王 艷，王 悅，張 帥，趙 寧，辛嘉英，孫立瑞，關(guān)樺楠

（哈爾濱商業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150076）

葡萄糖作為食品中重要的營養(yǎng)成分之一，其濃度對(duì)人體自身的生理活動(dòng)有很大的影響。濃度過低容易導(dǎo)致中風(fēng)或其他血管疾病，濃度過高會(huì)導(dǎo)致肥胖、糖尿病、腎病、心臟病和神經(jīng)損傷等。人們通過控制日常膳食中葡萄糖的攝入量，降低患有相關(guān)疾病的風(fēng)險(xiǎn)極具現(xiàn)實(shí)意義。當(dāng)前，采用將葡萄糖氧化酶修飾在電極表面制備葡萄糖生物傳感器的方法較為普遍，然而，修飾電極過程中需要對(duì)酶進(jìn)行純化，使成本增加。而且生物酶本身不穩(wěn)定，受溫度、濕度以及pH值等環(huán)境條件的影響下易失活，同時(shí)葡萄糖氧化酶的生產(chǎn)復(fù)雜且成本昂貴。因此，極大地限制該方法在生產(chǎn)實(shí)踐中的應(yīng)用。通過將對(duì)特定靶標(biāo)具有識(shí)別和結(jié)合特性的短鏈核酸（適配體）與靶分子之間的識(shí)別和結(jié)合作用轉(zhuǎn)化為靈敏的電化學(xué)的檢測(cè)信號(hào)建立的生物傳感技術(shù)簡(jiǎn)稱為核酸適配體生物傳感器，具有性質(zhì)穩(wěn)定、反應(yīng)靈敏、便宜且易于操作等特點(diǎn)，在分析檢測(cè)領(lǐng)域得到了廣泛關(guān)注。到目前為止，已經(jīng)建立了不同的核酸適配體傳感器如用于檢測(cè)蜂蜜中四環(huán)素、魚肉和鵝肉中氯霉素、牛乳中致病菌及微量有害物質(zhì)等，并且在檢測(cè)食品中酶毒素和重金屬離子具有顯著成效。查閱相關(guān)文獻(xiàn)，當(dāng)前還沒有建立一種檢測(cè)食品中葡萄糖的核酸適配體生物傳感器。因此，本研究將為今后研發(fā)核酸適配體生物傳感器在食品檢測(cè)中的應(yīng)用提供參考。

納米金（gold nanoparticles，AuNPs）是最早出現(xiàn)的納米材料，與其他納米材料相比，具有制備方便、性質(zhì)穩(wěn)定、表面易于修飾等優(yōu)點(diǎn)。近期研究發(fā)現(xiàn)，AuNPs具備葡萄糖氧化酶活性，但將其直接用于催化葡萄糖的氧化存在催化活性不足，穩(wěn)定性差等瓶頸問題。甲烷氧化菌素（methanobactin，Mb）是甲烷氧化細(xì)菌分泌的一種功能性小肽，其結(jié)構(gòu)中賴氨酸基團(tuán)上的—SH或—NH可與單質(zhì)金形成金硫鍵（Au—S）或金胺鍵（Au—NH），可將Mb強(qiáng)力的固定在AuNPs顆粒上，防止AuNPs發(fā)生聚集沉淀。黃素腺嘌呤二核苷酸（flavin adenine dinucleotide，F(xiàn)AD）被用作某些氧化還原酶的輔助基團(tuán)，能夠在生物氧化過程中傳遞氫（H）。其結(jié)構(gòu)中—NH可與游離的—COOH結(jié)合形成酰胺鍵（—CONH—）；Behling等將吡咯喹啉醌通過結(jié)構(gòu)中的—NH與FAD結(jié)合形成吡咯喹啉醌/FAD單層，并接合葡萄糖氧化酶制備出葡萄糖氧化酶生物傳感器。FAD中的異四氧嘧啶環(huán)作為氧化還原活性成分，容易接受和捐贈(zèng)電子，在電解液和電極表面之間進(jìn)行有效的電子傳遞。同時(shí)，納米粒子表面結(jié)合了FAD可以增強(qiáng)其對(duì)葡萄糖的捕獲活性，提高選擇性，使該核酸適配體生物傳感器響應(yīng)時(shí)間縮短，靈敏度提高。

本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的機(jī)理如圖1A所示，首先，利用AuNPs顆粒大的比表面、強(qiáng)的吸附能力，將Mb包裹于納米顆粒上，形成穩(wěn)定的Mb-AuNPs結(jié)構(gòu)體；采用滴涂法將Mb-AuNPs結(jié)構(gòu)體修飾于裸金電極表面。再借助Mb結(jié)構(gòu)中的—COOH與FAD牢固結(jié)合（圖1B），將FAD引入Mb-AuNPs結(jié)構(gòu)體上，提高對(duì)葡萄糖的識(shí)別能力。最后，利用巰基試劑中的—SH和Au形成穩(wěn)定的Au—S鍵，形成由自組裝單層膜緊密包裹的有序體系，該體系比純物理吸附體系更加穩(wěn)定。制備了一種價(jià)格低廉、制備簡(jiǎn)單、靈敏度高、易于操作的新型核酸適配體生物傳感器。

圖1 生物傳感器制備機(jī)理圖（A）、Mb與FAD結(jié)合機(jī)制圖（B）Fig. 1 Mechanism of biosensor preparation (A), and Mb-FAD binding mechanism (B)

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

毛桃 市購。

甲基彎菌OB3b、NMS培養(yǎng)基俄羅斯科學(xué)院催化研究所；Diaion HP-20大孔樹脂 日本三菱化工公司；無水乙醇（≥99.7%） 天津富宇精細(xì)化工有限公司；氯金酸 國藥集團(tuán)上海試劑公司；葡萄糖、黃素腺嘌呤二核苷酸二鈉鹽（≥97%）、-巰基乙胺、硫酸、過氧化氫（30%）、鐵氰化鉀、亞鐵氰化鉀、氯化鉀（均為分析純） 天津市天力化學(xué)試劑有限公司；配制溶液的水均為去離子水，實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水。

1.2 儀器與設(shè)備

CHI630電化學(xué)工作站、金電極（=3 mm）、鉑絲電極、Ag/AgCl電極 上海辰華儀器公司；UV-2550紫外-可見分光光度計(jì) 日本島津公司；F-7000型傅里葉紅外吸收光譜儀 日本日立公司；JEM-2100F場(chǎng)發(fā)射高分辨透射電鏡 日本JEOL公司。

1.3 方法

1.3.1 FAD核酸適配體生物傳感器的制備

1.3.2 FAD核酸適配體生物傳感器表征

將制備好的FAD核酸適配體生物傳感器置于6 mL葡萄糖溶液（1 mmol/L葡萄糖溶液與pH 7.2～7.4的0.1 mol/L磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffer saline，PBS）1∶2）中進(jìn)行CV法掃描（-0.2～0.6 V），掃描速率為0.05 V/s，然后結(jié)合交流阻抗法及透射電鏡對(duì)FAD核酸適配體生物傳感器進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征。

1.3.3 FAD核酸適配體生物傳感器構(gòu)建條件優(yōu)化

1.3.3.1 Mb與AuNPs物質(zhì)的量比對(duì)響應(yīng)電流的影響

用滴涂法將Mb、AuNPs按1∶1、1∶2、1∶4、2∶1和4∶1物質(zhì)的量比配制，分別滴涂在打磨好的金電極上，冰箱內(nèi)靜置至形成薄膜。取5 mL 5 mmol/L鐵氰化鉀溶液于容器中，先采用CV法（-0.2～0.6 V）掃描激活電極，再將電極置于6 mL葡萄糖溶液中CV法進(jìn)行測(cè)定 。

1.3.3.2 FAD濃度對(duì)響應(yīng)電流的影響

黃素腺嘌呤二核苷酸二核苷酸二鈉鹽按1.6×10、2.0×10、2.4×10、2.8×10、3.2×10mol/L和3.6×10mol/L配制，取2 μL同其他混合溶液分別滴涂在打磨好的金電極上，冰箱內(nèi)靜置至形成薄膜，再取5 mL（5 mmol/L）鐵氰化鉀溶液于底液槽中，采用CV法掃描激活電極，再將電極置于6 mL葡萄糖溶液中進(jìn)行測(cè)定。

1.3.3.3 交聯(lián)劑（-巰基乙胺）濃度對(duì)響應(yīng)電流的影響

用滴涂法將-巰基乙胺試劑按4.0×10、8.0×10、12.0×10、16.0×10、20.0×10mol/L和24.0×10mol/L濃度配制，同其他混合溶液分別滴涂在打磨好的金電極上，冰箱內(nèi)靜置至形成薄膜，再取5 mL鐵氰化鉀溶液于底液槽中，采用CV法掃描激活電極，再將電極置于6 mL葡萄糖溶液中進(jìn)行測(cè)定。

1.3.3.4 構(gòu)建時(shí)間對(duì)響應(yīng)電流的影響

用滴涂法將上述混合溶液分別滴涂在打磨好的金電極上，冰箱內(nèi)分別靜置4、6、8、10、12 h和14 h。取出電極CV法（-0.2～0.6 V）分別在鐵氰化鉀溶液和葡萄糖溶液進(jìn)行掃描測(cè)定。

1.3.4 FAD核酸適配體生物傳感器檢測(cè)葡萄糖性能

1.3.4.1 檢測(cè)溫度對(duì)葡萄糖檢測(cè)響應(yīng)的影響

用滴涂法將3 μL-巰基乙胺、2 μL FAD同Mb、AuNPs混合溶液分別滴涂在打磨好的金電極上，冰箱內(nèi)靜置至形成薄膜。將6 mL葡萄糖溶液放置于15、20、25、30、35 ℃和40 ℃水浴鍋中加熱2～3 min后取出。將電極置于該體系CV法進(jìn)行測(cè)定，考察溫度對(duì)葡萄糖體系檢測(cè)的影響。

1.3.4.2 緩沖溶液pH值對(duì)葡萄糖檢測(cè)響應(yīng)的影響

用滴涂法將3 μL-巰基乙胺、2 μL FAD同Mb、AuNPs混合溶液分別滴涂在打磨好的金電極上，冰箱內(nèi)靜置至形成薄膜。配制pH 6.4、6.8、7.2、7.4、7.8的PBS，與1 mmol/L葡萄糖溶液1∶2混合后用于測(cè)定。將模擬酶電極置于該體系CV法（-0.2～0.6 V）進(jìn)行測(cè)定，考察不同pH值的PBS對(duì)葡萄糖檢測(cè)體系的影響。

1.3.5 模擬葡萄糖氧化酶特性

在最適質(zhì)量濃度、修飾時(shí)間、檢測(cè)溫度下將制備好的核酸適配體生物傳感器，放入5 mL鐵氰化鉀溶液于底液槽中，采用CV法（-0.2～0.6 V）掃描激活電極，再將其置于葡萄糖溶液進(jìn)行CV法測(cè)定。結(jié)合時(shí)間-電流曲線法在恒定的電壓下每隔20 s連續(xù)向0.1 mol/L PBS溶液（pH 7.2）中加入0、10、50、100、200 μmol/L的葡萄糖進(jìn)行表征。

1.3.6 實(shí)際樣品檢測(cè)

樣品（毛桃）的預(yù)處理：毛桃去皮去核，切成小塊裝入榨汁機(jī)中，加入30 mL去離子水，榨成均勻液態(tài)，然后用布氏漏斗過濾2 次，再轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶定容，混勻后用0.45 μm的濾膜過濾1 次，最后轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中待用。加入不同濃度的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液，重復(fù)測(cè)定3 次，考察檢測(cè)體系的加標(biāo)回收率，并評(píng)價(jià)檢測(cè)體系的精確度和重復(fù)性。

1.4 數(shù)據(jù)處理

每組數(shù)據(jù)均重復(fù)3 次，利用Origin 8.0軟件處理數(shù)據(jù)作圖，采用Excel 2016軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 FAD核酸適配體生物傳感器的構(gòu)建機(jī)制

2.1.1 FAD核酸適配體生物傳感器的光譜分析

圖2 AuNPs中加入Mb及FAD的紫外-可見掃描圖譜（A）、AuNPs表面修飾Mb前后以及Mb-AuNPs結(jié)合FAD后的傅里葉變換紅外光譜（B）Fig. 2 UV-visible spectra of AuNPs with Mb and FAD (A), and Fourier transform infrared spectra (B) of AuNPs before and after surface modification with Mb and Mb-AuNPs-FAD

首先在200～800 nm波長范圍內(nèi)對(duì)AuNPs中逐漸加入Mb及FAD過程進(jìn)行紫外-可見分光光度計(jì)檢測(cè)。如圖2A所示，Mb在282、340 nm和394 nm處出現(xiàn)3個(gè)特征峰。檸檬酸鈉法制備的AuNPs溶膠在520 nm左右出現(xiàn)一個(gè)特征峰，此峰為AuNPs粒子的共振吸收峰。向AuNPs中添加Mb，Mb分子中二硫醚S與Au具有強(qiáng)相互作用力，形成穩(wěn)定的Mb-AuNPs結(jié)構(gòu)體。修飾Mb前后AuNPs的特征峰位置未發(fā)生改變，但520 nm處的吸光度降低；同時(shí)282、340 nm和394 nm處的吸光度也顯著下降，證實(shí)Mb已經(jīng)吸附在AuNPs粒子表面。向體系中加入FAD后，放置3～4 min測(cè)定。520 nm處的吸光度繼續(xù)下降，而340、394 nm處的吸光度顯著升高并趨于穩(wěn)定，說明吸附在AuNPs粒子表面的Mb通過—CONH—與FAD結(jié)合；并且FAD可激活Mb部分活性位點(diǎn)。

在500～4 000 cm范圍內(nèi)對(duì)AuNPs、Mb-AuNPs及Mb-AuNPs-FAD分別進(jìn)行紅外光譜檢測(cè)。如圖2B所示，曲線b是檸檬酸鈉法制備的AuNPs溶膠的紅外光譜圖，曲線a是經(jīng)Mb修飾AuNPs的紅外光譜圖在3 430、1 671、1 022 cm和539 cm的振動(dòng)帶，均能證實(shí)Mb分子的存在。3 430 cm帶是由酰胺II的N—H和氫鍵伸縮振動(dòng)引起。1 676 cm振動(dòng)帶是羧基和酰胺基C＝O伸縮振動(dòng)的結(jié)果。1 022 cm和539 cm處的譜帶是通過C—S和S—S伸縮振動(dòng)產(chǎn)生，C—N拉伸振動(dòng)引起1 385 cm周圍的振動(dòng)譜帶發(fā)生變化。Mb與AuNPs結(jié)合后，位于539 cm處的S—S伸縮振動(dòng)和1 676 cm處酰胺I帶峰減弱。表明Mb內(nèi)的二硫醚與Au存在較強(qiáng)的相互作用，通過形成Au—S鍵與AuNPs粒子結(jié)合。曲線c是向Mb修飾的AuNPs中加入FAD的紅外光譜圖，隨著FAD的加入，在1 700～1 640 cm的范圍內(nèi)顯示C＝O基團(tuán)的伸縮振動(dòng)帶。在3 475～3 150 cm范圍內(nèi)觀察到N—H的伸縮振動(dòng)。在3 100 cm和1 290 cm左右的地方出現(xiàn)酰胺基（—CONH—）的特征吸收峰。該結(jié)果與圖3紫外光譜結(jié)果一致，可清晰地表明FAD結(jié)構(gòu)中的—NH已成功地與Mb中的—COOH形成穩(wěn)定的酰胺鍵，并結(jié)合到納米粒子的表面上，使得其表面電子轉(zhuǎn)移速率增強(qiáng)。

2.1.2 FAD核酸適配體生物傳感器的透射電鏡分析

圖3 AuNPs（A）、Mb-AuNPs（B）和Mb-AuNPs-FAD（C）的透射電鏡Fig. 3 Transmission electron microscopic images of AuNPs (A),Mb-AuNPs (B) and Mb-AuNPs-FAD (C)

透射電鏡下觀察，AuNPs顆粒（圖3A）粒子分散性較好，呈圓球形，形態(tài)分布均一。當(dāng)AuNPs與Mb結(jié)合形成Mb-AuNPs結(jié)構(gòu)體后（圖3B），Mb阻止了AuNPs顆粒之間的團(tuán)聚，改善了顆粒的分散性，但顆粒之間的間距均勻性欠佳。當(dāng)FAD通過與Mb結(jié)構(gòu)中的—COOH與Mb緊密結(jié)合（圖3C），AuNPs顆粒的分散性進(jìn)一步增強(qiáng)可使其催化活性增加，且顆粒分布的均勻性得到顯著改善。

2.1.3 FAD核酸適配體生物傳感器的電化學(xué)分析

圖4 不同生物傳感器在電解液體系的交流阻抗圖（A）及在葡萄糖體系的循環(huán)伏安圖（B）Fig. 4 AC impedance plot of different biosensors in the electrolyte system (A) and cyclic voltammogram in the glucose-sugar system (B)

交流阻抗譜法可以更加深入地研究電極電阻的變化，阻抗圖中圓弧半徑越大表明電極表面阻抗值增大。電極的阻抗值隨著每一種物質(zhì)的加入而增大，表明材料已經(jīng)成功的修飾在電極上。由于裸金電極不與電解液發(fā)生氧化還原反應(yīng)，如圖4A曲線d所示，交流阻抗曲線幾乎為一條直線。帶有負(fù)電的AuNPs粒子與不帶電的裸金電極接觸形成Au—Au鍵，通過靜電吸附力AuNPs被吸引、貼附在裸金電極表面。如圖4A曲線a電極表面電流阻抗值也隨之發(fā)生變化，說明其異向電子阻礙作用較小。修飾在電極表面的AuNPs可以催化體系中的葡萄糖發(fā)生氧化反應(yīng)，因而產(chǎn)生一對(duì)較強(qiáng)的氧化還原峰如圖4B曲線b（=0.307 4 V，=4.02 μA；=0.222 0 V，=-2.124 μA）。

將Mb滴加在金電極表面，AuNPs表面的空隙進(jìn)一步減少，F(xiàn)e(CN)轉(zhuǎn)移到電極表面受到的阻力增大。如圖4A曲線b表明電極表面阻抗值增大，說明Mb已經(jīng)緊密吸附在AuNPs粒子表面。由于Mb不具有氧化酶（催化）活性，單獨(dú)修飾在金電極表面，電極上無氧化還原物質(zhì)產(chǎn)生，如圖4B曲線d表示Mb在反應(yīng)體系中不發(fā)生氧化還原反應(yīng)。將Mb與AuNPs混合修飾在金電極表面，固定在AuNPs顆粒上的Mb會(huì)降低納米粒子傳輸電子及催化葡萄糖氧化的能力，如圖4B曲線c氧化還原峰電流稍微降低（=2.251 μA；=-1.821 μA）。FAD通過結(jié)構(gòu)中的—NH與Mb中的—COOH形成穩(wěn)定的酰胺鍵，修飾在金電極表面，如圖4A曲線c阻抗值明顯增大證明該體系不斷形成更加致密的自主裝膜，使電極表面與電解液的電子傳輸阻礙加劇。由于FAD可以在溶液和電極表面?zhèn)鬏旊娮樱M(jìn)一步催化葡萄糖反應(yīng)；如圖4B曲線a氧化還原峰電流都明顯的增加（=0.307 V，=5.621 μA；=0.246 V，=-1.885 μA）；該核酸適配體生物傳感器的葡萄糖氧化酶活性顯著提高，證實(shí)FAD可加速體系中葡萄糖氧化。

2.2 FAD核酸適配體生物傳感器的優(yōu)化

2.2.1 Mb-AuNPs物質(zhì)的量比對(duì)響應(yīng)電流的影響

圖5 Mb-AuNPs物質(zhì)的量比與響應(yīng)電流的關(guān)系Fig. 5 Relationship between molar ratio of Mb to AuNPs and response current

Mb-AuNPs物質(zhì)的量比決定模擬葡萄糖氧化酶催化活性及核酸適配體生物傳感器穩(wěn)定性好壞。如圖5所示，當(dāng)Mb-AuNPs物質(zhì)的量比為1∶2、2∶3和1∶4時(shí)，氧化峰的響應(yīng)電流值降低?？赡苁谴罅康腁uNPs易發(fā)生粒子團(tuán)聚現(xiàn)象阻礙電流傳遞，導(dǎo)致生物傳感器催化性能降低，當(dāng)Mb-AuNPs物質(zhì)的量比為4∶1時(shí)，由于AuNPs表面被大量的Mb緊密包圍，AuNPs粒子的催化活性位點(diǎn)減少，并且Mb本身不具備傳遞電子的作用，導(dǎo)致FAD核酸適配體生物傳感器模擬酶葡萄糖氧化酶的活性降低，氧化還原峰的響應(yīng)電流值到達(dá)最低。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇1∶1為Mb、AuNPs的最佳物質(zhì)的量比。

2.2.2 FAD濃度對(duì)響應(yīng)電流的影響

圖6 FAD濃度與響應(yīng)電流的關(guān)系Fig. 6 Relationship between response current and FAD concentration

FAD在核酸適配體生物傳感器催化葡萄糖反應(yīng)過程充當(dāng)氧化還原的電子載體，主要起到傳遞氫的作用。本實(shí)驗(yàn)考察1.6×10～3.6×10mol/L FAD構(gòu)建的FAD核酸適配體生物傳感器，并在1 mmol/L的葡萄糖溶液中檢測(cè)響應(yīng)電流。如圖6所示，當(dāng)FAD濃度在1.6×10～3.6×10mol/L時(shí)，氧化峰電流值持續(xù)上升，適量的FAD可以增強(qiáng)其對(duì)葡萄糖的捕獲活性，提高選擇性，使生物傳感器響應(yīng)時(shí)間縮短，靈敏度提高。FAD濃度過高其Mb結(jié)合位點(diǎn)接近飽和，造成浪費(fèi)；同時(shí)在2.4×10～3.6×10mol/L范圍內(nèi)，體系反應(yīng)速率變緩，基本已經(jīng)達(dá)到最優(yōu)的反應(yīng)效果。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇2.4×10mol/L為FAD的最佳濃度。

2.2.3-巰基乙胺濃度對(duì)響應(yīng)電流的影響

圖7 交聯(lián)劑濃度與響應(yīng)電流的關(guān)系Fig. 7 Relationship between concentration of cross-linker and response current

以交聯(lián)劑-巰基乙胺作為Mb-AuNPs結(jié)構(gòu)體負(fù)載在金電極上的黏結(jié)劑，它起到防止Mb-AuNPs結(jié)構(gòu)體泄露的作用。本實(shí)驗(yàn)考察0.004～0.024 mol/L的-巰基乙胺構(gòu)建的核酸適配體生物傳感器，并在1 mmol/L葡萄糖溶液中檢測(cè)響應(yīng)電流。如圖7所示，-巰基乙胺濃度在0.004～0.012 mol/L時(shí)，氧化峰響應(yīng)電流值逐漸升高。適量的-巰基乙胺可以有效調(diào)整Mb-AuNPs結(jié)構(gòu)體在裸金電極表面的空間分布，使得Mb-AuNPs結(jié)構(gòu)體擁有更好的分布密度和取向。當(dāng)-巰基乙胺濃度在0.012～0.024 mol/L時(shí)，氧化峰響應(yīng)電流值緩慢降低。-巰基乙胺本身不導(dǎo)電，過量的巰基乙胺會(huì)影響金電極的導(dǎo)電性，進(jìn)而影響Mb-AuNPs-FAD結(jié)構(gòu)體在電極表面表達(dá)生物活性，導(dǎo)致核酸適配體生物傳感器催化性能降低，因此，本實(shí)驗(yàn)選擇0.012 mol/L-巰基乙胺為交聯(lián)劑濃度。

2.2.4 構(gòu)建時(shí)間對(duì)響應(yīng)電流的影響

圖8 生物傳感器構(gòu)建時(shí)間與響應(yīng)電流的關(guān)系Fig. 8 Relationship between biosensor construction time and response current

影響生物傳感器催化性能的關(guān)鍵因素是構(gòu)建時(shí)間。本實(shí)驗(yàn)考察0～14 h，核酸適配體生物傳感器在電解液及葡萄糖體系中響應(yīng)電流的變化情況。如圖8所示，在電解液體系中構(gòu)建時(shí)間在4～8 h氧化峰電流值呈下降趨勢(shì)，8～14 h氧化峰電流值緩慢下降。構(gòu)建時(shí)間為8 h時(shí)，氧化峰電流達(dá)到最低值。在葡萄糖體系中構(gòu)建時(shí)間在4～8 h氧化峰電流值成上升趨勢(shì)，8～14 h氧化峰電流值緩慢上升。構(gòu)建時(shí)間為8 h時(shí)，氧化峰電流達(dá)到最高值。結(jié)果表明：構(gòu)建時(shí)間過短時(shí)，交聯(lián)劑和Mb-AuNPs-FAD結(jié)構(gòu)體形成的薄膜未能與電極表面緊密貼合，催化葡萄糖反應(yīng)過程中易脫落。構(gòu)建時(shí)間過長時(shí)，AuNPs和Mb在空氣中長時(shí)間暴露易被氧化導(dǎo)致Mb-AuNPs結(jié)構(gòu)體生物活性降低。當(dāng)構(gòu)建時(shí)間為8 h時(shí)，檢測(cè)體系反應(yīng)效果基本達(dá)到最優(yōu)，因此本實(shí)驗(yàn)選擇8 h為FAD核酸適配體生物傳感器最優(yōu)的構(gòu)建時(shí)間。

2.3 檢測(cè)參數(shù)對(duì)核酸適配體生物傳感器性能的影響

圖9 檢測(cè)溫度（A）、緩沖溶液pH值（B）與響應(yīng)電流的關(guān)系Fig. 9 Relationship between detection temperature (A), buffer solution pH (B) and response current

如圖9A所示，考察15～40 ℃不同溫度與氧化峰響應(yīng)電流的關(guān)系。溫度由15 ℃上升至25 ℃時(shí)，F(xiàn)AD核酸適配體生物傳感器催化葡萄糖反應(yīng)的速率加快，該溫度段氧化峰響應(yīng)電流升高，在25 ℃時(shí)，響應(yīng)電流值達(dá)到最高值。表明在15～25 ℃范圍內(nèi)，F(xiàn)AD核酸適配體生物傳感器模擬葡萄糖氧化酶活性具有較好的催化效果。溫度由25 ℃繼續(xù)升高至40 ℃，氧化峰響應(yīng)電流逐漸降低，推測(cè)可能持續(xù)的高溫導(dǎo)致Mb活性降低從AuNPs表面脫落，從而使FAD結(jié)合量減少，導(dǎo)致核酸適配體生物傳感器對(duì)葡萄糖的捕獲活性活性降低?？紤]到核酸適配體生物傳感器其實(shí)用性，反應(yīng)溫度過高不利于對(duì)實(shí)際樣品檢測(cè)，同時(shí)在20～25 ℃范圍內(nèi)，體系反應(yīng)速率變緩，基本已經(jīng)達(dá)到最優(yōu)的反應(yīng)效果，本實(shí)驗(yàn)選擇25 ℃為最佳檢測(cè)溫度。

為了優(yōu)化核酸適配體生物傳感器的催化性能，對(duì)檢測(cè)體系的pH值進(jìn)行了優(yōu)化，分別為pH 6.4、6.8、7.2、7.4和7.8。如圖9B所示，pH 6.4～6.8時(shí)，AuNPs在酸性條件下粒徑變大催化活性降低，間接影響核酸適配體生物傳感器的檢出限、靈敏度等。pH 7.4～7.8時(shí)，氧化峰電流迅速下降，推測(cè)在堿性條件下，Mb易失活從電極表面脫落，導(dǎo)致FAD結(jié)合量減少，F(xiàn)AD核酸適配體生物傳感器的模擬葡萄糖氧化酶的活性降低。當(dāng)pH 7.2時(shí)，氧化峰電流值達(dá)到最高，F(xiàn)AD核酸適配體生物傳感器對(duì)葡萄糖的檢測(cè)效果最佳，更符合實(shí)驗(yàn)所需pH值條件。

2.4 模擬葡萄糖氧化酶特性

2.4.1 循環(huán)伏安法分析

圖10 FAD核酸適配體生物傳感器在葡萄糖溶液體系中的循環(huán)伏安圖Fig. 10 Cyclic voltammogram of FAD aptamer-based biosensor in glucose solution

在優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件下，向5 mL 0.1 mol/L PBS中加入不同濃度葡萄糖，CV法進(jìn)行測(cè)定。循環(huán)伏安曲線隨著不同濃度葡萄糖溶液的加入出現(xiàn)顯著變化，如圖10所示，氧化峰電流由1.926 μA增加到5.662 μA，氧化峰電位由0.289 V增加到0.298 V。還原峰電流由-1.592 μA增加到-4.866 μA，還原峰電位由0.244 V增加到0.266 V。結(jié)果表明，F(xiàn)AD核酸適配體生物傳感器在葡萄糖體系中對(duì)葡萄糖有明顯的響應(yīng)信號(hào)。在10～200 μmol/L時(shí)葡萄糖濃度與氧化峰電流之間呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

2.4.2 時(shí)間電流法分析

圖11 FAD核酸適配體生物傳感器對(duì)葡萄糖的時(shí)間電流響應(yīng)（0.1 mol/L PBS，pH 7.2）Fig. 11 Time-current response of FAD aptamer-based biosensor to glucose (in 0.1 mol/L PBS at pH 7.2)

在優(yōu)化體系條件下，每隔20 s連續(xù)向0.1 mol/L PBS溶液（pH 7.2）中加入0、10、50、100、200 μmol/L的葡萄糖，采用時(shí)間電流法進(jìn)行測(cè)定?？疾霧AD核酸適配體生物傳感器對(duì)葡萄糖的電流響應(yīng)，結(jié)果如圖11所示，該傳感器還原峰值隨著葡萄糖濃度的增加逐漸遞增。葡萄糖在10～200 μmol/L濃度范圍內(nèi)與該核酸適配體生物傳感器的響應(yīng)電流呈良好的線性關(guān)系=0.485 8+0.015 29，相關(guān)系數(shù)=0.997 91，檢出限為4.22×10mol/L，與圖10循環(huán)伏安法結(jié)果一致。與之前的AuNPs催化葡萄糖檢測(cè)方法相比具有顯著優(yōu)勢(shì)。

2.5 穩(wěn)定性、重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

使用同一根FAD核酸適配體生物傳感器測(cè)定葡萄糖樣品溶液，重復(fù)測(cè)定5 d。如圖12所示，平均峰電流為4.027 μA，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.45%，表明該核酸適配體生物傳感器的重復(fù)性良好。再將制備好的電極在冰箱中放置7 d，然后進(jìn)行檢測(cè)。氧化峰電流為3.447 μA，與第5天的酶電極峰電流相比無顯著差異（＞0.05），表明該核酸適配體生物傳感器的穩(wěn)定性良好，使用壽命長，可以進(jìn)行實(shí)際應(yīng)用。

圖12 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig. 12 Results of repeatability test

2.6 實(shí)際樣品檢測(cè)結(jié)果

表1 毛桃樣品中不同濃度葡萄糖含量的回收率Table 1 Recoveries of different concentrations of glucose in spiked actual samples

對(duì)4 只試管內(nèi)葡萄糖含量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如表1所示。FAD核酸適配體生物傳感器在其所允許的誤差范圍內(nèi)，對(duì)毛桃中葡萄糖含量的加標(biāo)回收率均在94%～101%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在1.75%～2.25%之間。表明該核酸適配體生物傳感器檢測(cè)體系準(zhǔn)確可靠，具有良好的精確度和重復(fù)性。

3 結(jié) 論

利用AuNPs顆粒較強(qiáng)的吸附能力，將Mb包裹于納米顆粒上，形成穩(wěn)定的Mb-AuNPs結(jié)構(gòu)體。采用滴涂法將Mb-AuNPs結(jié)構(gòu)體修飾于裸金電極表面，借助Mb結(jié)構(gòu)中的—COOH與FAD牢固結(jié)合，再將FAD引入Mb-AuNPs結(jié)構(gòu)體上，提高對(duì)葡萄糖的識(shí)別能力，從而構(gòu)建具備葡萄糖氧化酶活性的新型核酸適配體生物傳感器。通過循環(huán)伏安法及時(shí)間-電流曲線法探討了其應(yīng)用于葡萄糖檢測(cè)的可行性。研究結(jié)果顯示，核酸適配體生物傳感器最佳構(gòu)建時(shí)間為8 h，Mb與AuNPs最佳物質(zhì)的量比為1∶1，F(xiàn)AD最佳濃度為2.4×10mol/L，巰基試劑濃度為0.012 mol/L。在25.0 ℃、pH 7.2時(shí)，葡萄糖濃度在10～200 μmol/L與該核酸適配體生物傳感器的響應(yīng)電流呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系為0.997 91。新型核酸適配體生物傳感器檢出限為4.22×10mol/L，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.45%，具有制備簡(jiǎn)單，檢測(cè)效果靈敏，使用壽命長，穩(wěn)定性良好等特點(diǎn)。本研究將為今后核酸適配體生物傳感器在食品檢測(cè)中的應(yīng)用提供參考。