樣品時(shí)存在一定的局限性。