QuEChERS結合UPLC-MS/MS法測定畜肉中8種抗真菌藥物殘留

黃永橋，宋光林，毛敏霞，楊昌彪，馬 凱，高 亮,*

（1.貴州省檢測技術研究應用中心，貴州 貴陽 550016；2.貴州省分析測試研究院，貴州 貴陽 550016）

畜牧業(yè)的發(fā)展與各種藥物密切相關，這些藥物被廣泛用于預防或控制疾病，以增加肉類產(chǎn)量，降低成本。抗真菌藥物是重要的一類藥物，常用于治療由煙曲霉、白色念珠菌和新生隱球菌等真菌引起的各種疾病?？拐婢幬锔鶕?jù)其化學結構可分為棘白菌素類、多烯類、嘧啶類、丙烯胺類及烯丙基胺衍生物等。

研究表明，抗真菌藥物并不完全安全，如唑類抗真菌藥物具有一定的肝毒性，并對腎上腺和性腺有一定的抑制作用；灰黃霉素具有一定的神經(jīng)毒性、肝毒性、致癌性及致畸作用等。因此，新抗真菌藥物的研究與開發(fā)主要考慮對現(xiàn)有藥物的毒性降低、提高藥效為目的的劑型改良和結果修飾。由于濫用藥物或沒有嚴格遵守藥物安全間隔期導致藥物或其代謝物殘留，會對人體健康產(chǎn)生影響，增加消費者的潛在風險。因此，加強畜產(chǎn)品中該類藥物殘留量的檢測必不可少，建立畜產(chǎn)品中抗真菌藥物殘留量的檢測方法具有重要意義。

目前，有關抗真菌藥物測定的方法主要有高效液相色譜法、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法。液相色譜法靈敏度較低、選擇性較差；超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）法因具有較高的靈敏度、選擇性和抗干擾能力，被廣泛用于痕量化合物分析方法中。張凱等采用QuEChERS dSPE EMR-Lipid凈化管的前處理方法，建立了測定羊肉中8種抗真菌藥物的UPLC-MS/MS快速檢測方法；邵明媛和蔡永通等采用乙二胺--丙基硅烷（primary secondary amine，PSA）吸附劑的前處理方法，建立了測定化妝品中抗真菌藥物的UPLC-MS/MS快速檢測方法。然而應用QuEChERS結合UPLC-MS/MS法針對多種畜肉（豬肉、牛肉、羊肉）中抗真菌藥物殘留的檢測技術罕見報道，且缺乏相關檢測標準，已發(fā)布的標準及法規(guī)對抗真菌藥物在畜肉中的最大殘留限量也未作規(guī)定。因此，建立高通量超痕量的快速檢測技術，對畜肉中抗真菌藥物殘留的檢測方法技術進行研究顯得非常必要。QuEChERS法作為新開發(fā)的一種快速、簡便、低成本且環(huán)境友好的前處理方法，被廣泛用于農(nóng)獸藥殘留測定、非法添加藥物測定及污染物測定等方面。

本研究以豬肉、牛肉和羊肉為研究對象，采用QuEChERS法進行前處理，結合UPLC-MS/MS儀，對樣品前處理條件和儀器條件進行優(yōu)化，建立QuEChERS結合UPLC-MS/MS的分析方法，并對建立的方法進行方法學評價。該方法可用于畜肉中8種抗真菌藥物殘留量的快速定性和定量分析，為食品安全監(jiān)管提供強有力的技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豬肉、牛肉和羊肉 貴州貴陽各大型超市及農(nóng)貿(mào)市場；甲醇、乙腈（均為色譜純） 德國Merck公司；乙腈、乙酸乙酯、無水硫酸鈉（均為分析純） 天津市科密歐化學試劑有限公司；甲酸（色譜純）、十八烷基鍵合硅膠C吸附劑（40～63 μm）、PSA吸附劑（40～63 μm） 上海安普實驗科技股份有限公司；QuEChERS dSPE EMR-Lipid凈化管 美國Agilent公司；Oasis PRiME HLB固相萃取小柱 美國Waters公司；陶瓷均質(zhì)子 北京迪馬科技有限公司；8種抗真菌藥物混合標準溶液（純度＞98%，100 μg/mL灰黃霉素、克霉唑、咪康唑、益康唑、聯(lián)苯芐唑、酮康唑、氟康唑、萘替芬） 天津阿爾塔科技有限公司；0.22 μm PTFE濾膜上海安普實驗科技股份有限公司。

1.2 儀器與設備

6470三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀（配有電噴霧離子源）、1290 UPLC儀 美國Agilent公司；Blixer3攪拌機法國Robot Coupa公司；LT2002電子天平 常熟市天量儀器有限公司；UMV-2多管渦旋混合器 北京普立泰科儀器有限公司；L-550離心機 湖南湘儀離心機儀器有限公司；Milli-Q超純水機 美國Millipore公司。

1.3 方法

1.3.1 標準溶液配制

從100 μg/mL 8種抗真菌藥物混合標準溶液中準確移取1.00 mL于10 mL棕色容量瓶中，用乙腈溶解并定容刻度，混勻，配制成質(zhì)量濃度為10.0 μg/mL標準儲備液，-18 ℃避光保存。移取100.0 μL標準儲備液于10 mL棕色容量瓶中，用乙腈定容，配制成100 ng/mL的標準溶液。移取1.0 mL 100 ng/mL的標準溶液于10 mL棕色容量瓶中，用乙腈定容，配制成10 ng/mL的標準工作液，備用。

舉個例子，比如說我有一輛車，但是這輛車我不經(jīng)常使用，大部分時間這輛車的價值沒有得到體現(xiàn)，這是資源的浪費。那么，如何把這輛車的資源充分的利用起來呢？——“共享”給有需求的人。這樣一來，資源得到利用，我作為供給方也獲得一定的收益。久而久之，供不應求，第三方電子商務企業(yè)就會提供給司機更多的需求客源，這就是共享經(jīng)濟。這些平臺，就是我們現(xiàn)在所熟知的打車軟件——“滴滴出行”。

1.3.2 樣品前處理

稱取搗碎后的組織樣品5.00 g于50 mL具塞離心管中，準確加入10 mL 0.1%甲酸-乙腈，加入1 粒陶瓷均質(zhì)子，渦旋振蕩10 min，4 500 r/min常溫離心10 min，吸取2 mL上清液于預先加有500 mg無水硫酸鈉和25 mg C吸附劑的離心管中，渦旋1 min，5 000 r/min離心2 min，取上清液過0.22 μm PTFE濾膜，待測。

1.3.3 儀器條件

1.3.3.1 色譜條件

色譜柱：ZORBAX Eclipse Plus-C反相色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）；流動相：A為0.1%甲酸溶液，B為乙腈；流速：0.3 mL/min；柱溫：40 ℃；進樣量：5.0 μL；梯度洗脫程序：0～0.5 min，90% A、10% B；0.5～0.6 min，90%～54% A、10%～46% B；0.6～4.5 min，54%～48% A、46%～52% B；4.5～4.6 min，48%～10% A、52%～90% B；4.6～5.5 min，10% A、90% B；5.5～5.51 min，10%～90% A、90%～10% B；5.51～7 min，90% A、10% B。

1.3.3.2 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧離子源，正離子掃描模式；多反應監(jiān)測；毛細管電壓：4.0 kV；霧化器壓力：40 psi；干燥氣流速：10 L/min；干燥氣溫度：300 ℃；鞘氣流速：10 L/min；鞘氣溫度：300 ℃。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計及圖表繪制

所有數(shù)據(jù)均在Agilent MassHunter Data Acquisition軟件下采集，采用Qualitative Analysis Navigator B.08.00定性軟件、Quantitative Analysis B.09.00定量軟件進行數(shù)據(jù)處理；圖表繪制采用Excel 2016和Origin 2018版。

2 結果與分析

2.1 樣品前處理的優(yōu)化

2.1.1 提取

乙腈和乙酸乙酯作為常用提取溶劑，對多數(shù)化合物有較好的提取效率，降低提取溶劑的pH值能破壞樣品的組織結構，使目標物從組織中游離出來，加快提取效率。本實驗比較乙腈、0.1%甲酸-乙腈、乙酸乙酯和0.1%甲酸-乙酸乙酯作為提取溶劑時對8種抗真菌藥物的提取效率，結果見圖1。乙酸乙酯和0.1%甲酸-乙酸乙酯對酮康唑回收率為0%，對氟康唑、聯(lián)苯芐唑、灰黃霉素和咪康唑的提取效率均不理想（回收率均＜45%），對萘替芬和克霉唑的提取效率較差（回收率＜55%），益康唑的提取效率滿足要求（回收率＞75%）。乙腈和0.1%甲酸-乙腈對8種抗真菌藥物的提取效果較好（回收率均＞70%），且0.1%甲酸-乙腈的提取效果略優(yōu)于乙腈，因此，選擇0.1%甲酸-乙腈作為樣品提取溶劑。

渦旋振蕩提取能使溶劑與樣品基質(zhì)充分混合，實驗考察渦旋振蕩提取時間（5、10、15 min）對提取效率的影響。結果發(fā)現(xiàn)，在5～10 min時，隨著時間的延長提取效果明顯增大，10 min以后隨著時間的延長，提取效果基本趨于穩(wěn)定，故選用渦旋振蕩10 min作為樣品提取時間。

圖1 提取溶劑對8種抗真菌藥物回收率的影響（n=3）Fig. 1 Effects of different extraction solvents on the recovery of eight antifungal drugs (n = 3)

2.1.2 凈化

畜肉中含有較多的脂肪、色素和磷脂等雜質(zhì)，凈化時需盡可能多的去除雜質(zhì)干擾，又要減少對目標物的損失。QuEChERS法處理快速簡單，常用的吸附劑有C、PSA、GCB等。PSA可吸附金屬離子、色素、脂肪酸和其他極性有機酸等雜質(zhì)，C可以吸附脂肪等弱極性雜質(zhì)。本研究對QuEChERS dSPE EMR-Lipid凈化管、Oasis PRiME HLB固相萃取小柱（無須活化、淋洗及洗脫等步驟，可快速吸附雜質(zhì)）、PSA及C吸附劑進行了考察（圖2A）。結果表明，使用Oasis PRiME HLB固相萃取小柱時，除氟康唑（11%）和益康唑（56%）有較小回收率外，對其他目標物吸附性很強；使用PSA吸附劑時，除氟康唑（59%）、酮康唑（63%）和咪康唑（68%）回收率較差，其他目標化合物回收率均大于74%；QuEChERS dSPE EMR-Lipid凈化管及C吸附劑對目標物均有較好的回收率，C吸附劑的回收率、雜質(zhì)干擾及基線噪聲等均優(yōu)于QuEChERS dSPE EMR-Lipid凈化管。因此，選取C吸附劑進行凈化。

研究進一步對C吸附劑用量（25、50、100 mg）進行考察。如圖2B所示，除益康唑的回收率隨C吸附劑的用量增加而增大外，其余指標的回收率均隨C吸附劑的用量增加而變小，故選用25 mg C吸附劑凈化樣品。QuEChERS凈化方法通常加入一定量的吸水劑，促進目標化合物由水相分配至有機相。此研究對無水硫酸鈉的用量一并進行了研究，最終確定無水硫酸鈉的使用量為500 mg。綜合考慮，使用500 mg無水硫酸鈉和25 mg C吸附劑作為樣品凈化方法。

圖2 不同凈化方法（A）和C18吸附劑用量（B）對回收率的影響（n=3）Fig. 2 Effects of different purification methods (A) and the amount of C18 adsorbent (B) on the recovery of eight antifungal drugs (n = 3)

2.2 色譜條件的優(yōu)化

8種抗真菌藥物化學結構差異大，化學性質(zhì)不同，本實驗采用UPLC，選擇ZORBAX Eclipse Plus-C色譜柱對目標物進行分離。流動相中加入甲酸可以增加色譜柱的保留能力，提高分離效果。分別考察50 mm和100 mm的色譜柱，以及乙腈、甲醇、0.1%甲酸溶液、0.1%甲酸溶液含2 mmol/L乙酸銨溶液等不同洗脫體系的分離能力。結果表明，使用100 mm的色譜柱各化合物分離度更好；使用乙腈-0.1%甲酸溶液作為流動相時，目標物有良好的色譜分離效果，有較好的響應值。進一步對梯度洗脫程序進行優(yōu)化，使目標物有較好的分離度，縮短樣品分析時間，提高了分析效率。最終確立了使用ZORBAX Eclipse Plus-C（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）色譜柱，采用梯度洗脫，樣品單次分析時間為7 min，滿足批量樣品的快速檢測分析。

2.3 質(zhì)譜條件的優(yōu)化結果

參考文獻[15-16]方法，配制100 μg/L的混合標準溶液，在正離子模式下進行一級全掃描質(zhì)譜得到準分子離子（[M+H]），通過調(diào)試選擇最佳錐孔電壓和毛細管電壓，然后將準分子離子進行二級質(zhì)譜分析，得到子離子特征碎片，選擇特征碎片中離子中響應值高、基線噪聲低的兩對離子對作為定性離子和定量離子，優(yōu)化子離子對碰撞能量，使其豐度最大；進一步優(yōu)化霧化器壓力、干燥和鞘氣的溫度及壓力等質(zhì)譜參數(shù)，使其離子化效率最佳，得到最優(yōu)的質(zhì)譜條件，結果見表1。

表1 8種抗真菌藥物檢測質(zhì)譜參數(shù)Table 1 Mass spectrometric parameters for eight antifungal drugs

2.4 方法學評價

2.4.1 基質(zhì)效應（matrix effect，ME）的評價

ME是指試樣中基質(zhì)成分會抑制或增強目標化合物的離子化，當ME過大時會降低方法的選擇性和靈敏度，影響分析結果的準確性，因而在建立分析方法時需對ME進行評價，并采取適當措施消除或減弱其對結果準確性的影響。采用1.3.1節(jié)基質(zhì)匹配和純?nèi)軇藴是€，并采用計算公式：ME/%=[（基質(zhì)匹配標準曲線斜率/純?nèi)軇藴是€斜率）-1]×100。通常，當|ME|≤10%時，ME可忽略不計；當|ME|在10%～20%之間時，存在較弱的ME；當|ME|＞20%時，存在強ME。表2表明，8種抗真菌藥物在3種畜肉基質(zhì)中均存在強基質(zhì)抑制效應，為校正ME對結果的影響，在定量分析中使用基質(zhì)匹配標準曲線。本實驗的ME評價結果與張凱等結果具有一致性。

2.4.2 方法的標準曲線和檢出限實驗結果

采用空白基質(zhì)樣液配制系列混合標準工作溶液（0.05～10.00 μg/L），在選定的色譜和質(zhì)譜條件下測定，以峰面積（）對其質(zhì)量濃度（）繪制校準曲線。如表2所示，8種抗真菌藥物在各自線性范圍內(nèi)，線性關系良好，相關系數(shù)（）均大于0.998。通過向陰性樣品中添加目標物的標準溶液，以3 倍信噪比（=3）計算檢出限，以=10計算定量限。最終確定方法的檢出限為0.1 μg/kg，定量限為0.3 μg/kg。

表2 8種抗真菌藥物的線性方程、相關系數(shù)（r）、檢出限、定量限及METable 2 Linear equations, correlation coefficients (r), limits of detection,limits of quantification and matrix effects for eight antifungal drugs

續(xù)表2

2.4.3 加標回收及精密度考察結果

采用基質(zhì)加標法對加標回收和精密度進行考察，在豬肉、牛肉和羊肉陰性樣品中分別添加低、中、高3個加標水平，每個添加水平重復6 次，連續(xù)做3 d，按照1.3.2節(jié)樣品前處理方法處理后上機測定，分別計算加標回收率、準確度和精密度（用變異系數(shù)（coefficient of variation，CV）表示）。由表3可知，8種抗真菌藥物的準確度均在15%以內(nèi)，日內(nèi)平均回收率為85.7%～113.6%，日內(nèi)CV為1.2%～14.8%；日間平均回收率為87.6%～107.9%，日間CV為2.1%～14.6%。本方法具有良好的回收率和精密度。標準溶液、空白樣品及加標樣品MRM色譜圖見圖3。

表3 8種抗真菌藥物的平均回收率和精密度Table 3 Average recoveries and precision for eight antifungal drugs in meat

續(xù)表3

圖3 標準溶液、樣品空白及樣品加標MRM色譜圖Fig. 3 MRM chromatograms of standard solution, blank samples and samples spiked with eight antifungal drugs

2.5 樣品檢測結果

按本研究建立的方法對市售的豬肉40 批次、牛肉30 批次、羊肉10 批次進行測定。結果顯示，豬肉中有1 批次檢出益康唑含量為3.96 μg/kg；牛肉中有1 批次檢出酮康唑含量為0.37 μg/kg，1 批次檢出灰黃霉素含量為0.75 μg/kg，3 批次檢出益康唑含量分別為0.47、0.33、0.34 μg/kg；其余樣品及指標均未超檢出限。本方法可用于畜肉中8種抗真菌藥物殘留的檢測。

3 結 論

建立QuEChERS結合UPLC-MS/MS法快速測定畜肉中8種抗真菌藥物殘留量檢測方法。樣品用0.1%甲酸-乙腈提取，經(jīng)QuEChERS吸附劑凈化去除干擾物質(zhì)，簡化前處理步驟，并有效提高了凈化效率。應用本方法可在7 min內(nèi)完成畜肉中8種抗真菌藥物殘留分析，且目標物有較好的分離度，相關系數(shù)（）均大于0.998，檢出限為0.1 μg/kg，定量限為0.3 μg/kg，8種抗真菌藥物在3種畜肉基質(zhì)中的準確度在15%以內(nèi)，日內(nèi)平均回收率為85.7%～113.6%，日內(nèi)CV為1.2%～14.8%；日間平均回收率為87.6%～107.9%，日間CV為2.1%～14.6%。該方法檢出限和定量限低，加標回收率和精密度良好，且前處理簡單、快速、靈敏度高、重復性好和分析準確，能夠準確定性和定量分析畜肉中8種抗真菌藥物殘留量，為日常分析檢測提供了技術支持。